Candida Albicans биопленки, как и многие биологические образцы сильно полупрозрачный непрозрачным в их родном государстве. В этих протоколах мы показываем, что с помощью методов уточнения внутренняя структура фиксированных нетронутых биопленок может быть изображена оптической секциональной микроскопией. С простыми, недорогими и относительно быстрыми шагами обработки, фиксированные нетронутые биопленки могут быть прозрачны для 3D-изображения путем конфокального сканирования микроскопии флуоресценции.
Демонстрация этой процедуры сегодня будет Кэти Лагри, пост-докторской исследователь здесь, и я. Чтобы начать рост биопленки в пластине из 12 колодец, подготовь тарелку, как описано в текстовом протоколе. Поместите пластину на орбитальный смеситель 60 об/мин в увлажненные 37 градусов по Цельсию воздушный инкубатор в течение 90 минут, чтобы дать время для клеточной адгезии.
Через 90 минут удалите средние и незакрепленные клетки и промойте стерильной средой или PBS. Перенесите привитую субстрату в другую многоясокую пластину, содержащую предварительно разогретую нить среды. Вернуть пластину до 37 градусов по Цельсию увлажненной окружающей воздушной инкубатор и расти биопленки до 48 часов с 60 об / мин орбитального смешивания для аэрации.
Извлеки 48-часовую пластину из инкубатора и удалите культурную среду из каждого образца. Замените среду PBS и инкубировать в течение нескольких минут, чтобы разбавить от белков сыворотки. После удаления PBS, пополнить скважины с фиксацией.
Достаточный фиксативный объем должен быть добавлен к каждому блюду, чтобы погрузить все биопленки роста, включая любой на внутренней стороне блюда. Установите покрытую тарелку на медленный орбитальный миксер в течение 20 минут. После удаления фиксатора, как описано в текстовом протоколе, подготовиться к окрашивания путем слива PBS и быстро заправки скважин с раствором, содержащим PBS и необходимое пятно.
Не позволяйте биопленки стечь или высохнуть в течение более нескольких секунд. Добавить пятно в блюдо. Необходимое количество пятен зависит от массы биопленки.
Затем установите покрытую тарелку на медленный орбитальный миксер на ночь и защитите от света фольгой или куском черной бумаги. Используя пинцет, перенесите фиксированную окрашенную биопленку с PBS на пять миллилитров 50/50 PBS-метанола в 20 миллилитровом стеклянном флаконе с биопленкой лицом вверх. Вручную смешивайте с орбитальным движением с интервалом в одну минуту в течение пяти минут.
Удалите растворитель в бутылку отходов, будучи осторожным, чтобы избежать контакта между пипеткой и биопленкой или биопленкой и флаконом. Аккуратно заполните тремя миллилитров аккуратного метанола. Вручную смешать с орбитальным движением с интервалом в одну минуту в течение трех минут.
Теперь удалите растворитель в бутылку отходов и сразу же пополнить с пятью миллилитров метанола. После ручного смешивания с орбитальным движением с интервалом в одну минуту в течение пяти-десяти минут, удалите растворитель в бутылку отходов. Немедленно пополнить с тремя миллилитров метанола.
Биопленки часто выглядят более непрозрачными на данный момент, чем их первоначальный внешний вид. Удалите растворитель в бутылку отходов и немедленно пополнить флакон с пятью миллилитров 50/50 метанол-метил салицилат. Вручную смешивайте с орбитальным движением с интервалом в одну минуту в течение пяти-десяти минут.
Биопленка должна быть полупрозрачной в этом смешанном растворители. После удаления растворителя в бутылку отходов, аккуратно пополнить флакон с тремя миллилитров аккуратный метил салицилат. Вручную смешать с орбитальным движением с интервалом в одну минуту в течение трех минут.
Повторите процесс снова с пятью миллилитров аккуратный метилсалицилат, вручную смешивания с интервалом в одну минуту в течение пяти до 10 минут. На данный момент биопленка должна быть прозрачной. Удалите растворитель в бутылку отходов и сразу же пополнить флакон с тремя миллилитров аккуратный метилалицилат.
Обработанная биопленка стабильна в этом растворители. При использовании перевернутого микроскопа используйте растворительное блюдо, которое имеет дно из стекловолокна, и подготовьте проемы для поддержки перевернутого образца. Здесь, спейсеры 13 миллиметров силиконовые кольца, которые предварительно пропитанной метил салицилатом в течение одного часа, чтобы свести к минимуму фокус дрейфа из-за отеков.
Для биопленки на силиконовой площади медицинского класса, инвертировать квадрат и установить его на проем в бассейне метилсалицилат в блюдо. Убедитесь в том, чтобы избежать каких-либо пузырьков ниже образца. Намонтировать блюдо твердо на сцене микроскопа и сделать масло погруженный контакт с целью.
Отрегулируйте количество метилсалицилата в блюде так, чтобы мениск крепко удерживает образец на космическом напряжении. Поместите капельку метилсалицилата поверх перевернутого квадратного субстрата, чтобы уменьшить рассеяние света от матовой отделки. Затем накройте блюдо стеклянной тарелкой, чтобы ограничить испарение.
Подождите несколько минут, пока образец осядут на spacers до изображения. Теперь выполните конфоканую микроскопию, чтобы издать образец, описанный в текстовом протоколе. Для обработки изображений откройте ImageJ или Фиджи.
Проверьте, достаточно ли у программы заданной памяти для обработки данных. Обработка двух гигабайт набора данных требует не менее восьми гигабайт выделенной оперативной памяти для бесперебойной работы. Откройте серийный файл изображения плоскости для обработки.
Если компьютер не имеет достаточной оперативной памяти для обработки всего стека, подстаки могут быть обработаны, а затем собраны в один стек. Преобразование данных в 32-битный формат для обеспечения плавающих точечных арифметических операций с использованием меню изображения, типа, 32-битного. Это удвоит размер файла.
Вычесть гладкий фон, чтобы увеличить контрастность функций фокусировки. Обработать весь стек, переориентируемся на процесс меню, вычесть фон. При необходимости отрегулируйте радиус подвижного шара.
Радиус шара должен быть значительно больше, чем самое большое измерение функций фокусировки, которые должны быть сохранены. Чтобы установить все отрицательные пиксели до нуля, добавьте каждое изображение к его абсолютному значению. Во-первых, дублировать стек с помощью меню изображений, дублировать, дублировать стек.
Затем возьмите абсолютное значение дублированных данных, используя меню процесса, математику, абсолютное значение. Добавьте два стека, переехав для обработки меню, калькулятор изображений, добавьте. Чтобы аксиально повторно использовать стек изображений, используйте меню изображений, стеки, reslice.
Затем выберите интервал выходных данных 1.0, начните с верхней части и избегайте интерполяции. Ось фокусировки теперь является вертикальной оси в стеке. Y-размер повторного стека равен количеству плоскостей фокусировки.
Чтобы сделать проекцию бокового просмотра части или всего стека, перейдите в меню изображений, стеки, проект q. Установите стартовый срез и стоп-кусок, чтобы включить некоторые или все плоскости бокового вида. Выберите максимальную интенсивность для получения наилучших результатов.
Исправь осяное масштабирование проекции бокового вида, переориентируясь на меню изображений, масштаб. Проекция должна быть исправлена для неравного пикселизации плоскости изображения и фокусировки с использованием фактора масштаба ося. Установите X-шкалу до одной и установите шкалу Y для фактора аксиальной шкалы.
Выберите бикубическую интерполяцию. Выберите создать новое окно. Отрегулируйте яркость и контрастность.
Затем перейти на восьми-битный формат для отображения. Кроме того, нанесите таблицу цветового осмотра и сохраните RGB или восьмибитный цвет. Используя последовательно ошибочные растворители увеличения рефракционного индекса, можно быстро оценить максимум ясности.
Это уточняется обычной фазовой контрастной микроскопией, чтобы найти точку минимального контраста. Одна биопленка была последовательно обменена между ксиленом и узким набором эталонных жидкостей в этом диапазоне. После каждого обмена одно и то же поле было перемещено и просмотрено через стекло.
С увеличением индекса, разворот контраста впервые наблюдается, когда n равен 1.530 для клеточной стенки, а затем цитоплазма, когда n равен 1.535. Глубокое изображение мутантов и диких биопленок C.albicans показано здесь. Биопленка дикого типа выросла до толщины 502 микрон, как видно из проекции бокового вида стека конфокальных изображений плоскости 538.
Осяные проекции от вершины к основанию показывают изменение типов клеток и различных слоев биопленки. В этом примере показана характерная структура дикого типа. Биопленка мутанта выросла до толщины 500 микрон, как видно на проекции бокового вида стека изображения плоскости 556.
Этот мутант, как известно, претерпевает нитеозный рост в отсутствие вызывающих стрессоров производится резко иной архитектуры. Как видно как в боковом обзоре, так и в осяных проекциях, многие ветвяющиеся клетки дают возможность радиальных нароев. Это протокол глубокого изображения высокого рефракционного индекса.
В идеале рефракционный индекс образца и рефракционный индекс масла погружения должны соответствовать. Поэтому в данном случае мы используем цель погружения в нефть. Большинство наших исследований были структурные изображения биопленок с использованием маркеров клеточной стенки, но любой метод флуоресценции, который используется с фиксированными образцами должны работать в том числе иммунофлуоресценции, флуоресценции на месте гибридизации, и экспрессии гена репортера.
Этот конкретный организм, Candida albicans, является commensal у здоровых людей, но также оппортунистический патоген, который может вызвать слизистые или системные инфекции дрожжей. В некоторых учреждениях требуются методы и протоколы сдерживания BSL II. Кроме того, фиксаторы формальдегида и глутаральдегида являются летучими и опасными.
Они известны канцерогенами. Составляют разбавления фиксаторов в дымовой капот. Храните посуду, содержащую разбавленные фиксаторы, и не поместьте контейнеры, содержащие эти фиксаторы, в шкаф для биобезопасности или в инкубатор культуры клеток.
