像许多生物标本一样，念珠菌生物膜在原生状态下严重半透明，不透明。在这些协议中，我们表明，利用澄清方法，可以通过光学分切显微镜对固定完整生物膜的内部结构进行成像。通过简单、廉价且相对快速的处理步骤，通过共生扫描荧光显微镜，固定完好的生物膜可对 3D 成像进行透明处理。
今天演示这个程序的将是凯蒂·拉格里，一个博士后研究员在这里，和我。要开始在12井板中生长生物膜，请根据文本协议中所述准备板。将板放在 60 RPM 轨道混合器上，在加湿的 37 摄氏度空气培养箱中放置 90 分钟，以便有时间进行细胞粘附。
90分钟后，取出中和未连接的细胞，用无菌介质或PBS清洗。将接种的底片转移到另一个包含预热丝管介质的多井板中。将板返回37摄氏度加湿环境空气培养箱，通过60 RPM轨道混合进行燃烧，将生物膜生长长达48小时。
从培养箱中取出48小时板，从每个标本中取出培养培养剂。用PBS代替该介质，孵育几分钟，稀释血清蛋白。取出 PBS 后，用固定性重新填充孔。
应向每道菜添加足够的固定体积，以浸入所有生物膜生长，包括任何在菜内侧。将带盖的盘放在慢轨道搅拌器上 20 分钟。在去除文本协议中描述的固定剂后，通过排出 PBS 和快速用含有 PBS 和必要污渍的溶液重新填充孔来准备染色。
不要让生物膜排出或干燥超过几秒钟。将污渍加入菜中。所需的污渍量取决于生物膜质量。
然后将覆盖的盘放在慢轨道搅拌器上过夜，然后用铝箔或一张黑纸防止光线。使用钳子，将固定染色生物膜从 PBS 转移到 5 毫升 50/50 PBS-甲醇，在 20 毫升玻璃瓶中，生物膜朝上。以一分钟间隔手动与轨道运动混合五分钟。
将溶剂取出到废瓶中，小心避免移液器与生物膜或生物膜和小瓶之间的接触。轻轻补充三毫升整洁的甲醇。以一分钟间隔手动与轨道运动混合三分钟。
现在将溶剂取出到废瓶中，并立即补充五毫升甲醇。在手动混合轨道运动后，每隔一分钟5至10分钟，将溶剂取出到废瓶中。立即补充三毫升甲醇。
生物膜在这一点上往往比最初看起来更不透明。将溶剂取出到废瓶中，并立即用5毫升50/50甲醇-甲基水杨酸盐重新填充小瓶。以每隔一分钟与轨道运动混合5至10分钟。
生物膜应是半透明的这种混合溶剂。将溶剂取出到废瓶后，用三毫升整洁的甲基水杨酸盐轻轻重新填充小瓶。以一分钟间隔手动与轨道运动混合三分钟。
使用5毫升整洁的甲基水杨酸盐再次重复此过程，每隔一分钟手动混合5至10分钟。此时，生物膜应该是透明的。将溶剂取出到废瓶中，并立即用三毫升整洁的甲基水杨酸盐重新填充小瓶。
加工的生物膜在该溶剂中保持稳定。如果使用倒置显微镜，请使用具有盖玻璃底部的防溶剂盘，并准备用于支持倒置试样的配型器。在这里，垫片是13毫米硅胶环，预先浸泡在甲基水杨酸盐一个小时，以尽量减少因肿胀引起的焦点漂移。
对于医用级硅胶方块上的生物膜，反转方块，并放在盘中甲基水杨酸盐池中的垫片上。确保避免试样下方有任何气泡。将盘子牢固地安装在显微镜的舞台上，使油浸入与目标接触。
调整盘中甲基水杨酸盐的量，使半月板通过表面张力将试样牢牢地固定在空间上。将甲基水杨酸盐液滴放在倒置方形基体的顶部，以减少从哑光表面散射的光。然后用玻璃板盖住盘子以限制蒸发。
在成像前等待几分钟，让试样安放在空间上。现在，执行共和显微镜成像试样，如文本协议中所述。要处理图像，请打开 ImageJ 或斐济。
检查以确保程序有足够的内存来处理数据。处理 2 GB 数据集至少需要 8 GB 的专用 RAM，操作顺利。打开要处理的串行平面图像文件。
如果计算机没有足够的 RAM 来处理整个堆栈，则可能会处理子堆栈，然后重新组装到单个堆栈中。将数据转换为 32 位格式，以便使用图像菜单、类型、32 位启用浮点算术运算。这将使文件大小加倍。
减去平滑背景以增加对焦要素的对比度。通过导航到处理菜单，减去背景来处理整个堆栈。如有必要，调整滚球半径。
球半径应明显大于要保留的对焦要素的最大尺寸。要将所有负像素设置为零，请将每个图像添加到其绝对值。首先，使用图像菜单复制堆栈，重复堆栈。使用复制堆栈。
然后使用过程菜单、数学和绝对值来计算重复数据的绝对值。通过导航到进程菜单、图像计算器、添加来添加两个堆栈。要轴向地重新拼接图像堆栈，请使用图像菜单、堆栈、重新拼接。
然后选择输出间距 1.0，从顶部开始，避免插值。焦点轴现在是堆栈中的垂直轴。重新切片堆栈的 Y 维等于焦点平面的数量。
若要对部分或所有堆栈进行侧视图投影，请导航到图像菜单、堆栈、Z 项目。设置"开始切片"和"停止切片"以包括部分或全部侧视图平面。选择最大强度以获得最佳效果。
通过导航到图像菜单、缩放来校正侧视图投影的轴向缩放。必须使用轴向比例因子校正不相等的图像平面像素化和焦点增量投影。将 X 刻度设置为 1，将 Y 刻度设置为轴向刻度因子。
选择双立方插值。选择创建新窗口。调整亮度和对比度。
然后转换为八位格式进行显示。或者，应用颜色查找表并保存为 RGB 或八位颜色。使用连续的可调误溶剂增加折射率，可以快速估计最大清晰度。
这是通过常规相位对比度显微镜精炼，以找到最小对比度点。一种生物膜在二甲苯和一组窄的参考液体之间连续交换。每次交换后，通过盖板重新定位和查看同一字段。
随着指数的增加，当n等于细胞壁的1.530时，首先看到对比度反转，然后当n等于1.535时，对比反转。此处显示了突变和野生类型C.albicans生物膜的深度成像。野生型生物膜的厚度长到502微米，如538平面共和图像堆栈的侧视图投影所示。
从顶点到基的轴向投影显示了细胞类型和生物膜不同层的变化。此示例显示特征野生类型结构。突变生物膜的厚度长到500微米，如556平面图像堆栈的侧视图投影所示。
众所周知，在没有诱导压力源的情况下，这种突变体会经历丝丝生长，从而产生了截然不同的结构。如侧视图和轴向投影中，许多分支细胞都产生径向生长。这是一种高折射率深度成像协议。
理想情况下，试样的折射率和浸入油的折射率应匹配。这就是为什么在这种情况下，我们使用油浸目标。我们的主要研究是使用细胞壁标记物对生物膜进行结构成像，但与固定标本一起使用的任何荧光方法都应起作用，包括免疫荧光、荧光原位杂交和记者基因表达。
这种特殊的有机体，念珠菌，是健康人类的共物体，但也是一种机会性病原体，可导致粘膜或全身酵母感染。在某些机构，需要 BSL II 遏制方法和协议。此外，甲醛和谷胱甘肽固定物质具有挥发性且危险性。
它们是已知的致癌物质。在烟罩中稀释固定物。将含有稀释固定物的餐具覆盖，不要将含有这些固定物的容器放入生物安全柜或细胞培养箱中。
