Bu protokolün genel amacı biyokimyasal olarak tRNA-Isopentenyl Transferaz Aktivitesi In Vitro karakterize etmektir. Bu yöntem, saflaştırılmış rekombinant enzimlerin tRNA-isopentenil transferaz aktivitesinin in-vitro saptanması ve karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı kovalent RNA modifikasyonu algılamak için kullanılan basit ve doğrudan bir teşpolmasıdır.
Bu yöntem tRNA-isopentenil transferaz aktivitesine ışık sağlasa da, geniş aralıktaki biyokimyasal karakterizasyonu veya RNA modifiye enzimleri için potansiyel olarak uyarlanabilir. Bu işlemin ilk adımı iyice jel döküm için kullanılacak cam plakaları temizlemektir. Tabakları sabun ve suyla yıkayın, deiyonize suyla iyice durulayın ve sonra plakaları isopropanol ve tüy bırakmayan mendillerle temizleyin.
Sonra, plakaları ve spacers monte edin. 100 mililitre %20 akrilamid, 7.5 azı dişi üre, 1x TBE jel yapmak için aşağıdaki reaktifleri karıştırın. Üre jel konsantresi 80 mililitre, üre jel diluent 10 mililitre, ve üre jel tampon 10 mililitre.
Karışıma 40 mikrolitre T-med ve 800 mikrolitre taze hazırlanmış %10 amonyum persülfat ekleyin. Jel çözeltisini büyük bir şırıngaya çekin ve kabarcık oluşumunu önlemek için çözeltiyi dağıtırken cam plakaları arasında jel çözeltisini dağıtın. Jel in oda sıcaklığında 30 dakika katılaşmak için izin verin.
Jel katılaşmış sonra, dikey bir jel aparat üzerine jel bitki. Üst ve alt tampon bölmelerini 1x TBE ile doldurun. Jeli yüklemeden iki saat önce, tampon sınırın en küçük oligonükleotidleri çalıştırabilmesi için jeli 20 miliamperde iki saat önceden çalıştırın.
RNA isopentenylation tahlil için her reaksiyon hazırlamak 17 mikrolitre son bir hacim. Her tüp 50 milimolor Tris-HCl, pH 7.2, 1.2 milimolar ATP, 5.8 milimolar magnezyum klorür, 0.2 milimolar DMAPP, 10 adet RNase inhibitörü, 40, 000 CPM dahili 32P etiketli RNA, 5.3 micromolar Mod5 ve 1.2 milimolar 2-mercaptoeolol ekleyin. Reaksiyonları 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.
Bir saat sonra, etanol% 100 etanol 2.5 hacmi ve 3.5 molar sodyum asetat pH 5.5 1/10 hacmi kullanarak RNase çökelti ve negatif 20 derece santigrat bir gecede yerleştirin. Daha sonra, RNA örneklerini 15, 400 g ve 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüj edin. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve her RNA peletini %70 etanol500 mikrolitre ile yıkayın.
Örnekleri 15, 400 g ve 4 santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve RNA peletlerini 15 dakika veya tüm etanol buharlaşana kadar kurutun. Sonraki sekiz molar üre 10 mikrolitre her RNA pelet askıya.
Her numuneye 150 adet RNase T1 ekleyin ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatın. Ertesi gün, her numuneye iki mikrolitre 6x yükleme tamponu ekleyin. Her RNA örneğinin 10 mikrolitresini ön çalışma, %20 poliakrilamid, 7,5 molar üre jeli yükleyin.
Jeli 25 miliamperde iki saat çalıştırın. İki saat sonra elektroforezi durdurun ve jeli cihazdan çıkarın. İki cam plaka arasındaki mührü kırın ve jel her iki plakaüzerinde kalan cam plakalardan birini dikkatlice çıkarın.
Jel üzerine plastik bir sargı bir tabaka yerleştirin ve üç saat boyunca bir fosfor ekran üzerinde maruz. Bu protokol, S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5 tarafından modifiye edilen hem kanonik hem de nonkanonik tRNA kalıntılarının izopentenilasyonunu güvenilir bir şekilde algılar. Bu örnekte tirozin tRNA dahili olarak 32P-adenozin ile etiketlenmiş ve Mod5 DMAPP varlığı veya yokluğunda RNase ile inkübe edilmiştir.
RNA'lar RNase T1 ile sindirildi ve poliakrilamid jeli ile çözüldü. Mod5 DMAPP varlığında öngörülen kalıntı değiştirir ve kaydırılmış 10 nükleotit ile gösterilir, nükleozit pozisyonlarında parça içeren üçlü adenozin 36 için 38 tirozin tRNA parçası içerir. Modifiye adenozin 37 ikamet bir yıldız ile gösterilir.
Benzer şekilde, serine tRNA Mod5 ve DMAPP ile kuluçkaya yatırıldığında, nükleozit pozisyonunda 36 ile 38 arasında parça içeren 10 nükleotit üçlü adenozinin tam bir kayması gözlenmektedir. İlginçtir ki, nükleozit pozisyonlarında 36 ile 38 arasında üçlü adenozin içeren üçlü adenozin içermeyen yedi nükleotit parçasının kısmi kayması gözlenir, bu da nükleozit pozisyonunda 36 ile 38 diziarasında parça içeren üçlü adenozinin ve mod5 in vitro aktivitesi için yapının gerekli olmayabileceğini düşündürmektedir. Bir kez bu teknik ustalanınca düzgün bir şekilde yapılırsa iki, dört ila altı saat gün sürer.
RNA bozulması RNA modifikasyonunu etkileyebileceğinden ve veri yorumlanmasını bozabileceğinden, bu yordamı denemek RNA'nın bütünlüğünü korumak ve izlemek önemlidir. Bu prosedürün ardından ilgi enzimini kullanarak mutasyonel çalışmalar, enzimatik aktivite için gerekli olan belirli kalıntıları veya etki alanlarını belirlemek için yapılabilir. Bu teknik, gelişiminden sonra, prokaryotik ve ökaryotik enzimlerin tRNA-isopentenil transferaz aktivitelerini söylemek için RNA biyolojisi alanında araştırmacılariçin yol açtı.
Bu videoyu izledikten sonra, ilgi enzimisopentenil transferaz aktivitesinin tespiti için protokolü nasıl uygulayacağınızı iyi anlamak gerekir. Radyoaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve uygun PPE takma, yeterli koruma kullanımı ve radyoaktivitenin düzgün bir şekilde atılması gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.
