Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grant HL127711 a AVK.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il saggio di co-sedimentazione dell&#39;azione è una tecnica diretta che può rapidamente determinare se una proteina lega F-actina. Con alcune modifiche, la tecnica può essere utilizzata anche per misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione. Oltre ai punti sollevati nel precedente protocollo, dovrebbero essere considerati i seguenti problemi durante la progettazione, la conduzione e l&#39;interpretazione del dosaggio. Proteina d&#39;interesse Proteine ​​appena preparate o congelate possono essere utilizzate nel dosaggio. Se si utilizzano proteine ​​congelate, si raccomanda vivamente di confrontare i risultati con proteine ​​fresche (non congelate) per garantire che il congelamento non influisca sul legame di F-actina. G-actin Source Molti esperimenti di pelleting usano G-actina isolata dal muscolo a causa della relativa abbondanza. Ci sono tre isotipi principali di actina nei mammiferi - alfa, beta e gamma - che sono notevolmente simili (&gt; 90% identi di sequenzaty). Tuttavia, esistono differenze funzionali tra gli isotipi 12 , 13 . Se possibile, l&#39;isotipo del G-actin usato nel test di associazione dovrebbe corrispondere all&#39;isotipo in vivo . Ad esempio, se la prova di una proteina espressa in muscoli scheletrici, l&#39;alpha-actina è la scelta migliore; Se esaminando una proteina espressa in fibroblasti, si consiglia l&#39;beta-actina. Uso di Phalloidin Dal momento che il falloidino lega F-actina, può interferire o addirittura bloccare il legame di alcune proteine ​​leganti F-actina ( ad es. Blocchi di phalloidin bloccare cofilin da legame ai filamenti di actina). Pertanto, il falloidino deve essere usato con cautela e i risultati rispetto ai campioni trattati non falloidini quando possibile. Alto sfondo Non è raro che le proteine ​​si sedimentino in assenza di F-actina ( Figura 1A , nessun campione di pellet F-actinaS). Tuttavia, elevati livelli di sedimentazione in background possono mascherare la co-sedimentazione reale dell&#39;azione e rendere difficile, se non impossibile, determinare se una proteina lega F-actina o misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione. L&#39;aggiunta di polidicanol al tampone di reazione (fase 4.1) può ridurre significativamente lo sfondo e costituire una soluzione facile. Se ciò non riduce lo sfondo, può essere utile regolare il buffer di reazione, la concentrazione di sale e / o la temperatura di incubazione. Curva legante Per generare una curva di legame, è necessario variare la concentrazione della proteina di interesse o dell&#39;attin-F su una serie di reazioni. In pratica, è più facile e preferibile mantenere F-actina ad una concentrazione fissa e variare la concentrazione della proteina di interesse. Il mantenimento di F-actina ad una concentrazione fissa ( es. 2 μM) nel saggio di pelletizzazione limita la cattura non specifica a concentrazioni superiori di F-actina e previeneDepolimerizzazione a concentrazioni inferiori (&lt;0,5 μM) di F-actina. La depolimerizzazione può essere impedita usando il phalloidin, anche se questo introduce un potenziale fattore complicante nel sistema (vedere punto 3.3 e sopra). Il mantenimento di F-actina ad una concentrazione fissa consente anche di confrontare (e normalizzare) il pellet di F-actina attraverso i campioni e di individuare esperimenti falliti ( cioè, dove il pellet F-actin è altamente variabile, impedendo l&#39;analisi in concentrazioni). Infine, mantenere F-actina ad una concentrazione fissa consente di determinare se il legame al filamento dell&#39;attin è cooperativo ( Figura 1C ). Legatura satura Come in tutti gli esperimenti di legame, è fondamentale che il legame con F-actina sia saturo e che la concentrazione di proteine ​​più gli alti F-actin ( Figura 1C ). Senza un plateau, non è possibile calcolare una precisa costante di equilibrio di dissociazione. CosìÈ importante pianificare attentamente la serie di diluizione da sottoporre a test e includere sempre più alte concentrazioni di proteine ​​( cioè almeno 5- 10 volte più elevate del previsto K d ). Analisi del legame Affinché le costanti di dissociazione misurate siano conclusive, il test dovrebbe essere eseguito usando una concentrazione di actina F che consente la concentrazione di siti di legame su F-actina per la proteina di interesse essere molto più bassa dell&#39;affinità. Per verificare se questo criterio è stato raggiunto, stimare la concentrazione dei siti di legame da B max . Ad esempio, se [F-actin] era 2 μM e B max = 0,5, quindi [siti di legame] ≈ 1 μM. Il K d dovrebbe essere almeno 5-10 volte più grande di [siti di legame]. Se la misura K d è dello stesso ordine di grandezza di [siti di legame], allora è possibile che la curva di legame osservata rappresenti una titolazione di legame ad alta affinitàPiuttosto che una vera isoterma vincolante. Se ciò viene osservato, ripetere il test utilizzando una concentrazione di 10 volte più bassa di actina per misurare un&#39;affinità accurata. Per interazioni di elevata affinità, la stabilizzazione di falloidina (fase 3.3) può essere necessaria per ottenere una concentrazione di actina sufficiente a misurare con precisione l&#39;affinità. Infine, ci sono limiti fondamentali con il test di co-sedimentazione che i ricercatori dovrebbero essere consapevoli durante l&#39;esecuzione e la valutazione del dosaggio. Il più importante, il test di co-sedimentazione non produce una vera costante di equilibrio. I prodotti di legame ( cioè proteine ​​e F-actina) vengono separati dai reagenti durante la centrifugazione, dopo di che i prodotti possono dissociarsi per creare un nuovo equilibrio. Di conseguenza, il test di co-sedimentazione può erroneamente calcolare o non riescono a rilevare interazioni a bassa affinità. Poiché molte proteine ​​leganti di actina hanno una bassa affinità ( cioè, micromolare) per l&#39;F-actina, un risultato negativo ( <eM&gt; cioè nessun legame rilevabile) nel test non significa necessariamente che una proteina non lega F-actina. In alternativa, i test di associazione a filo a filamenti basati sulla microscopia TIRF sono più sensibili e più accurati per determinare una costante di dissociazione (per recensioni su questa tecnica, vedere i riferimenti 15,16 ). Nonostante queste limitazioni, il dosaggio di pelleting è all&#39;interno dei mezzi della maggior parte dei ricercatori ed è uno strumento efficace per determinare se una proteina lega F-actina e misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione.

Actin è una proteina citoscheletrica essenziale che svolge un ruolo fondamentale nei processi cellulari multipli, tra cui la motilità, la contrazione, l&#39;adesione e la morfologia 1 . Actin esiste in due forme: actina globulare monomerica (G-actina) e actina filamentosa polimerizzata (F-actina). All&#39;interno delle cellule, l&#39;organizzazione di F-actin è controllata da una grande collezione di proteine ​​che regolano la nucleazione, la crescita, la reticolazione e lo smontaggio dei filamenti attinenti 2 , 3 , 4 . Tuttavia, come funzionano in concorrenza molteplici proteine ​​leganti di actina per regolare l&#39;organizzazione della rete di actine è ancora in gran parte poco chiara. La misurazione delle interazioni proteine-proteine ​​è un approccio importante per capire come le proteine ​​esercitano i loro effetti sul comportamento cellulare a livello biochimico. Molti test possono essere usati per rilevare le interazioni tra proteine ​​purificate.Gli approcci comuni per le proteine ​​solubili includono i pull-down, la polarizzazione di fluorescenza, la calorimetria di titolazione isoterma e la risonanza di plasmone superficiale. Importante, tutti questi dosaggi richiedono che le proteine ​​siano solubili e siano quindi difficili da adattare per l&#39;uso con una proteina polimerica, filamentosa come F-actina. Qui descriviamo una tecnica - la co-sedimentazione di actina o il comportamento di pellet, per determinare se un dominio proteico o proteico lega F-actina e misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione. Il test di pelleting di actina è una tecnica relativamente semplice che non richiede attrezzature specializzate, oltre ad un ultracentrifuga. Tutti i reagenti possono essere realizzati assumendo la conoscenza della biochimica di base o acquistati. Una volta stabilito un legame con F-actina, il saggio può essere utilizzato per misurare l&#39;apparente affinità ( cioè la costante di equilibrio della dissociazione) 5 . Inoltre, una volta stabilita un&#39;affinità, il saggio di pelletingÈ uno strumento utile per misurare come le modifiche alla proteina di interesse ( cioè modificazioni post-traslazionali, mutazioni o legame legame) influenzino la sua interazione con F-actin 6 . La tecnica ha limitazioni (vedi Discussione ) che il ricercatore deve essere a conoscenza prima di tentare il test.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Actin, rabbit skeletal muscle</td><td>Cytoskeleton</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(&amp;beta;-aminoethyl ether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal Blue Staining Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

L&#39;organizzazione filamentosa di actina (F-actin) all&#39;interno delle cellule è regolata da un gran numero di proteine ​​legate all&#39;attinità che controllano la nucleazione, la crescita, la reticolazione e / o lo smontaggio dell&#39;attin. Questo protocollo descrive una tecnica - la co-sedimentazione di actina o il processo di pelletizzazione - per determinare se un dominio proteico o proteico lega F-actina e misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione ( cioè la costante di equilibrio della dissociazione). In questa tecnica, una proteina di interesse viene prima incubata con F-actina in soluzione. Successivamente, la centrifugazione differenziale viene usata per sedimentare i filamenti di actina e il materiale pelletato viene analizzato mediante SDS-PAGE. Se la proteina di interesse lega F-actina, co-sedimenti con i filamenti di actina. I prodotti della reazione di legame ( cioè F-actina e la proteina di interesse) possono essere quantificati per determinare l&#39;affinità dell&#39;interazione. Il test di pelleting di actina è una tecnica diretta per determinareSe una proteina di interesse lega F-actina e per valutare come le modifiche a quella proteina, come il binding del ligando, influenzano la sua interazione con F-actina.

Abbiamo esaminato l&#39;associazione dell&#39;omodimero di αE-catenina all&#39;actin F nel test di co-sedimentazione. Dato che gli esperimenti passati hanno dimostrato che l&#39;affinità dell&#39;omodimero αE-catenina per F-actina è di circa 1 μM e il B max vicino a 11 , abbiamo eseguito il saggio con una bassa concentrazione di F-actina (0,2 μM piuttosto che 2 μM; la discussione). Poiché 0,2 μM è al di sotto della concentrazione critica, è stato aggiunto il falloidina per stabilizzare l&#39;actina F-polimerizzata dal muscolo scheletrico G-actina (fase 3.3). Aumento delle concentrazioni di homodimer αE-catenina (0,125-12,0 μM) sono state incubate in presenza o in assenza di 0,2 μM di F-actina. I campioni sono stati centrifugati e le pellicole risultanti sono state analizzate ( figura 1A ). Come previsto, l&#39;omodimero αE-catenina co-sedimentato con F-actina sopra lo sfondo ( Figura 1A , confrontare i campioni di pellet F-actin con il no-F-acCampioni di pellets di stagno). BSA è stato eseguito come un controllo negativo ( Figura 1B ). La proteina legata è stata quantificata e tracciata su proteine ​​libere per calcolare l&#39;affinità dell&#39;interazione ( Figura 1C ). I dati grafici mostrano meglio l&#39;equazione di Hill. La K d calcolata era 2.9 μM, il B max era 0.2 e il coefficiente Hill (h) era 4.8. Così, l&#39;omodimero αE catenina lega F-actina in cooperativa con una bassa affinità micromolare, coerente con il precedente lavoro (Kd di 2,9 μM rispetto a ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figura 1: Saggio di co-sedimentazione ad alta velocità di F-actina. ( A ) Concentrazioni aumentanti (0,125-12,0 μM) di homodimero αE-catenina sono state incubate con (pannelli sinistri) o senza (pannelli destro) 0,2 μM F-actina stabilizzata con phalloidin. Sono stati incubati per 30 minuti a RT e centrifugati. Il totale (7,5% del materiale di partenza) e il materiale pelletato (50% del materiale pelletato) sono stati separati da SDS-PAGE e macchiati con colorante Coomassie. ( B ) 4 μM BSA è stato eseguito come un controllo negativo. I campioni totali e di pellet, con (+) o senza (-) F-actina, sono stati separati da SDS-PAGE e colorati con colorante Coomassie. ( C ) La lega αE-catenina (μM / μM actina) da A è stata plottata contro la catenina αE libera (μM) ei dati sono adatti ad un&#39;equazione della collina (linea rossa). Sono elencati i coefficienti K d , B max e Hill (h). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificazione di pellet di Actin </sTrong&gt; - diagramma di flusso. Questo schema descrive i punti chiave nella sezione 5, con esempi di campioni di Total e Pellet ( A , CE ) e la curva standard ( B ) utilizzata per la quantificazione. 5.13 passi: 1 ) Misura la quantità di proteine ​​di interesse nei campioni totali (A). 2 ) Generare una curva standard plottando l&#39;intensità della banda rispetto alla massa proteica (B). 3 ) Misurare la quantità di proteine ​​di interesse che co-sedimentate con F-actin ( C ). 4 ) Misurare la quantità di proteine ​​di interesse che vengono pelletate in assenza di F-actina ( D ). 5 ) Sottrai D da C per determinare la quantità di proteina legata all&#39;Actin F. 6 ) Misurare la quantità di F-actina in ogni pellet (E), calcolare la quantità media di F-actina per campione e dividere ogni campione per la media (i numeri riportati di seguito mostrano il rapporto). 7 )Per ogni campione, dividere la quantità di proteina legata (calcolata nella fase 5) dal rapporto di pellet F-actin (calcolato al punto 6) per regolare le differenze nel pellet. 8 ) Utilizzare la curva standard ( B ) per calcolare la quantità (massa) della proteina legata normalizzata in ciascun campione (passo 7). 9 ) Determinare la concentrazione di proteine ​​libere e proteine ​​legate per creare una curva di legame. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Questo protocollo descrive un metodo per testare la capacità di una proteina a co-sedimentare con l&#39;actina filamentosa (F-actina) e, se si osserva il legame, per misurare l&#39;affinità dell&#39;interazione.

La misurazione della legame proteico con F-actina mediante co-sedimentazione

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.4K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine.  Questo protocollo descrive un metodo per testare la capacità di una proteina a co-sedimentare con l'actina filamentosa (F-actina) e, se si osserva il legame, per misurare l'affinità dell'interazione. 

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Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Ricerca

Biochimica

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Sedimentazione equilibrio di una membrana Piccolo Oligomer-forming Proteine: Effetto di istidina protonazione su pentamerica stabilità

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Chimica

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biologia

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a consequence, for the clinical management of patients. In the present work we will describe an optimized proteomic approach for the identification of molecules involved in the progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). In detail, leukemic cell lysates are resolved by 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and visualized as &#8220;spots&#8221; on the 2DE gels. Comparative analysis of proteomic maps allows the identification of differentially expressed proteins (in terms of abundance and post-translational modifications) that are picked, isolated and identified by Mass Spectrometry (MS). The biological function of the identified candidates can be tested by different assays (i.e. migration, adhesion and F-actin polymerization), that we have optimized for primary leukemic cells.

Here we describe a protocol that couples two proteomic techniques, namely 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and Mass Spectrometry (MS), to identify differentially expressed/post-translational modified proteins among two or more groups of primary samples. This approach, together with functional experiments, allows the identification and characterization of prognostic markers/therapeutic targets.

Da un 2DE-Gel Spot Proteine ​​Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

Medicina

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

Valutazione rapida della qualità delle proteine di membrana mediante cromatografia fluorescente di esclusione dimensionale

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Saggio di sedimentazione basato sulla concanavalina A per misurare il legame del substrato delle fosfatasi glucane

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

Ricostituzione della motilità a base di actina con proteine disponibili in commercio

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

Bioingegneria

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZ polimerizzazione saggi: protocolli semplici e considerazioni

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Quantificazione delle interazioni proteiche basata sull'imaging di singole molecole su cellule vive

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Autore in primo piano: Valutazione della dinamica proteina-condensato in cellule umane vive

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

La misurazione della legame proteico con F-actina mediante co-sedimentazione

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Sedimentazione equilibrio di una membrana Piccolo Oligomer-forming Proteine: Effetto di istidina protonazione su pentamerica stabilità

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l'Analisi del Binding Protein a F-Actina

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

Da un 2DE-Gel Spot Proteine Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica

Valutazione rapida della qualità delle proteine di membrana mediante cromatografia fluorescente di esclusione dimensionale

Saggio di sedimentazione basato sulla concanavalina A per misurare il legame del substrato delle fosfatasi glucane

Ricostituzione della motilità a base di actina con proteine disponibili in commercio

FtsZ polimerizzazione saggi: protocolli semplici e considerazioni

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

La misurazione della legame proteico con F-actina mediante co-sedimentazione

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