الهدف العام لهذا البروتوكول هو توصيف كيميائياً رنا-Isopentenyl Transferase النشاط في المختبر. هذه الطريقة مفيدة للكشف في المختبر وتوصيف من trna-isopentenyl transferase النشاط من الانزيمات المؤتلفة النقية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه هو فحص بسيط ومباشر يستخدم للكشف عن تعديل الحمض النووي الريبي التساهمي.
على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة لنشاط نقلات رنا-isopentenyl، فمن المحتمل أن تكون قابلة للتكيف مع التوصيف الكيميائي الحيوي لمجموعة واسعة أو تعديل الحمض النووي الريبي للإنزيمات. الخطوة الأولى في هذا الإجراء هو لتنظيف شامل لوحات الزجاج التي سيتم استخدامها لصب هلام. اغسل الأطباق بالصابون والماء، اشطف جيداً بالماء الأيون، ثم نظف الأطباق باستخدام الأيزوبروبانول ومناديل خالية من الوبرانول.
المقبل، وتجميع لوحات والفواصل. مزيج من الكواشف التالية لجعل 100 ملليلتر 20٪ أكريلاميد, 7.5 اليوريا الضرس, 1x هلام TBE. 80 ملليلتر من تركيز جل اليوريا، 10 ملليلتر من ديل اليوريا، و 10 ملليلترات من عازل هلام اليوريا.
إضافة 40 ميكرولترات من T-ميد و 800 ميكرولتردات من الطازجة 10٪ بيرزلفات الأمونيوم إلى الخليط. رسم حل هلام تصل إلى حقنة كبيرة والاستغناء عن حل هلام بين لوحات الزجاج التنصت على الزجاج في حين الاستغناء عن الحل لمنع تشكيل فقاعة. السماح للجل لترسيخ في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
بعد أن يتوطد الجل، زرع الجل على جهاز هلام عمودي. املأ الغرف العازلة العليا والسفلى بـ 1x TBE. قبل ساعتين من تحميل الجل، تشغيل ما قبل الجل في 20 ملليمبير لمدة ساعتين للسماح للحدود العازلة لتشغيل أصغر oligonucleotides.
إعداد كل رد فعل لم مقايسة RNA isopentenylation في حجم النهائي من 17 ميكرولترات. إضافة إلى كل أنبوب 50 ملليمولور تريس-HCl، pH 7.2, 1.2 1 ميليمولار ATP, 5.8 ميليمولار كلوريد المغنيسيوم, 0.2 DMAPP ميليمولار, 10 وحدات مثبط RNase, 40, 000 CPM داخليًا 32P المسمى RNA, 5.3 micromolar Mod5, و 1.2 millimolar 2-mercaptoethanol. احتضان ردود الفعل في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد ساعة واحدة، الإيثانول يعجل RNase باستخدام 2.5 حجم من 100٪ الإيثانول و 1/10 حجم 3.5 أسيتات الصوديوم الصوديوم الضروس 5.5، ووضعها سالب 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة بين عشية وضحاها. وبعد ذلك، أجهزة الطرد المركزي عينات الجيش الملكي النيبالي في 15، 400 غرام وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة بعناية نازع وغسل كل بيليه الجيش الملكي النيبالي مع 500 ميكرولتر من 70٪ الإيثانول.
جهاز طرد مركزي العينات في 15، 400 غرام وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. إزالة بعناية من فوق الماء والهواء الجافة الكريات رنا لمدة 15 دقيقة أو حتى يتبخر كل الإيثانول. المقبل إعادة تعليق كل بيليه الجيش الملكي النيبالي في 10 ميكرولترات من ثمانية اليوريا الضروس.
إضافة 150 وحدة من RNase T1 إلى كل عينة واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إضافة اثنين microliters من 6x تحميل العازلة لكل عينة. تحميل 10 ميكرولترات من كل عينة RNA على ما قبل تشغيل، 20٪ polyacrylamide، 7.5 هلام اليوريا المول.
تشغيل الجل في 25 مللي امبير لمدة ساعتين. بعد ساعتين، وقف الكهرباء وإزالة هلام من الجهاز. كسر الختم بين لوحة الزجاج اثنين وإزالة بعناية واحدة من لوحات الزجاج مع هلام المتبقية على أي لوحة.
ضع طبقة من البلاستيك التفاف على هلام وفضح على شاشة الفوسفور لمدة ثلاث ساعات. هذا البروتوكول يكشف موثوق isopentenylation من كل من المخلفات رنا الكنسي وغير البركانية التي تم تعديلها من قبل S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5. في هذا المثال تم تسمية tRNA التيروزين داخليًا مع 32P-أدينوسين وتم احتضان Mod5 مع RNase في وجود أو عدم وجود DMAPP.
تم هضم RNAs مع RNase T1 وحل على هلام البولي أكريلاميد denaturing. Mod5 بتعديل البقايا المتوقعة في وجود DMAPP و يشار إليها من قبل النيوكليوتيدات 10 المتغيرة، الأدينوزين الثلاثي التي تحتوي على جزء في مواقع النوكليوسيد 36 من خلال 38 تحتوي على جزء في تيروزين tRNA. يشار إلى الأدينوسين المعدل 37 المقيمين مع النجمة.
وبالمثل عندما يتم احتضان الـ serine tRNA مع Mod5 و DMAPP ، لوحظ تحول كامل من الأدينوسين الثلاثي 10 نوكلييوتيد يحتوي على جزء في موقف النيوكليوسيد 36 إلى 38. ومن المثير للاهتمام، لوحظ تحول جزئي لذرة النيوكليوتيدات السبعة التي لا تحتوي على الأدينوسين الثلاثي المحتوي على جزء في مواقع النيوكليوسيد من 36 إلى 38، مما يشير إلى أن الأدينوزين الثلاثي الذي يحتوي على جزء في موضع النيوكليوسيد 36 من خلال 38 تسلسل وهيكل قد لا يكون مطلوباً لـ Mod5 في النشاط المختبري. مرة واحدة يتقن هذه التقنية سوف يستغرق اثنين، أربعة إلى ستة أيام ساعة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.
حسنا محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر للحفاظ على ورصد سلامة الجيش الملكي النيبالي، لأن تدهور RNA يمكن أن تؤثر على تعديل RNA وسوف يربك تفسير البيانات. بعد هذا الإجراء دراسات الطفرات باستخدام إنزيم الخاص من الفائدة، يمكن القيام به لتحديد المخلفات أو المجالات المحددة المطلوبة للنشاط الأنزيمي. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الحمض النووي الريبي ، ليقولوا أنشطة trna-isopentenyl transferase للإنزيمات البروكارية ونيوكاريوتيك.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ البروتوكول للكشف عن نشاط نقل الإيزوبينتيل من إنزيم اهتمامك. لا تنس أن العمل مع النشاط الإشعاعي يمكن أن يكون خطيرا للغاية وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، واستخدام التدريع الكافي، والتخلص من النشاط الإشعاعي بشكل صحيح أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
