עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט HL127711 ל AVK.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

אקטין שיתוף assay משקע היא טכניקה פשוטה שיכולה לקבוע במהירות אם חלבון נקשר F- אקטין. עם כמה שינויים, הטכניקה יכולה לשמש גם כדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה. בנוסף נקודות שהועלו בפרוטוקול לעיל, הנושאים הבאים יש לקחת בחשבון בעת ​​תכנון, ניסוי, ופרשנות assay. חלבון של עניין חלבון מוכן טרי או קפוא ניתן להשתמש assay. אם חלבון קפוא משמש, מומלץ מאוד להשוות את התוצאות עם חלבון טרי (מעולם לא קפוא) כדי להבטיח כי הקפאה אינה משפיעה על F- אקטין מחייב. מקור G- אקטין רבים ניסויים peliting להשתמש G- אקטין מבודדים מן השריר בגלל השפע היחסי שלה. ישנם שלושה אסתטינים אקטין עיקריים ביונקים - אלפא, ביתא וגאמא - דומים להפליא (&gt; 90% רצף מזהיםTy). עם זאת, ישנם הבדלים תפקודיים בין האיזוטופים 12 , 13 . אם אפשר, אקטין G- אקטין המשמש assay מחייב צריך להתאים את איסוטיפ in vivo . לדוגמה, אם בדיקת חלבון לידי ביטוי שריר השלד, אקטין אלפא הוא הבחירה הטובה ביותר; אם בוחנים חלבון לידי ביטוי fibroblasts, בטא אקטין מומלץ. השימוש Phalloidin מאז phalloidin נקשר F- אקטין, זה יכול להפריע או אפילו לחסום את הכריכה של כמה חלבונים F- אקטין מחייב ( למשל, בלוקים phalloidin cofilin מחייב לחוטים actin) 14 . לכן, phalloidin יש להשתמש בזהירות עם התוצאות לעומת דגימות שאינן phalloidin שטופלו כאשר אפשרי. רקע גבוה אין זה נדיר עבור חלבונים משקעים בהעדר F- אקטין ( איור 1 א , לא F- אקטין גלולה מדגםS). עם זאת, רמות גבוהות של שקיעה ברקע יכול להסוות שיתוף פעולה אקטין אמיתי ולהקשות, אם לא בלתי אפשרי, כדי לקבוע אם חלבון נקשר F- אקטין או למדוד את הזיקה של האינטראקציה. הוספת polidicanol למאגר התגובה (שלב 4.1) יכול להפחית באופן משמעותי את הרקע הוא פתרון קל. אם זה לא להפחית את הרקע, התאמת למאגר התגובה, ריכוז מלח, ו / או טמפרטורת הדגירה עשוי לעזור. עקומה מחייב כדי ליצור עקומה מחייב, יש צורך לשנות את הריכוז של החלבון או של עניין או F- אקטין על פני סדרה של תגובות. בפועל, זה קל יותר עדיף לשמור F- אקטין בריכוז קבוע כדי לשנות את הריכוז של חלבון של עניין. שמירה F- אקטין בריכוז קבוע ( למשל, 2 מיקרומטר) ב assay pelleting גבולות שאינם ספציפיים השמנה בריכוזים גבוהים יותר של F- אקטין ומונעדה-פולימריזציה בריכוז נמוך יותר (&lt;0.5 מיקרומטר) של F-actin. דה-פולימריזציה ניתן למנוע באמצעות phalloidin, אם כי זה מציג גורם סיבוך פוטנציאלי לתוך המערכת (ראה שלב 3.3 ומעלה). שמירה על F- אקטין בריכוז קבוע גם מאפשרת להשוות (לנרמל) את F- אקטין גלולה על פני דגימות לזהות ניסויים נכשלו ( כלומר, כאשר גלולה F- אקטין משתנה מאוד, מניעת ניתוח על פני ריכוזים). לבסוף, שמירה F- אקטין בריכוז קבוע מאפשר אחד כדי לקבוע אם מחייב נימה אקטין הוא שיתופי ( איור 1 ג ). כריכה רוויה כמו בכל הניסויים מחייב, זה קריטי כי מחייב F- אקטין רווי וכי ריכוז חלבון פלוס F- אקטין plateaus ( איור 1 ג ). ללא רמה, לא ניתן לחשב קבוע שיווי משקל דיסוציאציה קבוע. לכן, זהחשוב לתכנן בקפידה את סדרת הדילול שייבדקו ותמיד לכלול ריכוזים גבוהים יותר של חלבון ( כלומר, לפחות פי 5 עד פי 10 גבוה מהצפוי). ניתוח מחייב על מנת קבועי דיסוציאציה נמדד להיות חד משמעית, assay צריך להתבצע באמצעות ריכוז F- אקטין המאפשר ריכוז של אתרי קשירה ב- F- אקטין לחלבון של עניין להיות הרבה יותר נמוך מאשר זיקה. כדי לבדוק אם קריטריון זה נענה, להעריך את ריכוז של אתרי קשירה מ מקסימום B. לדוגמה, אם [F- אקטין] היה 2 מיקרומטר ו- B מקסימום = 0.5, ואז [מחייב אתרים] ≈ 1 מיקרומטר. K K צריך להיות לפחות 5 עד פי 10 גדול יותר מאשר [אתרי מחייב]. אם K K הנמדד הוא בסדר גודל זהה לזה של [קשירת אתרים], אזי ייתכן שהעקומה המחוברת הנצפית מייצגת טיטרציה של siTes ולא איסתרם מחייב אמיתי. אם זה נצפה, לחזור על assay באמצעות 10 פי נמוך ריכוז אקטין F כדי למדוד זיקה מדויקת. עבור אינטראקציות זיקה גבוהה, ייצוב phalloidin (שלב 3.3) עשוי להיות נחוץ כדי להשיג ריכוז F- אקטין נמוך מספיק כדי למדוד במדויק זיקה. לבסוף, יש מגבלות היסוד עם assay שיתוף שקיעה כי החוקרים צריכים להיות מודעים בעת ביצוע והערכת assay. והכי חשוב, assay שיתוף שקיעה לא לייצר קבוע שיווי משקל קבוע. המוצרים של מחייב ( כלומר, חלבון פלוס F- אקטין) מופרדים מן המגיבים במהלך צנטריפוגה, ואז המוצרים יכולים ואז לנתק ליצור שיווי משקל חדש. כתוצאה מכך, assay co-sedmentation יכול לחשב או להיכשל לגלות אינטראקציות זיקה נמוכה. מאחר וחלבונים רבים של אקטין מחייב זיקה נמוכה ( כלומר, מיקרומטר) ל- F-actin, תוצאה שלילית ( <eמ &#39;&gt; כלומר, לא מחייב לזיהוי) ב assay לא בהכרח אומר כי חלבון אינו לאגד F- אקטין. כחלופה, TIRF מיקרוסקופיה מבוססי, בודד נימה מחייב מבחני רגישים יותר מדויק יותר לקביעת קבוע דיסוציאציה (עבור ביקורות על טכניקה זו, ראה הפניות 15,16 ). למרות המגבלות הללו, assay גלולה הוא בתוך האמצעים של רוב החוקרים הוא כלי יעיל כדי לקבוע אם חלבון נקשר F- אקטין וכדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה.

אקטין הוא חלבון cytoskeletal חיוני אשר ממלא תפקיד קריטי בתהליכים סלולריים מרובים, כולל תנועתיות, התכווצות, הדבקה, מורפולוגיה 1 . אקטין קיים בשתי צורות: אקטין כדורית מונומריקית (G- אקטין) ו actin נימול polymerized (F- אקטין). בתוך התאים, F- אקטין הארגון נשלט על ידי אוסף גדול של חלבונים המווסתים את נוקלאציה, צמיחה, cross-linking, ופירוק של חוטים אקטין 2 , 3 , 4 . עם זאת, כמה מרובות אקטין מחייב תפקוד בתיאום כדי להסדיר ארגון רשת אקטין עדיין לא ברור במידה רבה. מדידת האינטראקציות בין חלבונים לחלבון היא גישה חשובה להבנה כיצד חלבונים מפעילים את השפעתם על ההתנהגות הסלולרית ברמה הביוכימית. מבחני רבים יכולים לשמש כדי לזהות אינטראקציות בין חלבונים מטוהרים.גישות נפוצות עבור חלבונים מסיסים כוללים משיכות, קיטוב פלואורסצנציה, calorimetry טיטרציה איזותרמית, תהודה פלסמון פני השטח. חשוב לציין, כל מבחני אלה דורשים חלבונים להיות מסיסים, ולכן הם קשים להסתגל לשימוש עם חלבון פילמנטי, פילמנטי כגון F- אקטין. כאן, אנו מתארים טכניקה - אקטין שיתוף שקיעה, או גלולה, assay - כדי לקבוע אם חלבון או חלבון תחום נקשר F- אקטין וכדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה. אקטין pelleting assay היא טכניקה פשוטה יחסית שאינה דורשת ציוד מיוחד, מלבד ultracentrifuge. כל ריאגנטים יכול להיעשות, בהנחה של ידע ביוכימיה בסיסית, או לרכוש. לאחר מחייב F- אקטין הוקמה, assay ניתן להשתמש כדי למדוד את הזיקה לכאורה ( כלומר, שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע) 5 . כמו כן, ברגע זיקה היא הוקמה, assay pelletingהוא כלי שימושי כדי למדוד כיצד שינויים החלבון של עניין ( כלומר , שינויים לאחר translational, מוטציות, או ליגנד מחייב) להשפיע על האינטראקציה שלה עם F-actin 6 . טכניקה יש מגבלות (ראה דיון ) כי החוקר צריך להיות מודע לפני שתנסה assay.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Actin, rabbit skeletal muscle</td><td>Cytoskeleton</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(&amp;beta;-aminoethyl ether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal Blue Staining Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

אקטין אקטין (F- אקטין) ארגון בתוך תאים מוסדר על ידי מספר רב של חלבונים אקטין מחייב השולטים אקטין נוקלאציה, צמיחה, חוצה קישור ו / או פירוק. פרוטוקול זה מתאר טכניקה - אקטין שיתוף שקיעה, או גלולה, assay - כדי לקבוע אם חלבונים או חלבון תחום נקשר F- אקטין וכדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה ( כלומר, שיווי המשקל דיסוציאציה קבוע). בטכניקה זו, חלבון של עניין מודגרת הראשונה עם F- אקטין בפתרון. ואז, צנטריפוגה דיפרנציאלי משמש משקעים את החוטים אקטין, ואת החומר גלולה מנותח על ידי SDS-PAGE. אם חלבון של עניין נקשר F- אקטין, זה יהיה שיתוף משקעים עם חוטים אקטין. את המוצרים של התגובה מחייב ( כלומר, F- אקטין וחלבון של עניין) ניתן לכמת כדי לקבוע את הזיקה של האינטראקציה. אקטין pelleting assay היא טכניקה פשוטה לקביעתאם חלבון של עניין נקשר F-actin ולהעריך כיצד שינויים חלבון זה, כגון קשירת ליגנד, להשפיע על האינטראקציה שלה עם F- אקטין.

בדקנו αE-catenin homodimer מחייב F- אקטין assay שיתוף שקיעה. מאז ניסויים בעבר הראו כי זיקה של הומודימר αE-catenin עבור F- אקטין הוא סביב 1 מיקרומטר ו מקסימום B ליד 1 11 , ביצענו את assay עם ריכוז נמוך של אקטין F (0.2 מיקרומטר ולא 2 מיקרומטר, ראה הדיון). מאז 0.2 מיקרומטר הוא מתחת לריכוז קריטי, phalloidin נוספה לייצב את F- אקטין פולימר מ שריר השלד שריר G- אקטין (שלב 3.3). ריכוזים הולכים וגדלים של הומודימר αE-catenin (0.125-12.0 מיקרומטר) הודגמו בנוכחות או היעדר של 0.2 מיקרומטר F- אקטין. הדגימות היו centrifuged, וכתוצאה מכך pellets נותחו ( איור 1 א ). כצפוי, הומודימר αE-catenin שיתוף sedimented עם רקע F- אקטין מעל ( איור 1 א &#39; , להשוות את F- אקטין גלולות דגימות לא- F- ACדגימות פח). BSA היה לרוץ כמו שליטה שלילית ( איור 1 ב ). חלבון Bound היה לכמת זממו על חלבון חינם כדי לחשב את הזיקה של האינטראקציה ( איור 1C ). הנתונים המתויגים מתאימים ביותר למשוואת היל. K מחושב D היה 2.9 מיקרומטר, מקסימום B היה 0.2, ואת מקדם היל (ח) היה 4.8. לפיכך, הומודימר αE-catenin נקשר F- אקטין במשותף עם זיקה מיקרומטר נמוכה, עולה בקנה אחד עם עבודה קודמת (K ד של 2.9 מיקרומטר לעומת ~ 1.0 מיקרומטר) 11 . <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> איור 1: מהירות גבוהה F- אקטין co- שקיעה assay. ( א ) הגדלת ריכוזי (0.125-12.0 מיקרומטר) של הומודימר αE-catenin הודגרו עם (פאנלים שמאל) או ללא (מימין לוחות) 0.2 מיקרומטר F- אקטין התייצב עם phalloidiנ. הם הודגרו במשך 30 דקות ב RT ו centrifuged. סך הכל (7.5% מהחומר המוצא) וחומר pelleted (50% של חומר pelleted) הופרדו על ידי SDS-PAGE ומוכתמים עם צבע קומאסי. ( ב ) 4 מיקרומטר BSA היה להפעיל כמו שליטה שלילית. סך הכל גלולה דגימות, עם (+) או בלי (-) F- אקטין, הופרדו על ידי SDS-PAGE ומוכתמים עם צבע קומאסי. ( C ) Bound αE-catenin (μM / מיקרומטר actin) מ- A היה זממו נגד חינם αE-catenin (מיקרומטר), ואת הנתונים מתאימים למשוואת היל (קו אדום). K K, B מקסימום ומקדם היל (h) מפורטים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> איור 2: אקטין pelleting כימות </sתרשים זרימה. סכמטי זה מתאר את שלבי המפתח בסעיף 5, עם דוגמאות של דגימות סך ו גלולה ( A , CE ) ואת עקומת תקן ( ב ) המשמש לכימות. 5.13 צעדים: 1 ) למדוד את כמות החלבון של עניין במדגם הכולל (A). 2 ) ליצור עקומה סטנדרטית על ידי זומם את עוצמת הלהקה לעומת מסת חלבון (B). 3 ) למדוד את כמות החלבון עניין כי שיתוף sedimented עם F- אקטין ( ג ). 4 ) למדוד את כמות החלבון של עניין כי pelleted בהעדר F-actin ( D ). 5 ) לחסר D מ C כדי לקבוע את כמות החלבון קשור F- אקטין. 6 ) למדוד את כמות F- אקטין בכל גלולה (E), לחשב את הכמות הממוצעת של F- אקטין לכל מדגם, ולחלק כל מדגם על ידי הממוצע (המספרים שלהלן מראים את היחס). 7 )עבור כל דגימה, לחלק את כמות החלבון מחויב (מחושב בשלב 5) על ידי היחס גלולה F- אקטין (מחושב בשלב 6) כדי להתאים את ההבדלים גלולה. 8 ) השתמש עקומת סטנדרטי ( ב ) כדי לחשב את כמות (מסה) של חלבון מחויב מנורמל בכל מדגם (שלב 7). 9 ) לקבוע את הריכוז של חלבון חופשי וחלבון מחויב ליצור עקומה מחייב. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבחון את היכולת של חלבון לשיתוף משקעים עם אקטין filamentous (F- אקטין), ואם מחייב הוא ציין, כדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה.

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.4K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine.  פרוטוקול זה מתאר שיטה לבחון את היכולת של חלבון לשיתוף משקעים עם אקטין filamentous (F- אקטין), ואם מחייב הוא ציין, כדי למדוד את הזיקה של האינטראקציה. 

Video: Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

שקיעת שיווי משקל של חלבון ממברנה הקטן oligomer יוצרי: אפקט של היסטידין protonation על pentameric יציבות

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Chemistry

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biology

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a consequence, for the clinical management of patients. In the present work we will describe an optimized proteomic approach for the identification of molecules involved in the progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). In detail, leukemic cell lysates are resolved by 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and visualized as &#8220;spots&#8221; on the 2DE gels. Comparative analysis of proteomic maps allows the identification of differentially expressed proteins (in terms of abundance and post-translational modifications) that are picked, isolated and identified by Mass Spectrometry (MS). The biological function of the identified candidates can be tested by different assays (i.e. migration, adhesion and F-actin polymerization), that we have optimized for primary leukemic cells.

Here we describe a protocol that couples two proteomic techniques, namely 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and Mass Spectrometry (MS), to identify differentially expressed/post-translational modified proteins among two or more groups of primary samples. This approach, together with functional experiments, allows the identification and characterization of prognostic markers/therapeutic targets.

מספוט 2DE-ג&#39;ל לתפקוד חלבון: לקח מHS1 בכרוני לימפוציטית לוקמיה

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

Medicine

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

הערכה מהירה של איכות חלבון הממברנה על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל פלואורסצנטי

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Concanavalin A מבוסס Sedimentation Assay למדידת קשירת המצע של פוספטאז גלוקני

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

Bioengineering

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZ פלמור מבחני: פרוטוקולים ושיקולים פשוטים

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

כימות מבוסס הדמיה של תאים חיים על מולקולות בודדות של אינטראקציות חלבונים

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

מחבר זרקור: הערכה של דינמיקה של עיבוי חלבונים בתאים אנושיים חיים

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...