このプロトコルの全体的な目標は、インビトロでtRNA-イセペネテニルトランスファーゼ活性を生化学的に特徴付ける。この方法は、精製組換え酵素のtRNA-イソペンテニルトランスファーゼ活性のインビトロ検出および特性評価に有用である。この技術の主な利点は、共有結合RNA修飾を検出するために使用されるシンプルで直接的なアッセイである点です。
この方法は、tRNA-イソペンテニルトランスレコーゼ活性に関する洞察を提供しますが、広い範囲またはRNA修飾酵素の生化学的特徴付けに適応可能である可能性があります。この手順の最初のステップは、ゲルの鋳造に使用されるガラスプレートを徹底的に洗浄することです。石鹸と水でプレートを洗い、脱イオン水でよく洗い流し、イソプロパノールと糸くずのない拭き取りでプレートをきれいにします。
次に、プレートとスペーサーを組み立てます。以下の試薬を混合して、100ミリリットル20%アクリルアミド、7.5モル尿素、1x TBEゲルを作ります。80ミリリットルの尿素ゲル濃縮物、10ミリリットルの尿素ゲル希釈剤、及び10ミリリットルの尿素ゲルバッファー。
40マイクロリットルのT-medと800マイクロリットルの新鮮な10%の過硫酸アンモニウムを混合物に加えます。ゲル溶液を大きなシリンジに引き上げ、ガラス板の間でゲル溶液を分配し、溶液を分配して泡の形成を防ぎます。ゲルを室温で30分間固めます。
ゲルが固化した後、ゲルを垂直ゲル装置に植える。上側および下側のバッファーチャンバーに 1x TBE を充填します。ゲルをローディングする2時間前に、ゲルを20ミリアンペアで2時間事前に実行し、バッファー境界が最小のオリゴヌクレオチドを実行できるようにした。
RNAの各反応を17マイクロリットルの最終体積で開きテニル化アッセイを準備します。各チューブに加え、50ミリモラーTris-HCl、pH 7.2、1.2ミリモルATP、5.8ミリモル塩化マグネシウム、0.2ミリモルDMAPP、10単位RNase阻害剤、40、000 CPM内部32P標識RNA、5.3ミクロモルモラーモッズ5、および1.2ミリモル2-メタノールエタノール。37°Cで1時間の反応をインキュベートします。
1時間後、エタノールは2.5容量の100%エタノールと1/10容量の酢酸ナトリウムpH 5.5を使用してRNaseを沈殿させ、一晩で20°Cを負の20度に置きます。次に、RNAサンプルを15、400g's、摂氏4度で20分間遠心分離する。上清を慎重に取り除き、各RNAペレットを500マイクロリットルの70%エタノールで洗浄します。
サンプルを15、400g、摂氏4度で5分間遠心分離します。慎重に上清を取り除き、RNAペレットを15分間、またはすべてのエタノールが蒸発するまで空気乾燥します。次に、各RNAペレットを8個の大臼歯の10マイクロリットルで再懸濁する。
各サンプルにRNase T1の150単位を加え、一晩摂氏37度でインキュベートします。翌日、各サンプルに6倍の負荷バッファを2マイクロリットル加えます。各RNAサンプルの10マイクロリットルをプレラン、20%ポリアクリルアミド、7.5モル尿素ゲルにロードします。
ゲルを25ミランペアで2時間実行します。2時間後、電気泳動を停止し、装置からゲルを取り出します。2枚のガラス板の間にシールを破り、どちらかのプレートに残ったゲルを持つガラス板の1つを慎重に取り除きます。
ゲルの上にラップの層を置き、3時間リンスクリーンに露出します。このプロトコルは、S.cerevisiaeイソペンテニルトランフレーゼMod5によって修飾された正規および非カノニカルtRNA残基のイセキセニル化を確実に検出する。この例ではチロシンtRNAを32P-アデノシンで内部標識し、DMAPPの存在下または不在でRNaseとインキュベートしたMod5。
RNAはRNase T1で消化され、変性ポリアクリルアミドゲルで分解された。Mod5は、DMAPPの存在下で予測残基を修飾し、シフトされた10ヌクレオチドによって示され、ヌクレオシド位置36〜38での三重アデノシン含有断片はチロシンtRNA中に断片を含む。修飾されたアデノシン37は、アスタリスクで示されています。
同様にセリンtRNAがMod5およびDMAPPと共にインキュベートされると、ヌクレオシド位置36〜38での10ヌクレオチド三分アデノシン含有断片の完全なシフトが観察される。興味深いことに、ヌクレオシド36~38位に三重アデノシン含有断片を含まない7ヌクレオチドフラグメントの部分シフトが観察され、ヌクレオシド位置36~38配列の三重アデノシン含有断片および構造がMod5インビトロ活性に必要とされない可能性があることを示唆している。この技術を習得すると、適切に実行された場合、2、4〜6時間かかります。
RNAの分解はRNA修飾に影響を与え、データ解釈を混乱させる可能性があるため、この手順をうまく試みることは、RNAの完全性を維持し、監視することが重要です。この手順に従って、目的の酵素を使用して、酵素活性に必要な特定の残基またはドメインを決定するために行うことができる。その開発後、この技術は、RNA生物学の分野の研究者が原核および真核生物酵素のtRNA-イサンプテニルトランスファーゼ活性を言う道を開いた。
このビデオを見た後、関心のある酵素のイセパニルトランスレコーゼ活性の検出のためのプロトコルを実行する方法をよく理解する必要があります。放射能を扱うことは非常に危険であり、適切なPPEの着用、十分なシールドの使用、放射能の適切な処分などの予防措置は、常にこの手順を実行する際に行われるべきであることを忘れないでください。
