Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы биохимически охарактеризовать активность tRNA-isopentenyl Transferase In Vitro. Этот метод полезен для обнаружения в пробирке и характеристики активности тРНК-изопентенила трансферазы очищенных рекомбинантных ферментов. Основным преимуществом этого метода является то, что это простой и прямой анализ, используемый для обнаружения ковалентной модификации РНК.
Хотя этот метод дает представление о активности тРНК-изопентенила трансферазы, он потенциально адаптируется для биохимической характеристики широкого спектра или РНК, изменяющих ферменты. Первым шагом в этой процедуре является тщательная очистка стеклянных пластин, которые будут использоваться для литья геля. Вымойте тарелки с мылом и водой, хорошо промыть деионизированной водой, а затем очистить тарелки с изопропанолом и ворсинки без салфеток.
Затем соберите пластины и спейсеры. Смешайте следующие реагенты, чтобы сделать 100 миллилитров 20%акриламид, 7,5 молярной мочевины, 1x TBE гель. 80 миллилитров концентрата геля мочевины, 10 миллилитров разбомбительного геля мочевины и 10 миллилитров буфера геля мочевины.
Добавьте в смесь 40 микролитров T-med и 800 микролитров свежеприготовленного 10%аммония persulfate. Нарисуйте гель раствор в большой шприц и обойтись гель раствор между стеклянными пластинами нажав на стекло при раздаче решения для предотвращения образования пузыря. Дайте гелю затвердеть при комнатной температуре в течение 30 минут.
После того, как гель затвердеет, посадить гель на вертикальный гелевый аппарат. Заполните верхнюю и нижнюю буферные камеры 1x TBE. За два часа до загрузки геля, предварительно запустить гель на 20 миллиампер в течение двух часов, чтобы буфер границы из запустить самые маленькие олигонуклеотиды.
Подготовь каждую реакцию для анализа РНК-изопентениля в окончательном объеме 17 микролитров. Добавить в каждую трубку 50 миллимолор Tris-HCl, рН 7,2, 1,2 миллимолярной АТФ, 5,8 миллимолярского хлорида магния, 0,2 миллимолара DMAPP, 10 единиц ингибитора RNase, 40 000 CPM внутренне 32P помечены РНК, 5,3 микромолара Mod5, и 1,2 миллимолара 2-меркаптотанола. Инкубировать реакции при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.
Через час этанол осаждает RNase, используя 2,5 тома 100% этанола и 1/10 тома 3,5 молярного ацетата рН 5,5, и поместите его отрицательным 20 градусов по Цельсию в течение одного часа на ночь. Затем центрифугировать образцы РНК на 15, 400 г и четыре градуса по Цельсию в течение 20 минут. Аккуратно удалите супернатант и промойте каждую РНК-гранулу 500 микролитров 70% этанола.
Центрифуга образцов на 15, 400 г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Тщательно удалите супернатант и высушите гранулы РНК в течение 15 минут или до тех пор, пока весь этанол не испарится. Далее повторно приостанавливайте каждую ГРАНУЛу РНК в 10 микролитров восьми молярных мочевины.
Добавьте 150 единиц RNase T1 к каждому образцу и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в одночасье. На следующий день добавьте два микролитера буфера загрузки 6x к каждому образцу. Загрузите 10 микролитров каждого образца РНК на предварительном запуске, 20%полякриламид, 7,5 молярного геля мочевины.
Вы запустите гель на 25 миллиампер в течение двух часов. Через два часа остановите электрофорез и удалите гель из аппарата. Разбейте уплотнение между двумя стеклянными пластинами и аккуратно удалите одну из стеклянных пластин с гелем, оставшимся на любой тарелке.
Поместите слой полиэтиленовой пленки над гелем и выставить на экране фосфора в течение трех часов. Этот протокол надежно обнаруживает изопентенилирование как канонических, так и неканонических остатков тРНК, модифицированных S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5. В этом примере тирозин тРНА был внутренне помечен 32P-аденозин и Mod5 был инкубирован с RNase в присутствии или отсутствии DMAPP.
РНК переваривались с помощью RNase T1 и решались на денатурированном полиакриламинидном геле. Mod5 изменяет прогнозируемый остаток в присутствии DMAPP и указывает на сдвинутый 10 нуклеотидов, тройной аденозин, содержащий фрагмент в нуклеозидных положениях 36 до 38, содержат фрагмент в тирозиновой тРНК. Модифицированный аденозин 37 обитает с звездочкой.
Аналогичным образом, когда сериновая тРНА инкубируется с Mod5 и DMAPP, наблюдается полный сдвиг 10 нуклеотид тройной аденозин, содержащий фрагмент в нуклеозидном положении 36 до 38. Интересно, что наблюдается частичный сдвиг семи нуклеотидного фрагмента, который не содержит тройной аденозин, содержащий фрагмент в нуклеозидных позициях 36-38, что говорит о том, что тройной аденозин, содержащий фрагмент в нуклеозидном положении 36-38 последовательности и структуры, может не потребоваться для активности Mod5 in vitro. После освоения этой техники займет два, четыре-шесть часов дней, если она выполняется должным образом.
Хорошо пытается эту процедуру важно помнить, чтобы сохранить и контролировать целостность РНК, потому что деградация РНК может повлиять на модификацию РНК и будет путать интерпретации данных. После этой процедуры мутационные исследования с использованием фермента интерес, может быть сделано для определения конкретных остатков или доменов, необходимых для ферментативной активности. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области РНК биологии, скажем, тРНК-изопентенил трансферазы деятельности прокариотических и эукариотических ферментов.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как осуществлять протокол для обнаружения изопентенила трансферазы деятельности вашего фермента интереса. Не забывайте, что работа с радиоактивностью может быть чрезвычайно опасной и такие меры предосторожности, как ношение надлежащего СИЗ, использование адекватной защиты, и утилизация радиоактивности должным образом всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
