体外检测 tRNA-Isopentenyl 转移酶活性的实验研究

该协议的总体目标是在振动中对tRNA-Isopentenyl转移酶活性进行生化特征。该方法对纯化重组酶的tRNA-isopentenyl转移酶活性的体外检测和表征非常有用。该技术的主要优点是，它是一种简单而直接的检测，用于检测共价RNA修饰。

虽然这种方法为tRNA-isopentenyl转移酶活性提供了见解，但它对于广范围或RNA修改酶的生化特性具有潜在的适应性。本程序的第一步是彻底清洁用于铸造凝胶的玻璃板。用肥皂和水清洗盘子，用去离子水冲洗好，然后用异丙醇和无绒湿巾清洗盘子。

接下来，组装板和空间。混合以下试剂，制造100毫升20%丙烯酰胺、7.5摩尔尿素、1x TBE凝胶。80毫升尿素凝胶浓缩物，10毫升尿素凝胶稀释剂，10毫升尿素凝胶缓冲液。

在混合物中加入40微升T-med和800微升新鲜准备的10%铵。将凝胶溶液拉入大型注射器中，在玻璃板之间分配凝胶溶液，同时分配溶液以防止气泡形成。让凝胶在室温下凝固30分钟。

凝胶凝固后，将凝胶种植到垂直凝胶装置上。用 1x TBE 填充上部和下部缓冲室。在加载凝胶前两小时，以 20 毫安预运行凝胶两小时，使缓冲边界超过最小的寡核苷酸。

在17微升的最终体积中为RNA的开基化测定准备每种反应。添加到每个管50毫莫勒Tris-HCl， pH 7.2， 1.2 毫摩尔 ATP， 5.8 毫摩尔氯化镁， 0.2 毫摩尔 DMAPP， 10 单位 RNase 抑制剂， 40， 0 CPM 内部 32P 标记 RNA， 5.3 微摩尔 Mod5 和 1.2 毫摩尔 2-甲酸酯醇.在37摄氏度下孵育反应一小时。

一小时后，乙醇使用2.5体积的100%乙醇和1/10体积的3.5摩尔醋酸钠pH5.5，将RNase沉淀为负20摄氏度，过夜一小时。接下来，将RNA样品在15，400克和4摄氏度下离心20分钟。小心地去除上一液，用 500 微升 70% 乙醇清洗每个 RNA 颗粒。

将样品在15，400克和4摄氏度下离心5分钟。小心地去除上一液，将RNA颗粒干燥15分钟，或直到所有乙醇蒸发。接下来，将每个RNA颗粒重新悬浮在8个摩尔尿素的10微升中。

在每个样品中加入150个单位的RNase T1，并在37摄氏度下孵育过夜。第二天，向每个样本添加两个 6 倍加载缓冲区的微升。在预运行、20%聚丙烯酰胺、7.5 摩尔尿素凝胶上加载每个RNA样品的10微升。

以 25 毫安运行凝胶两小时。两小时后，停止电泳，将凝胶从仪器上取出。打破两个玻璃板之间的密封件，小心地拆下其中一个玻璃板，将凝胶留在任一板上。

在凝胶上放置一层塑料包裹，在磷屏幕上暴露三个小时。该协议可靠地检测由S.cerevisiae异丙酶Mod5修改的规范和非核tRNA残留物的开模化。在此示例中，酪氨酸 tRNA 内部标有 32P 腺苷，Mod5 在存在与否时用 RNase 孵育。

RNA与RNase T1一起消化，并在变性多丙烯酰胺凝胶上解析。Mod5 在 DMAPP 存在的情况下修改预测的残留物，并指示转移的 10 核苷酸，三重腺苷含有片段在核苷位置 36 到 38 包含酪氨酸 tRNA 中的片段。修改后的腺苷 37 驻留用星号表示。

同样，当用Mod5和DMAPP孵育血清tRNA时，观察到10个核苷酸三重腺苷在核苷位置36至38位置含有片段的完整转移。有趣的是，观察到七核苷酸片段的部分移位，该片段不包含在核苷位置36至38时含有片段的三重腺苷，这表明在核苷位置36到38序列和结构上含有片段的三重腺苷可能不需要体外活动。一旦掌握了这项技术，如果执行得当，每天需要两到四到六个小时。

尝试这个程序是重要的是要记住保持和监测RNA的完整性，因为RNA降解会影响RNA的修改，并混淆数据解释。按照这个程序突变研究使用你感兴趣的酶， 可以做确定特定的残留物或酶活性所需的域.在开发之后，这项技术为RNA生物学领域的研究人员铺平了道路，即原核酶和真核酶的tRNA-isopentenyl转移酶活性。

看完这段视频后，您应该对如何执行检测您感兴趣的酶的 isopentenyl 转移酶活性的协议有一个很好的理解。不要忘记，使用放射性操作可能极其危险，在执行此过程时，应始终采取预防措施，例如穿着适当的 PPE、使用适当的屏蔽以及正确处理放射性。