この研究は、国立衛生研究所認可HL127711のAVKに支持された。

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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

アクチン共沈降アッセイは、タンパク質がF-アクチンに結合するかどうかを迅速に判定することができる簡単な技術である。いくつかの変更を加えて、この技術を用いて相互作用の親和性を測定することもできる。上記のプロトコールで提起された点に加えて、アッセイの設計、実施および解釈の際には、以下の問題を考慮する必要があります。 関心のあるタンパク質新たに調製または凍結したタンパク質をアッセイに使用することができる。凍結タンパク質が使用される場合、凍結がF-アクチン結合に影響を及ぼさないように、結果を新鮮な（決して凍結されていない）タンパク質と比較することが強く推奨される。 G-アクチン源多くのペレット化実験は、その豊富な存在のために筋肉から単離されたG-アクチンを使用する。哺乳動物には、α、β、γの3つの主要なアクチンアイソタイプがあり、それらは非常に類似している（&gt; 90％の配列同一性ty）。それにもかかわらず、アイソタイプ12,13の間に機能的な相違がある。可能であれば、結合アッセイに使用されるG-アクチンアイソタイプは、インビボアイソタイプと一致するはずである。例えば、骨格筋で発現されるタンパク質を試験する場合、α-アクチンが最良の選択である。線維芽細胞で発現されるタンパク質を調べる場合は、β-アクチンが推奨される。 ファロイジン使用ファロイジンはFアクチンに結合するので、Fアクチン結合タンパク質（アクチンフィラメントへの結合からのコフィリンなどのファロイジンブロック）の結合を妨害したり、ブロックすることさえあります14 。従って、ファロイジンは注意して使用すべきであり、可能であれば非ファロイジン処理した試料と比較した。 高い背景 F-アクチンの非存在下でタンパク質が沈降することは珍しいことではない（ 図1A 、F-アクチンペレット試料なしs）。しかしながら、高いレベルのバックグラウンド沈降は、真のアクチン共沈降を隠し、不可能ではないにしても、タンパク質がF-アクチンに結合するか、または相互作用の親和性を測定するのを困難にする可能性がある。ポリジカノールを反応緩衝液（工程4.1）に添加することにより、バックグラウンドを有意に減少させることができ、容易な解決策である。それがバックグラウンドを減少させないならば、反応緩衝液、塩濃度、および/またはインキュベーション温度を調整することが役立ち得る。 結合曲線結合曲線を生成するためには、目的のタンパク質またはF-アクチンの濃度を一連の反応にわたって変化させることが必要である。実際には、固定された濃度でF-アクチンを維持し、目的のタンパク質の濃度を変化させることがより容易で好ましい。ペレット化アッセイにおいて固定濃度（ 例えば、 2μM）でF-アクチンを維持することにより、より高い濃度のF-アクチンでの非特異的捕捉が制限され、より低い（&lt;0.5μM）濃度のF-アクチンでの解重合。脱重合はファロイジンを用いて防止することができるが、これは系に潜在的な複雑化因子を導入する（工程3.3以上参照）。固定濃度でF-アクチンを維持することにより、サンプル間でF-アクチンペレットを比較（および標準化）することができ、失敗した実験（ すなわち、 F-アクチンペレットが非常に変動し、濃度間の分析を妨げる）を同定することができる。最後に、固定濃度でF-アクチンを維持することにより、アクチンフィラメントへの結合が協同的であるかどうかを決定することができる（ 図1C ）。 飽和結合すべての結合実験と同様に、F-アクチンへの結合が飽和し、タンパク質+ F-アクチンの濃度が安定することが重要です（ 図1C ）。プラトーがなければ、正確な解離平衡定数を計算することはできません。したがって、それ試験すべき希釈シリーズを注意深く計画し、常により高濃度のタンパク質（ すなわち、予想されるK dよりも少なくとも5〜10倍高い）を含むことが重要である。 バインディング分析測定された解離定数が決定的であるためには、目的タンパク質に対するF-アクチン上の結合部位の濃度が親和性よりもはるかに低くなるようにするF-アクチン濃度を用いてアッセイを実施すべきである。この基準が満たされたかどうかを確認するために、B maxから結合部位の濃度を推定する。例えば、[F-アクチン]が2μMでBmax = 0.5である場合、[結合部位]は約1μMである。 K dは[結合部位]よりも少なくとも5〜10倍大きくなければならない。測定されたK dが[結合部位]と同じオーダーの大きさである場合、観察された結合曲線は高親和性結合siの滴定を表す可能性がある真の結合等温線ではなく、これが観察される場合は、正確な親和性を測定するために、10倍低いF-アクチン濃度を用いてアッセイを繰り返す。高親和性相互作用のために、親和性を正確に測定するのに十分低いF-アクチン濃度を達成するために、ファロイジン安定化（ステップ3.3）が必要であるかもしれない。 最後に、アッセイを実施し、評価する際に研究者が認識すべき共沈降アッセイに関する根本的な制限がある。最も重要なことに、共沈降アッセイは真の平衡定数を生成しない。結合生成物（ すなわち、タンパク質+ F-アクチン）は、遠心分離の間に反応物から分離され、その後、生成物は解離して新たな平衡を作り出すことができる。その結果、共沈降アッセイは、誤った親和性の相互作用を誤って計算したり、検出しなかったりする可能性があります。多くのアクチン結合タンパク質は、Fアクチンに対して低い（ すなわち、マイクロモル）親和性を有するので、陰性の結果（ <eすなわち検出不可能な結合）は、タンパク質がF-アクチンに結合しないことを必ずしも意味しない。代替として、TIRF顕微鏡に基づく単一フィラメント結合アッセイは、解離定数を決定するために、より高感度で正確である（この技術の総説については、参考文献15,16を参照）。これらの制限にもかかわらず、ペレット化アッセイは、ほとんどの研究者の手段の範囲内であり、タンパク質がF-アクチンに結合するかどうかを決定し、相互作用の親和性を測定するための有効なツールである。

アクチンは、運動性、収縮、接着、および形態学を含む、複数の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす必須の細胞骨格タンパク質である1 。アクチンは、単球球状アクチン（G-アクチン）および重合した糸状アクチン（F-アクチン）の2つの形態で存在する。細胞内では、Fアクチンの組織化はアクチンフィラメント2,3,4の核形成、成長、架橋、分解を制御する大量のタンパク質によって制御されています。しかしながら、複数のアクチン結合タンパク質がアクチンネットワークの組織化を調節するためにどのように機能するかは依然としてほとんど不明である。 タンパク質 - タンパク質相互作用の測定は、タンパク質が生化学レベルでどのように細胞行動に影響を及ぼすかを理解するための重要なアプローチである。多くの異なるアッセイを使用して、精製タンパク質間の相互作用を検出することができる。可溶性タンパク質の一般的なアプローチには、プルダウン、蛍光偏光、等温滴定熱量測定、および表面プラズモン共鳴が含まれる。重要なことに、これらのアッセイの全ては、タンパク質が可溶性であることを必要とし、したがって、Fアクチンのような高分子の糸状タンパク質での使用に適応するのが困難である。ここでは、タンパク質またはタンパク質ドメインがF-アクチンに結合するかどうかを決定し、相互作用の親和性を測定するためのテクニック、すなわちアクチン共沈降、またはペレット化アッセイを説明します。 アクチンペレット化アッセイは、超遠心分離機以外の特別な装置を必要としない比較的簡単な技術である。すべての試薬は、基本的な生化学の知識を前提に作成するか、購入することができます。 F-アクチンへの結合が確立されると、このアッセイを使用して見かけの親和性（ すなわち、解離平衡定数）を測定することができる5 。また、いったん親和性が確立されると、ペレット化アッセイ目的タンパク質の変化（ すなわち 、翻訳後修飾、突然変異、またはリガンド結合）がFアクチンとの相互作用にどのように影響するかを測定するのに有用なツールです。この手法には、アッセイを試みる前に研究者が知っておくべき限界（ 議論を参照）があります。

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Actin, rabbit skeletal muscle</td><td>Cytoskeleton</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(&amp;beta;-aminoethyl ether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal Blue Staining Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

細胞内の糸状アクチン（F-アクチン）の組織化は、アクチン核形成、増殖、架橋および/または分解を制御する多数のアクチン結合タンパク質によって調節される。このプロトコルは、タンパク質またはタンパク質ドメインがF-アクチンに結合するかどうかを決定し、相互作用の親和性（ すなわち、解離平衡定数）を測定する技法、すなわちアクチン共沈降、またはペレット化アッセイを記載する。この技術では、目的のタンパク質をまず溶液中のF-アクチンとともにインキュベートする。次いで、分別遠心分離を用いてアクチンフィラメントを沈降させ、ペレット化した物質をSDS-PAGEにより分析する。目的のタンパク質がF-アクチンと結合すると、アクチンフィラメントと一緒に沈降する。結合反応の生成物（ すなわち、 F-アクチンおよび目的のタンパク質）を定量化して、相互作用の親和性を決定することができる。アクチンペレット化アッセイは、目的のタンパク質がF-アクチンと結合し、リガンド結合などのそのタンパク質への変化がF-アクチンとのその相互作用にどのように影響するかを評価するために使用される。

本発明者らは、共沈降アッセイにおいてF-アクチンへのαE-カテニンホモダイマーの結合を調べた。過去の実験から、F-アクチンに対するαE-カテニンホモダイマーの親和性は約1μMであり、 Bmaxは 11に近いことが示されているので、低濃度のF-アクチン（0.2μMではなく2μM;議論）。 0.2μMが臨界濃度未満であるため、ウサギ骨格筋G-アクチンから重合したF-アクチンを安定化するためにファロイジンを添加した（ステップ3.3）。増加する濃度のαE-カテニンホモダイマー（0.125-12.0μM）を、0.2μMのF-アクチンの存在下または非存在下でインキュベートした。試料を遠心分離し、得られたペレットを分析した（ 図1A ）。予想通り、バックグラウンドより上のF-アクチンと一緒に沈降したαE-カテニンホモダイマー（ 図1A 、F-アクチンペレットサンプルを非F-acスズペレットサンプル）。 BSAを陰性対照として用いた（ 図1B ）。結合したタンパク質を定量し、遊離タンパク質上にプロットして、相互作用の親和性を計算した（ 図1C ）。プロットされたデータはヒルの方程式に最もよく合います。計算されたK dは2.9μMであり、B maxは0.2であり、ヒル係数（h）は4.8であった。したがって、αE-カテニンホモダイマーは、以前の研究（〜1.0μMに対して2.9μMのK d）と一致して、低いマイクロモル親和性でF-アクチンに協同して結合する11 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> 図1： 高速F-アクチン同時沈降アッセイ。 （ A ）増加する濃度（0.125-12.0μM）のαE-カテニンホモダイマーを、ファロイドで安定化した0.2μMのF-アクチン（左パネル）または非存在下（右パネル）でインキュベートしたn。それらをRTで30分間インキュベートし、遠心分離した。全部（出発材料の7.5％）およびペレット化した材料（ペレット化した材料の50％）をSDS-PAGEによって分離し、クマシー色素で染色した。 （ B ）陰性対照として4μMBSAを流した。 F-アクチンを含む（+）または含まない（ - ）アクチビンを含む全サンプルおよびペレットサンプルをSDS-PAGEによって分離し、クマシー色素で染色した。 （ C ）遊離αE-カテニン（μM）に対して、Aから結合したαE-カテニン（μM/μMアクチン）をプロットし、ヒル式（赤線）に適合した。 K d 、B max 、及びヒル係数（h）が列挙される。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> 図2： アクチンペレット化定量 </strong&gt; - フローチャート。この概略図は、定量化に使用されたTotalおよびPelletサンプル（ A 、 CE ）および標準曲線（ B ）の例を含む第5章の重要なステップを概説しています。 5.13ステップ： 1 ）総サンプル（A）中の目的のタンパク質の量を測定する。 2 ）バンド強度対タンパク質質量（B）をプロットして標準曲線を作成する。 3 ）F-アクチン（ C ）と一緒に沈降する目的のタンパク質の量を測定する。 4 ）F-アクチン（ D ）の非存在下でペレット化した目的タンパク質の量を測定する。 5 ）Fをアクチンに結合したタンパク質の量を決定するためにCからDを引く。 6 ）各ペレット中のF-アクチンの量（E）を測定し、1サンプル当たりのF-アクチンの平均量を計算し、各サンプルを平均で割り出す（以下の数字はその比を示す）。 7 ）各サンプルについて、結合タンパク質の量（ステップ5で計算）をF-アクチンペレット比（ステップ6で計算）で割り、ペレットの違いを調整する。 8 ）標準曲線（ B ）を用いて、各試料中の正規化された結合タンパク質の量（質量）を計算する（工程7）。 9 ）遊離タンパク質および結合タンパク質の濃度を決定して結合曲線を作成する。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

このプロトコールは、糸状アクチン（F-アクチン）と同時沈降するタンパク質の能力を試験し、結合が観察された場合に相互作用の親和性を測定する方法を記載する。

共沈降によるF-アクチンへのタンパク質結合の測定

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.4K ビュー.  University of Pittsburgh School of Medicine. このプロトコールは、糸状アクチン（F-アクチン）と同時沈降するタンパク質の能力を試験し、結合が観察された場合に相互作用の親和性を測定する方法を記載する。 

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Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのツールとしての蛍光異方性

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

生化学

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

小オリゴマー形成膜タンパク質の沈降平衡：五量体安定性に対するヒスチジンプロトン化の影響

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

化学

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

生物学

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a consequence, for the clinical management of patients. In the present work we will describe an optimized proteomic approach for the identification of molecules involved in the progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). In detail, leukemic cell lysates are resolved by 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and visualized as &#8220;spots&#8221; on the 2DE gels. Comparative analysis of proteomic maps allows the identification of differentially expressed proteins (in terms of abundance and post-translational modifications) that are picked, isolated and identified by Mass Spectrometry (MS). The biological function of the identified candidates can be tested by different assays (i.e. migration, adhesion and F-actin polymerization), that we have optimized for primary leukemic cells.

Here we describe a protocol that couples two proteomic techniques, namely 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and Mass Spectrometry (MS), to identify differentially expressed/post-translational modified proteins among two or more groups of primary samples. This approach, together with functional experiments, allows the identification and characterization of prognostic markers/therapeutic targets.

タンパク質機能に2DE  - ゲルスポットから：慢性リンパ性白血病で、HS1から学んだレッスン

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

医学

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

蛍光サイズ排除クロマトグラフィーによる膜タンパク質品質の迅速評価(英語)

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

グルカンホスファターゼの基質結合を測定するためのコンカナバリンAベースの沈降アッセイ

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

市販タンパク質によるアクチンベースの運動性の再構成

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

生物工学

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZは重合アッセイ：シンプルプロトコルと考慮事項

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

生細胞の1分子イメージングによるタンパク質相互作用の定量化

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

著者スポットライト:生きたヒト細胞におけるタンパク質凝縮物ダイナミクスの評価

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

生体分子凝縮物内のタンパク質相互作用ダイナミクスの1分子測定

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...