Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Grant Enstitüleri tarafından AVK&#39;ya HL127711 tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Aktin birlikte sedimantasyon tahlili, bir proteinin F-aktine bağlanıp bağlanmadığını çabucak belirleyebilen basit bir tekniktir. Bazı değişikliklerle teknik, etkileşimin afinitesini ölçmek için de kullanılabilir. Yukarıdaki protokolde ortaya konulan hususlara ek olarak, tahlil tasarlanırken, iletilirken ve yorumlanırken aşağıdaki hususlar dikkate alınmalıdır. İlgi Proteinleri Yeni hazırlanmış veya dondurulmuş protein testte kullanılabilir. Dondurulmuş protein kullanılıyorsa, dondurmanın F-aktin bağlanmasını etkilemediğinden emin olmak için sonuçların taze (asla donmamış) protein ile karşılaştırılması önemle tavsiye edilir. G-aktin Kaynağı Birçok peletleme deneyinde göreceli bolluk nedeniyle kasdan izole edilen G-aktin kullanılır. Memelilerde - alfa, beta ve gamma - üç ana aktin izotipi vardır ki bunlar dikkat çekici derecede birbirine benzemektedir (&gt;% 90 sekans tanımlamaty). Bununla birlikte, izotipler 12 , 13 arasında işlevsel farklılıklar vardır. Mümkünse, bağlanma tahlilinde kullanılan G-aktin izotipi in vivo izotipe uymalıdır. Örneğin iskelet kasında ifade edilen bir proteini test ederseniz alfa-aktin en iyi seçimdir; Fibroblastlarda eksprese edilen bir proteini incelemek için beta-aktin önerilir. Phalloidin Kullanımı Falloidin F-aktini bağladığından, bazı F-aktin bağlayıcı proteinlerin bağlanmasını ( örneğin, faloidin , cofilin bağlamadan aktin filamentlerine blokar) müdahale edebilir veya hatta engelleyebilir. Bu nedenle, phalloidin dikkatle kullanılmalı ve mümkün olduğunca phalloidin ile muamele edilmiş numunelerle karşılaştırılmalıdır. Yüksek Arka Plan Proteinlerin F-aktin yokluğunda tortulaşması nadir değildir ( Şekil 1A , hiçbir F-aktin pelet örneğis). Bununla birlikte, arka plan sedimentasyonunun yüksek seviyeleri, gerçek aktin çökelmesini maskeleyebilir ve imkansız olmasa da, bir proteinin F-aktini bağlayıp bağlamadığını veya etkileşimin afinitesini ölçmesini zorlaştırabilir. Polidicanol tepkime tamponuna ekleme (adım 4.1), arka planı önemli ölçüde azaltabilir ve kolay bir çözümdür. Bu, arka planı azaltmazsa, reaksiyon tamponu, tuz konsantrasyonu ve / veya inkübasyon sıcaklığı ayarlanması yardımcı olabilir. Bağlanma Eğrisi Bir bağlanma eğrisi üretmek için, bir dizi reaksiyon üzerinde ilgi protein veya F-aktinin konsantrasyonunu değiştirmek gereklidir. Pratikte F-aktini sabit bir konsantrasyonda tutmak ve ilgi protein konsantrasyonunu değiştirmek daha kolay ve tercih edilir. Peletleme deneyinde F-aktinin sabit konsantrasyonda ( örn., 2 uM) tutulması, daha yüksek konsantrasyonlarda F-aktin ile spesifik olmayan yakalama sayısını sınırlar veDüşük (&lt;0.5 uM) F-aktin konsantrasyonlarında depolimerizasyon. Depolimerizasyon, phalloidin kullanılarak önlenebilir, ancak bu, sisteme potansiyel bir komplike edici faktör getirir (bkz. Adım 3.3 ve üstü). F-aktini sabit bir konsantrasyonda muhafaza etmek, numuneler boyunca F-aktin peletini karşılaştırabilir (ve normalleştirir) ve başarısız deneyleri tanımlamayı sağlar ( yani, F-aktin peletinin çok değişken olduğu, konsantrasyonlarda analizi önlediği durumda). Son olarak, F-aktini sabit bir konsantrasyonda tutmak, birinin aktin filamanına bağlanmanın birlikte çalışıp çalışmadığını belirlemesine izin verir ( Şekil 1C ). Doymuş Bağlama Bütün bağlanma deneylerinde olduğu gibi, F-aktine bağlanmanın doymuş olması ve protein artı F-aktin platolarının konsantrasyonunun kritik olması önemlidir ( Şekil 1C ). Bir plato olmadan doğru bir ayrışma denge sabitinin hesaplanması mümkün değildir. Böylece,Test edilecek seyreltme serisini dikkatlice planlamak ve her zaman daha yüksek konsantrasyonlarda protein ( yani, beklenen Kd&#39;den en az 5-10 kat daha yüksek) içerdiği önemlidir. Bağ Analizi Ölçülen ayrışma sabitlerinin kesin olması için, analiz, ilgi proteinine yönelik olarak F-aktin üzerindeki bağlanma alanlarının konsantrasyonunun afiniteye göre daha düşük olmasına izin veren bir F-aktin konsantrasyonu kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Bu kriterin karşılanıp karşılanmadığını kontrol etmek için bağlama alanlarının B max konsantrasyonunu hesaplayın. Örneğin, eğer [F-aktin] 2 mcM ve B max = 0.5 ise, o zaman [bağlanma bölgeleri] ≈ 1 uM&#39;dir. K d , [bağlanma yerlerinden] en az 5-10 kat daha büyük olmalıdır. Ölçülen Kd, [bağlanma alanları] ile aynı derecede ise, gözlemlenen bağlanma eğrisinin yüksek afiniteli bağlama titrini temsil etmesi mümkündürGerçek bir bağlayıcı izoterm yerine tes. Bu gözlemlenirse, doğru bir afinite ölçmek için tahlil 10 kat daha düşük bir F-aktin konsantrasyonu kullanılarak tekrarlayın. Yüksek afiniteli etkileşimler için afiniteyi doğru bir şekilde ölçmek için düşük bir F-aktin konsantrasyonu elde etmek için phalloidin stabilizasyonu (adım 3.3) gerekli olabilir. Son olarak, araştırmacıların testi yaparken ve değerlendirirken farkında olmaları gereken birlikte sedimantasyon tahlilinde temel sınırlamalar vardır. En önemlisi, birlikte sedimentasyon tahlili gerçek bir denge sabiti oluşturmaz. Bağlanma ürünleri ( yani, protein artı F-aktin), santrifüj işlemi sırasında reaktanlardan ayrılır ve daha sonra ürünler, yeni bir denge yaratmak için ayrışabilir. Sonuç olarak birlikte çöktürme deneyi, düşük afiniteli etkileşimleri yanlış hesaplayabilir veya algılayamaz. Birçok aktin bağlayıcı proteinin F-aktin için düşük bir ( yani, mikromolar) afiniteye sahip olması nedeniyle, negatif bir sonuçtur ( <eM&gt; yani herhangi bir tespit edilebilir bağlanma) bir proteinin F-aktini bağlamadığı anlamına gelmez. Alternatif olarak, TIRF mikroskopi tabanlı, tek filamentli bağlanma deneyleri, bir ayrışma sabitinin belirlenmesinde daha hassas ve daha doğrudur (bu tekniğe yönelik incelemeler için bkz. Referanslar 15,16 ). Bu kısıtlamalara rağmen, peletleme tahlili çoğu araştırmacı tarafından yapılmaktadır ve bir proteinin F-aktine bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ölçmek için etkili bir araçtır.

Aktin, motilite, kasılma, yapışma ve morfoloji gibi çok hücresel süreçlerde kritik bir rol oynayan temel bir sitoskeletal proteintir 1 . Aktin, iki biçimdedir: monomerik globüler aktin (G-aktin) ve polimerize filamentli aktin (F-aktin). Hücreler içinde F-aktin organizasyonu, aktin filamanlarının 2 , 3 , 4 nükleasyonunu, büyümesini, çapraz bağlanmasını ve sökülmesini düzenleyen geniş bir protein koleksiyonu tarafından kontrol edilir. Bununla birlikte, aktin ağı düzenlenmesini düzenleyen çoklu aktin-bağlayıcı proteinlerin nasıl işlediği hala net değildir. Protein-protein etkileşimlerinin ölçümü, proteinlerin hücresel davranış üzerine etkilerini biyokimyasal düzeyde nasıl uyguladığını anlamada önemli bir yaklaşımdır. Saflaştırılmış proteinler arasındaki etkileşimleri saptamak için birçok farklı tahlil kullanılabilir.Çözünür proteinler için yaygın yaklaşımlar pull-down&#39;lar, fluoresan polarizasyonu, izotermal titrasyon kalorimetresi ve yüzey plazmon rezonansıdır. Önemlisi, bu tahlillerin hepsi, proteinlerin çözünür olmasını gerektirir ve bu nedenle, F-aktin gibi bir polimerik, ipliksi protein ile kullanım için uyarlanmak zordur. Burada, bir protein veya protein alanının F-aktine bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ölçmek için bir teknik - aktin birlikte sedimentasyon veya topaklanma, tahlil tanımlıyoruz. Aktin peletleme tahlili, bir ultra-santrifüjün yanı sıra özel ekipman gerektirmeyen nispeten basit bir tekniktir. Tüm reaktifler, temel biyokimya bilgilerini varsayarak veya satın alınarak yapılabilir. F-aktin&#39;e bağlandıktan sonra, deney, görünür afiniteyi ( yani, ayrışma dengesi sabiti) ölçmek için kullanılabilir 5 . Ayrıca, bir kez bir afinite kurulduğunda, peletleme deneyi, Ilgi proteinindeki değişikliklerin ( yani , translasyon sonrası modifikasyonlar, mutasyonlar veya ligand bağlanması) F-aktin 6 ile olan etkileşimini nasıl etkilediğini ölçmek için yararlı bir araçtır. Tekniğin araştırmacının deneyi denemeden önce farkında olması gereken kısıtlamaları vardır (bkz. Tartışma ).

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Actin, rabbit skeletal muscle</td><td>Cytoskeleton</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(&amp;beta;-aminoethyl ether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal Blue Staining Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

Hücrelerin içinde filamentli aktin (F-aktin) organizasyonu, aktin nükleasyonu, büyümesi, çapraz bağlanma ve / veya demontajı kontrol eden çok sayıdaki aktin bağlayıcı proteinler tarafından düzenlenir. Bu protokol, bir protein veya protein alanının F-aktin&#39;e bağlanıp bağlanmadığını belirlemek ve etkileşimin afinitesini ( yani, ayrışma dengesi sabiti) ölçmek için bir tekniği - aktin çöktürme veya topaklama testi - tanımlamaktadır. Bu teknikte, ilgilenilen bir protein önce çözeltide F-aktin ile inkübe edilir. Ardından, aktin filamanlarını tortulaştırmak için diferansiyel santrifüj kullanılmış ve topaklaştınlmış malzeme SDS-PAGE ile analiz edilmiştir. Eğer ilgilenilen protein F-aktini bağlarsa, aktin filamentleri ile birlikte çökecektir. Bağlanma tepkimesinin ( yani F-aktin ve ilgili protein) ürünleri etkileşimin afinitesini belirlemek için nicelleştirilebilir. Aktin peletleme tahlili, belirlenmesi için basit bir tekniktirEğer ilgilenilen bir protein F-aktini bağlar ve ligand bağlanması gibi o proteindeki değişiklikler F-aktin ile olan etkileşimini nasıl etkilediğini değerlendirir.

Ko-sedimantasyon deneyinde F-aktine karşı αE-katenin homodimer bağlanmasını inceledi. Geçmiş deneyler, F-aktin için αE-katenin homodimerinin afinitesi 1 uM civarında ve Bmax 1 11&#39;e yakın olduğu gösterdiğinden, düşük bir F-aktin konsantrasyonuyla (2 uM&#39;den ziyade 0.2 uM; tartışma). 0.2 uM kritik konsantrasyonun altında olduğu için, tavşan iskelet kasından G-aktin&#39;den polimerize edilmiş F-aktini stabilize etmek için phalloidin ilave edildi (basamak 3.3). Artan konsantrasyonlarda αE-catenin homodimeri (0.125-12.0 uM) 0.2 uM F-aktin varlığında veya yokluğunda inkübe edildi. Numuneler santrifüje tabi tutuldu ve elde edilen pelletler analiz edildi ( Şekil 1A ). Beklendiği gibi, αE-katenin homodimeri, arka planın üstünde F-aktin ile birlikte çökeltildi ( Şekil 1A , F-aktin pelet numunelerinin no-F-ac&#39;ye kıyaslaKalay pellet örnekleri). BSA, negatif bir kontrol olarak çalıştırıldı ( Şekil 1B ). Bağlanan protein nicelendirildi ve etkileşimin afinitesini hesaplamak için serbest protein üzerine çizildi ( Şekil 1C ). Planlanan veriler en iyi Hill denklemine uymaktadır. Hesaplanan K d 2.9 uM, Bmax 0.2 ve Hill katsayısı (h) 4.8 idi. Dolayısıyla, αE-catenin homodimeri F-aktini, önceki çalışmada (~ 1.0 uM&#39;ye karşı 2,9 μM&#39;nin bir Kd&#39;si) tutarlı, düşük bir mikromolar afinite ile birlikte bağlar 11 . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Şekil 1: Yüksek hızlı F-aktin birlikte sedimentasyon testi. ( A ) Artan konsantrasyonlar (0.125-12.0 uM) αE-katenin homodimeri, sol panellerle veya sağ paneller olmadan (sağ paneller), phalloidi ile stabilize edilmiş 0.2 uM F-aktin ile kuluçkaya yatırıldın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi ve santrifüj edildi. Toplam (başlangıç ​​maddesinin% 7.5&#39;i) ve pelet haline getirilmiş malzeme (pellet haline getirilmiş malzemenin% 50&#39;si) SDS-PAGE ile ayrılmış ve Coomassie boyasıyla lekelenmiştir. ( B ) 4 uM BSA negatif bir kontrol olarak çalıştırıldı. (+) Veya (-) F-aktin içeren toplam ve pellet örnekleri, SDS-PAGE ile ayrılmış ve Coomassie boyası ile boyanmıştır. ( C ) A&#39;dan bağlanan αE-katenin (μM / μM aktin) serbest αE-katenin (μM) karşısında çizildi ve veriler bir Hill denklemine (kırmızı çizgi) sığdı. K d , B max ve Hill katsayısı (h) listelenmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Şekil 2: Aktin peletleme kantifikasyonu </sTrong&gt; - akış şeması. Bu şema, Toplam ve Pelet örnekleri ( A , CE ) ve kantifikasyon için kullanılan standart eğri ( B ) örnekleriyle, bölüm 5&#39;deki önemli adımları özetlemektedir. 5.13 adımlar: 1 ) Toplam örneklerde (A) ilgi protein miktarını ölçün. 2 ) Bant yoğunluğuna karşı protein kütlesi (B) çizerek standart bir eğri oluşturun. 3 ) F-aktin ( C ) ile çöktürülen ilgi protein miktarını ölçün. 4 ) F-aktin ( D ) yokluğunda peletlenen ilgi protein miktarını ölçün. 5 ) F proteinine bağlı protein miktarını belirlemek için C&#39;den D çıkarın. 6 ) Her bir topakta (E) F-aktinin miktarını ölçün, numune başına F-aktinin ortalama miktarını hesaplayın ve her bir örneği ortalama olarak bölün (aşağıdaki sayılar oranı gösterelim). 7 )Her numune için, pelet içindeki farklılıkları ayarlamak için bağlanmış proteinin miktarını (5. adımda hesaplanan) F-aktin pelet oranı ile bölün (6. adımda hesaplanmıştır). 8 ) Her bir numunede normalize edilmiş bağlanmış proteinin miktarını (kütle) hesaplamak için standart eğriyi ( B ) kullanın (basamak 7). 9 ) Bağlayıcı bir eğri yaratmak için serbest protein ve bağlanmış protein konsantrasyonunu belirleyin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Bu protokol, bir proteinin filamentli aktinle (F-aktin) birlikte sedimentasyon yeteneğini test etmek için bir yöntem ve bağlanma gözlemlendiğinde etkileşimin afinitesini ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Ko-çöktürme yoluyla F-aktine Bağlı Proteinin Ölçülmesi

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.4K Görüntüleme.  University of Pittsburgh School of Medicine.  Bu protokol, bir proteinin filamentli aktinle (F-aktin) birlikte sedimentasyon yeteneğini test etmek için bir yöntem ve bağlanma gözlemlendiğinde etkileşimin afinitesini ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır. 

Video: Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biyokimya

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Küçük oligomer oluşturan Membran Protein Sedimantasyon Denge: pentameric İstikrar Histidine Protonasyon Etkisi

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Kimya

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimantasyon Testi; F-Aktin Bağlayıcı Protein Analizi

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biyoloji

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a consequence, for the clinical management of patients. In the present work we will describe an optimized proteomic approach for the identification of molecules involved in the progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). In detail, leukemic cell lysates are resolved by 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and visualized as &#8220;spots&#8221; on the 2DE gels. Comparative analysis of proteomic maps allows the identification of differentially expressed proteins (in terms of abundance and post-translational modifications) that are picked, isolated and identified by Mass Spectrometry (MS). The biological function of the identified candidates can be tested by different assays (i.e. migration, adhesion and F-actin polymerization), that we have optimized for primary leukemic cells.

Here we describe a protocol that couples two proteomic techniques, namely 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and Mass Spectrometry (MS), to identify differentially expressed/post-translational modified proteins among two or more groups of primary samples. This approach, together with functional experiments, allows the identification and characterization of prognostic markers/therapeutic targets.

Protein fonksiyonu için bir 2DE-Jel Spot: Kronik Lenfositik Lösemide HS1 öğrendim Ders

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

Tıp

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

Floresan Boyut Dışlama Kromatografisi ile Membran Protein Kalitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Glukan Fosfatazların Substrat Bağlanmasını Ölçmek için Konkanavalin A Bazlı Sedimantasyon Testi

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

Aktin bazlı hareketliliğin ticari olarak temin edilebilen proteinlerle yeniden yapılandırılması

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

Biyomühendislik

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZ Polimerizasyon Tahliller: Basit Protokoller ve Düşünceler

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Protein Etkileşimlerinin Canlı Hücre Tek Moleküllü Görüntüleme Tabanlı Miktar Tayini

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Yazar Spotlight: Canlı İnsan Hücrelerinde Protein-Kondensat Dinamiklerinin Değerlendirilmesi

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...