I biofilm candida albicans come molti esemplari biologici sono pesantemente traslucidi a opachi nel loro stato nativo. In questi protocolli, mostriamo che utilizzando metodi di chiarificazione, la struttura interna dei biofilm intatti fissi può essere immagine mediante microscopia sezionamento ottico. Con fasi di elaborazione semplici, economiche e relativamente veloci, i biofilm intatti fissi possono essere resi trasparenti per l'imaging 3D mediante microscopia a fluorescenza a scansione confocale.
A dimostrare questa procedura oggi sarà Katie Lagree, una ricercatrice post-dottorato qui, e me. Per iniziare la crescita del biofilm in una piastra da 12 po ', preparare la piastra come descritto nel protocollo di testo. Posizionare la piastra su un miscelatore orbitale da 60 giri/min in un incubatore d'aria umidificato di 37 gradi Celsius per 90 minuti per consentire il tempo per l'adesione cellulare.
Dopo 90 minuti, rimuovere le cellule medie e non attaccate e lavare con mezzo sterile o PBS. Trasferire il substrato inoculato in un'altra piastra multi-pozzo contenente mezzo di filamentazione preri riscaldato. Riportare la piastra all'incubatore di aria ambiente umidificato di 37 gradi Celsius e far crescere i biofilm fino a 48 ore con miscelazione orbitale a 60 giri/min per l'aerazione.
Recuperare la piastra di 48 ore dall'incubatore e rimuovere il mezzo di coltura da ogni campione. Sostituire il mezzo con PBS e incubare per diversi minuti per diluire le proteine del siero. Dopo aver rimosso il PBS, riempire i pozzi con fissante.
A ogni piatto deve essere aggiunto un volume fissivo sufficiente per immergere tutta la crescita del biofilm, compresi quelli sui lati interni del piatto. Impostare il piatto coperto su un miscelatore orbitale lento per 20 minuti. Dopo aver rimosso il fissatore come descritto nel protocollo di testo, prepararsi per la colorazione drenando il PBS e riempiendo rapidamente i pozzi con una soluzione contenente PBS e la macchia richiesta.
Non lasciare che il biofilm si scarichi o si asciughi per più di qualche secondo. Aggiungere la macchia al piatto. La quantità necessaria di macchia dipende dalla massa del biofilm.
Quindi impostare il piatto coperto su un mixer orbitale lento durante la notte e proteggere dalla luce con un foglio o un pezzo di carta nera. Utilizzando una pinzetta, trasferire il biofilm colorato fisso da PBS a cinque millilitri di 50/50 PBS-metanolo in una fiala di vetro da 20 millilitri con il biofilm rivolto verso l'alto. Mescolare manualmente con il movimento orbitale a intervalli di un minuto per cinque minuti.
Rimuovere il solvente in una bottiglia di scarto con cautela per evitare il contatto tra la pipetta e il biofilm o il biofilm e il flaconcino. Riempire delicatamente con tre millilitri di metanolo pulito. Mescolare manualmente con il movimento orbitale a intervalli di un minuto per tre minuti.
Ora rimuovere il solvente in una bottiglia di scarto e riempire immediatamente con cinque millilitri di metanolo. Dopo aver miscelato manualmente con il movimento orbitale a intervalli di un minuto per cinque-10 minuti, rimuovere il solvente nella bottiglia di scarto. Riempire immediatamente con tre millilitri di metanolo.
I biofilm spesso sembrano più opachi a questo punto rispetto al loro aspetto iniziale. Rimuovere il solvente nella bottiglia di scarto e riempire immediatamente la fiala con cinque millilitri di salicilato di 50/50 metanolo-metile. Mescolare manualmente con il movimento orbitale a intervalli di un minuto per cinque-10 minuti.
Il biofilm deve essere semitrasparente in questo solvente misto. Dopo aver rimosso il solvente in una bottiglia di scarto, riempire delicatamente il flaconcino con tre millilitri di salicilato di metile pulito. Mescolare manualmente con il movimento orbitale a intervalli di un minuto per tre minuti.
Ripetere nuovamente il processo con cinque millilitri di salicilato di metile pulito, mescolando manualmente a intervalli di un minuto per cinque-10 minuti. A questo punto, il biofilm dovrebbe essere trasparente. Rimuovere il solvente nella bottiglia di scarto e riempire immediatamente il flaconcino con tre millilitri di salicilato di metile pulito.
Il biofilm lavorato è stabile in questo solvente. Se si utilizza un microscopio invertito, utilizzare un piatto a prova di solvente che abbia un fondo in vetro di copertura e preparare i distanziati per il supporto del campione invertito. Qui, i distanziati sono anelli di silicone da 13 millimetri che sono pre-imbevuti di salicilato di metile per un'ora per ridurre al minimo la deriva di messa a fuoco a causa del gonfiore.
Per un biofilm su un quadrato di silicone di grado medico, invertire il quadrato e impostarlo su un distanziale in una piscina di salicilato di metile nel piatto. Assicurarsi di evitare bolle sotto il campione. Montare saldamente il piatto sul palco del microscopio e far immergere l'olio a contatto con l'obiettivo.
Regolare la quantità di salicilato di metile nel piatto in modo che il menisco trattiene saldamente l'esemplare sul distanziale per tensione superficiale. Posizionare una goccia di salicilato di metile sopra il substrato quadrato invertito per ridurre la dispersione di luce dalla finitura opaca. Quindi coprire il piatto con una piastra di vetro per limitare l'evaporazione.
Attendere alcuni minuti prima che il campione si sistemi sui distanziati prima dell'imaging. Ora, eseguire la microscopia confocale per immagini il campione come descritto nel protocollo di testo. Per elaborare le immagini, aprire ImageJ o Fiji.
Verificare che il programma abbia una memoria assegnata sufficiente per l'elaborazione dei dati. L'elaborazione di un set di dati a due gigabyte richiede almeno otto gigabyte di RAM dedicata per un funzionamento regolare. Aprire il file di immagine del piano seriale da elaborare.
Se il computer non dispone di RAM sufficiente per elaborare l'intero stack, i sottostack possono essere elaborati e quindi riassemblati in un unico stack. Convertire i dati in formato a 32 bit per abilitare le operazioni aritmetiche a virgola mobile utilizzando il menu immagine, il tipo, a 32 bit. Ciò raddoppierà le dimensioni del file.
Sottrarre lo sfondo uniforme per aumentare il contrasto delle feature di messa a fuoco. Elaborare l'intero stack passando al menu di processo, sottrarre lo sfondo. Regolare il raggio della palla di rotolamento, se necessario.
Il raggio della palla deve essere significativamente più grande della dimensione più grande delle feature di messa a fuoco da preservare. Per impostare tutti i pixel negativi su zero, aggiungi ogni immagine al suo valore assoluto. Innanzitutto, duplica lo stack utilizzando il menu immagine, duplica, duplica lo stack.
Quindi prendi il valore assoluto dei dati duplicati usando il menu di processo, la matematica, il valore assoluto. Aggiungere i due stack passando al menu di elaborazione, calcolatrice di immagini, aggiungere. Per reslicere assialmente lo stack di immagini, utilizzare il menu immagine, gli stack, le reslice.
Quindi selezionare la spaziatura di output 1.0, iniziare dall'alto ed evitare l'interpolazione. L'asse di messa a fuoco è ora l'asse verticale nella pila. La dimensione Y dello stack resliced è uguale al numero di piani di messa a fuoco.
Per effettuare una proiezione di visualizzazione laterale di parte o di tutto lo stack, passare al menu immagine, alle pile, al progetto Z. Impostare la sezione iniziale e la sezione di arresto in modo da includere alcuni o tutti i piani di visualizzazione laterale. Selezionare l'intensità massima per ottenere i migliori risultati.
Correggere il ridimensionamento assiale della proiezione della vista laterale passando al menu immagine, scalare. La proiezione deve essere corretta per la pixelazione del piano dell'immagine disuguale e l'incremento dello stato attivo utilizzando il fattore di scala assiale. Impostate la scala X su una e impostate la scala Y sul fattore di scala assiale.
Selezionate l'interpolazione bicubica. Selezionare Crea nuova finestra. Regolare la luminosità e il contrasto.
Quindi convertire in formato a otto bit per la visualizzazione. In alternativa, applicare una tabella di ricerca dei colori e salvarla come colore RGB o a otto bit. Utilizzando solventi miscribili in serie di indice di rifrazione crescente, il massimo della chiarezza può essere rapidamente stimato.
Questo è perfezionato dalla microscopia a contrasto di fase convenzionale per trovare il punto di contrasto minimo. Un biofilm è stato scambiato serialmente tra lo xilene e una serie ristretta di liquidi di riferimento in quell'intervallo. Dopo ogni scambio, lo stesso campo è stato spostato e visualizzato attraverso un coverglass.
Con l'aumento dell'indice, l'inversione di contrasto si vede per la prima volta quando n è uguale a 1,530 per la parete cellulare, seguita dal citoplasma quando n è uguale a 1,535. Qui viene mostrata l'imaging profondo di biofilm mutanti e selvatici di tipo C.albicans. Il biofilm di tipo selvaggio è cresciuto fino a uno spessore di 502 micron come si vede nella proiezione della vista laterale della pila di immagini confocali del piano 538.
Le proiezioni assiali dall'apice alla base mostrano la variazione nei tipi di cellule e nei diversi strati del biofilm. In questo esempio viene illustrata la struttura caratteristica del tipo jolly. Il biofilm mutante è cresciuto fino a raggiungere uno spessore di 500 micron come si vede nella proiezione della vista laterale della pila di immagini piane 556.
Questo mutante noto per subire una crescita filamentosa in assenza di fattori di stress inducenti produsse un'architettura drammaticamente diversa. Come si vede sia nella vista laterale che nelle proiezioni assiali, molte cellule ramificate danno origine a crescita radiale. Questo è un protocollo di imaging profondo ad alto indice di rifrazione.
Idealmente, l'indice di rifrazione del campione e l'indice di rifrazione dell'olio ad immersione dovrebbero corrispondere. Ecco perché in questo caso utilizziamo un obiettivo di immersione petrolifera. La maggior parte dei nostri studi sono stati l'imaging strutturale di biofilm usando marcatori di parete cellulare, ma qualsiasi metodo di fluorescenza utilizzato con campioni fissi dovrebbe funzionare tra cui immunofluorescenza, ibridazione della fluorescenza in situ ed espressione genica reporter.
Questo particolare organismo, Candida albicans, è commensale negli esseri umani sani, ma è anche un agente patogeno opportunistico che può causare infezioni da lievito mucoso o sistemico. In alcune istituzioni sono necessari metodi e protocolli di contenimento BSL II. Inoltre, la formaldeide e i fissatori della glutaraldeide sono volatili e pericolosi.
Sono noti agenti cancerogeni. Fare diluizioni di fissanti in una cappa aspirante. Tenere coperti i piatti contenenti fissanti diluiti e non mettere contenitori contenenti questi fissanti in un armadietto di biosicurezza o in un incubatore di coltura cellulare.
