Name: sedimentation equilibrium of a small oligomer-forming membrane protein: effect of histidine protonation on pentameric stability
Uploaded: 2015-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability at JoVE.com

This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.

Bu protokol daha fazla ayrıntı ve özel hususlar 3, 25-28 sevk edilecek olan aşağıdaki kaynaklara dayanmaktadır. 2, H2O ile deterjan miseller 1. Yoğunluk eşleştirme Not: tampon çözeltisi yoğunluklu deterjan miseller yoğunluğuna uyumlu olması gerekir. Ortak yoğunluk ayarlayıcı maddeler 2 H2O, H2 18 O, 2H 2 18 O, gliserol ve sakaroz 29 içerir. &#39;H 2 18 O 2 H2O ile aynı yoğunluğa sahiptir ve protein değiştirilebilir protonlar dötertumlanma istenmiyorsa, daha iyi bir seçim olabilir. Bu prosedürde, 50 mM Tris, pH 7.3, 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB) deterjan yoğunluğu, 100 mM NaCI 2 H2O ile uyumlu olacak Bir ilk tahmin olarak, aşağıdaki konsantrasyonlar2 H2O kullanılacaktır: 10, 30, ve% 50 hac / hac. 1.1. Örnek hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki stok çözeltileri ve filtre bir 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir sterilize hazırlanması: 50 ml, 500 mM Tris pH 7.3, 1 M NaCI (10 X tampon çözeltisi); 1 mi, 250 mM C14SB (50X deterjan çözeltisi). </li><li> 20 ul 10X tampon çözeltisi, 4 ul 50X deterjan çözeltisi, 20 ul 2 H2O (% 99.9) ve 156 ul karıştırılarak numune çözeltisinin 200 ul hazırlayın H 2 O deiyonize 20 ul 2 H2O (% 99.9) ve 160 ul, 20 ul 10X tampon çözeltisi karıştırılarak bir referans çözeltisi, 200 ul hazırlayın H 2 O deiyonize </li><li> Diğer 2 H2O konsantrasyonları için yineleyin 1.1.2, uygun 2 H2O ve H2O miktarlarını ayarlamaya,% 30 ve% 50, yani. </li></ol> 1.2. 6-kanal A MeclisiHücre içine UC hücreleri ve örnek yükleme. Not: Örnek yükleme yöntemine bağlı olarak EAA hücrenin iki türü vardır. Hücreler mühürlü sonra hücreler yüklenebilir dış dolgu ise dış dolgu olmadan Hücreler, hücre sızdırmazlık önce yüklenecek olan. Harici-dolgu AUC hücre Meclis, daha önce 3 tarif edilmiştir. Bu protokolde, dış dolgu olmadan 6-kanal EAA hücre montajı anlatılmıştır. Ana fark, ayrıca sıkılır her iki tarafta vida halkalar olmasıdır, ve (Şek. 1) muhafaza fişleri gerek yoktur. montaj aşamalarında fark aşağıda belirtilmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig1.jpg" /> Şekil 1. Harici dolgu olmadan 6-kanal EAA hücre görünümü patladı. Bu rakam Beckman Coulter An-50 Ti modifiye ve An-60 Ti Analyti olmuşturcal Rotor, Hücreler ve karşı ağırlıklar kullanım kılavuzu. <ol><li> Safir penceresinin yerine kuvars penceresinde (Şekil. 2) Her EAA hücre için iki pencere meclisleri hazırlayın. Pencere tutucu içine pencere conta yerleştirin. Biraz pencere astarı viraj ve boşluk pencere tutucu şafta karşısında oluşturacak şekilde pencere tutucu içine yerleştirin. Pencere tutucu yivli işareti hizalayarak, pencere liner içine safir penceresini yerleştirin. . Not: Bu tür bu yoğunluk eşleştirme deneyde olduğu gibi 30000 rpm üzerinde parazit ölçümleri, Bu nedenle yüksek hızda 28, 30 daha fazla ışık kırılma üretecek ve böylece kuvars cam sıkıştırılabilir ve safir camlar kullanılmaktadır. Bir safir cam kuvars penceresinden daha ağırdır ve yüzüne kazınmış bir &quot;X&quot; vardır. </li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig2.jpg" /> Şekil 2. patlamış görünümü of pencere montajı. Bu rakam Beckman Coulter An-50 Ti ve An-60 Ti Analitik Rotor, Hücreleri ve karşı ağırlıklar kılavuzdaki modifiye edilmiş <ol><li> Parça numarası baş aşağı hücre gövdesini yerleştirin. Konut tuşu ile uyumlu kama yatakları ile, (sol, Şek. 1) aşağı bakan pencere ile bir pencere montajı ardından, öncelikle hücre konut aşağı eğimli tarafı 6-sektör merkezinde içine kaydırın. </li><li> Hafifçe kat spinkote vida halka konuları ve vida halkası yıkama. Pencere montaj üstüne bir vida halka pulu yerleştirin. Dışında bakan kelime &quot;OUT&quot; pencere gövde içine vida halkası takın. Hücre hizalama aracını kullanarak vida halkası elle sıkın. </li><li> Tork anahtarı kullanarak, sadece 60 inç-pound vida halka sıkın. </li><li> Parça numarası dik ve 12-öğle saatlerinde konumlandırılmış olan hücreyi yerleştirin. LSol satır içine OAD 120 ul referans ve sağ satır içine 110 ul örnek. Her numune ve referans doğru eşleştirilmiş emin olun. Not: Tam numune hacmi kritik öneme sahip değildir, ancak örnek menisküs farklı olacak şekilde bir referans numunesi (5-10 ul) biraz daha fazla hacme sahip olması gerekir. </li><li> Dikkatle pencere (Şekil. 1, sağ) aşağı bakacak şekilde hücre gövdesi, bir pencere montaj içine kaydırın. Aşırı hücre rahatsız ve içeriğini dökmek için değil dikkat edin. </li><li> Adımı yineleyin 1.2. 3 ve 1.2. 4, 120 inç-pound ikinci vida sıkma halkasını. Hücreyi ters çevirin ve 120 inç-pound ilk vidalı halka yeniden sıkın. </li><li> , Rotor içine hücreleri yükleyin santrifüj içine rotor yüklemek ve üreticinin talimatlarına göre 28 monokromatörü yükleyin. Not: Bu st AyrıntılarAP, bu referansta 3 bulunabilir. </li></ol> 1.3. Girişim ölçümü kurma <ol><li> Kısaca şu aşamada özetlenebilir olacak üreticinin talimatlarına göre, EAA enstrüman için kullanıcı arabirimi yazılımını başlatın ve 3000 rpm&#39;de her hücre için lazer kurulum ve radyal kalibrasyonu yapın. </li><li> Yeterli bir vakum sonra 1.3.1.1 (&lt;100 mikron), 3000 rpm&#39;de santrifüj çalıştırmak ulaşıldı. Kullanıcı arayüzü yazılımı girişim deseni önizlemesini ve yüksek kontrast elde etmek için lazer parametrelerini ayarlamak. </li><li> &quot;Denge&quot; ve &quot;Girişim&quot; ölçüm belirterek | (Yeni Dosya Dosya) Yeni kurmak dosyası oluşturun. Bir sedimantasyon denge yöntemi (&quot;Yöntem&quot; düğmesi) 20 ° C&#39;de çalışma sıcaklığı, 45000 rpm veya daha yüksek hangisi protein örnekleri için beklenen en yüksek hızında çalışacak ve 1 tarama toplamak için her 15 dakikada ayarlayın. MonitoHeteroAnalysis veri dosyaları açma ve en az 12 saat sonra &quot;Maç&quot; fonksiyonunu seçerek r denge ilerleme (yaklaşık gecede Şekil. 3). Not: Benzer bir fonksiyonu da SEDFIT (Seçenekler | Yükleme Seçenekleri | Denge Test Yaklaşımı) mevcuttur. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig3.jpg" /> Şekil HeteroAnalysis Maç işlevi 3. Sonuç. Maç işlevi ardışık tarama ve son tarama arasındaki RMSD karşılaştırarak denge ilerlemesini izlemek için kullanılabilir. X ekseni asimptotik RMSD değerleri ile gösterildiği gibi bu örneğin 8 saat sonra denge elde edilmesini gösterir. 1.4. Veri analizi <ol><li> Numunelerin her bir grubu için, 2 H2O konsantrasyonuna karşı radyal dağılım profili eğimini çizilir. Not: Dağıtım çok sığ üstel o ap olacakyaklaşımlar çok doğrusallık. X ekseni ile kesişme noktasını eşleşen 2 H2O konsantrasyonuna karşılık gelir. </li><li> Daha doğru sonuçlar için, çeşitli çoğaltır deneyi gerçekleştirmek. Seçenek olarak ise, 2 H2O konsantrasyonunun daha dar bir aralık deneyi tekrar. </li></ol> C14SB miselleri içine SH 2. çökelme dengesi 2.1. Run parametreler <ol><li> SEDNTERP kullanarak tampon yoğunluk ve viskozite, protein kısmi spesifik hacim ve santrifüj hızı hesaplayın. D 2 O konsantrasyonu da dahil olmak üzere, &quot;Tampon Veri Seç&quot; bölümündeki tampon ve yoğunluk seçin Compute hesaplamak ve buna göre tampon bileşenleri girmek için. </li><li> 2.1.1.1 &quot;V-bar&quot; bölümünde protein kısmi spesifik hacim seçin Compute hesaplamak ve protein amino asit dizisini girin. &quot;N = Bu monomer bir oligomer olun&quot; en yüksek beklenen oligomerik boyutunu belirtinalan, bu durumda N = 5. ana penceresinde RPM alanındaki değerleri girerek hızını hesaplayın kadar σ ≈ 1; Bu radyal dağılım profili 25 iyi bir üstel şekli sağlamak için başparmak bir kuraldır. Not: Bu, aşağıdaki gibi deney için hesaplanan değerler olarak: ρ = 1,03839 g / ml, η = 1,0267 cP = 0,7569 ml / g arasında, ω 1 = 16000 rpm. </li><li> Bir hız ve sonraki 25 de dağıtım profili arasında yeterli fark sağlamak için takip sonraki hızları hesaplayın. Not: Bu da işlevinden yapılabilir hesaba çözüm sütunu (dolum hacmi) alır SEDFIT içinde, &quot;denge rotor işlevi hızlandırır tahmin&quot;. </li></ol> 2.2. Numune hazırlanmasına, <ol><li> 5 mM C14SB ile 1 ml referans solüsyonu ve% 32,3 2 H 2 O hazırlayın 100 ul 10X tampon Solutio karıştırarak yoğunluk eşleştirme deney (bölüm 1), belirlenen şekilden, (aşama 1.1.1), 20 ul 50X deterjan çözeltisi (aşama 1.1.1), 323 ul 2 H2O (% 99.9) ve 527 ul H2O deiyonize </li><li> Örneğin metanol veya% 50 h / h sulu asetonitril gibi uygun bir çözücü içinde, liyofilize edilmiş, HPLC ile saflaştırılmış, SH peptidleri (daha önce tarif edilen 31 ifadesi ve saflaştırılması) çözündürülür. Her bir seyreltilmiş bir 280 vermek üzere üç numune için bir mikrolitre ölçekli UV / Vis spektrometre ve kısım içinde çözülmüş peptidlerin A280 ölçümü, 12 mm = 0.3, 0.5 ve 0.8 (A 280, 10 mm = 0.25, 0.417 ve 0.67) 130 ul. Gecede örnekleri liyofilize ve tekrar süspansiyon 130 ul referans çözeltisi (adım 2.2.1) örnek çözümleri vermek. Not: Trp, Tyr ve kalıntılarını içerdiği için, SH proteini 280 nm&#39;de UV / Vis emme tespit edilebilir. Aromatik artıkların olmayan proteinler ya da müdahale ile, uygun bir kromofor ile etiketleyerek Bir Trp ihtiva eden mutant kullanılarak tespit edilebiliryerine absorbans ım ölçümleri. </li><li> Kuvars pencereli bir 6-kanal EAA hücre montajı bölüm 1.2 adımları izleyin. En yakın rotor merkezine rotor merkezi ve en düşük konsantrasyon numunesi (A 280, 12mm = 0.3) uzak (A 280, 12mm = 0.8) kanal yüksek konsantrasyon örneği yükleyin. </li></ol> 2.3. Absorbans ölçümleri ayarlama <ol><li> &quot;Denge&quot; ve &quot;Absorbans&quot; ölçümü belirterek | (Yeni Dosya Dosya) Yeni kurmak dosyası oluşturun. Dedektör dalga boyu olarak 280 nm belirtin. </li><li> Tek Tarama Radyal adım büyüklüğü = 0.01 cm, çoğaltır = 3 (düşük çözünürlükte, hızlı) ile örneğin, düşük çözünürlükte veri toplama belirterek, Tarama Seçenekleri &quot;ilk taramadan önce Radyal kalibrasyon&quot; kontrol ve yürüterek 3000 rpm&#39;de radyal kalibrasyon yapın . Tarama tamamlandıktan sonra, seçeneğinin işaretini kaldırın. </li><li> &quot;(Metho bir sedimantasyon denge yöntemi kurmak&quot;düğmesi) d 20 ° C&#39;de, adım 2.1.3 hesaplanan ilk hızda çalışacak ve 1 Tarama her 30 dakikada bir toplamak. Her hücrelerin &quot;Detay&quot;, adım 2.3.2 gibi düşük çözünürlükte veri toplama belirtin. En az 18 saat sonra &quot;Maç&quot; fonksiyonunu HeteroAnalysis veri dosyaları açma ve seçerek denge ilerlemesini izlemek (yaklaşık gecede, Şek. 4). Not: sonraki hızları daha az zaman alacak ise denge ulaşılması, ilk hız için önemli ölçüde daha uzun sürebilir. </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig4.jpg" /> HeteroAnalysis Maç işlevinden Şekil 4. sonuçları. Birinci ve ikinci hızları (sol üst ve sağ) dengeye ulaşmış görünüyor, ama emin olmak için bir kaç saat daha beklemek daha iyidir. Buna karşılık, üçüncü ve dördüncü hızları (alt sol ve sağ) açıkça dengeye ulaşmıştırdaha kısa sürede. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52404/52404fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Denge ulaşıldığında, Radyal adım büyüklüğü = 0.001 cm, çoğaltır = 10 (yüksek çözünürlüklü, yavaş) ile yüksek çözünürlükte, örneğin tek bir tarama toplamak. </li><li> Tarama tamamlandıktan sonra, bir sonraki hız için adım 2.3.3 ve 2.3.4 tekrarlayın. </li><li> Zaman, her hız için denge bilinen (hesaplanan veya deneyim) ulaşması için gerekli zaman İsteğe bağlı, her biri için dengeleme süre sonra 1 tarama toplamak için adım ve 2.1.3 hesaplanan tüm hızları dahil sedimantasyon denge yöntemi tarama kurmak hız. Bu durumda, her bir hücrelerin &quot;Detay&quot; yüksek çözünürlüklü veri toplama belirtin. </li></ol> 2.4. SEDFIT ve SEDPHAT Veri analizi Not: Daha fazla bilgi ve veri analizi okuyucu olarak hususlar için t denirwww.analyticalultracentrifugation.com: Aşağıdaki web o. <ol><li> Açık yüksek çözünürlüklü SEDFIT içinde taramalar (Veri | yük sedimantasyon denge verileri) ve 3 kanallar (; | Yükleme Seçenekleri | 3 Alt Grupları 6-kanal ham veri kaydetme Seçenekler bu farklı her bir örnek için konsantrasyonlara karşılık) veri bölünmüş. </li><li> Yeniden-açık SEDFIT aynı örnek ve aynı konsantrasyonda ancak farklı hızlarda ait veri dosyaları. Menisküs (dikey kırmızı çizgi), hücre alt (dikey mavi çizgi) ve montaj sınırları (dikey yeşil çizgiler) ayarlayın ve SEDPHAT kullanılmak üzere veri ihracat (Veri | SEDPHAT İhracat Verileri). Girdi istendiği gibi rotor türü ve merkezinde türü yanı sıra, adım 2.1.1 hesaplanan parametreler. Her numune ve konsantrasyon için bu adımı tekrarlayın. </li><li> SEDPHAT aynı örnekten tüm verileri (tüm konsantrasyonlar ve hızlar) açın ve Deney Parametreleri doldurun; Bir örnek, Şekil l&#39;de gösterilmiştir. 5. Not: D 2 O tamponu Deut ilave edildiğinde<html> Değiştirilebilir protonlar birleşmeleri T ciddi ölçüde suda çözünür proteinleri, protein moleküler ağırlığı değiştirebilir. Membran-gömülü bölgeler döviz korunur, çünkü zar proteinleri, SH proteini gibi özellikle küçük olanlar, daha az etkilenir. Bunu düzeltmek için, girişi &quot;D mol fraksiyonu tampon&quot;. Not: Bu aşamada menü Veri seçerek ayrı ayrı düzenlenmiş veri kümesi kaydetmek için tavsiye edilir | Yeni Yapılandırması Olarak Kopyala Tüm Veri ve Kaydet. </li><li> Bir Model seçin ve bu model için Küresel Parametreleri doldurun. Not: Örnek olarak, &quot;monomer-n-mer kendi kendine birleşmeme özelliği&quot; modeli ve parametreleri Şekil l&#39;de gösterilmektedir. 6. </li></ol><img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig5.jpg" /> Şekil 5. Deneysel Parametreler doldurmak için nasıl bir örnek. dosya / ftp_upload / 52.404 / 52404fig6.jpg &quot;/&gt; Şekil 6. Monomer-n-Mer Self-Dernek modeli için Küresel Parametreleri doldurmak için nasıl bir örnek. <ol><li> Menü Fit seçerek Küresel Fit çalıştırın | Küresel Fit ve fit yakınsak kadar bekleyin. Aşağı Not (veya bir ekran görüntüsü almak) uydurma sonuçlar, özellikle küresel azaltılmış ki-kare ve K adet bir günlük değerleri. Termodinamik Bilgileri Göster | sığdırma veri ve menü Kopyala ve Display montaj artıklar gibi diğer verileri ayıklayın. </li><li> Küresel Parametreler dönün ve (1) monomer molekül ağırlığı uyacak ve adım 2.4.5 tekrarlamak için M kontrol edin. Takılan molekül ağırlığı ve küresel azaltılmış ki-kare not edin. </li><li> Adımı yineleyin 2.4.3 her model test edilecek için 2.4.6 ve düşük küresel ki-kare değerinin yanı sıra montaj artıklar karşılaştırarak, her modelin uygun kalitesini karşılaştırmak için. Not: Küçük ve rastgele uydurma artıklar genelde iyi bir uyum gösterir, ve olur en uygun modeliküçük küresel azaltılmış ki-kare var. monte monomer molekül ağırlığı ve ki-kare değeri sabit (teorik) molekül ağırlığı bundan önemli ölçüde farklılık olmamalıdır. </li><li> İlk seçme İstatistik göre değer elde günlüğüne Ka için güven aralığı hesaplayın | Kritik hata yüzey projeksiyonları için ki-kare ve istenen güven aralığı girilerek. Günlük Ka için ki-kare değerleri elde etmek için Küresel Parametreleri iletişim Ka giriş 1-boyutlu hata yüzey projeksiyon oluşturun ve seçimini kaldırabilirsiniz | Sonraki İstatistik gidin. Not: okuyucular, bu yöntemin 33 yöntemi 32 yanı sıra illüstrasyon hakkında daha fazla bilgi için aşağıdaki kaynakları (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) başvurmaları önerilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+A+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).</li><li>Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+heterologous+protein-protein+interactions+using+analytical+ultracentrifugation.">Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation.</a> Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).</li><li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+for+association+and+assembly+the+study+of+protein.">Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li><li>MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+detection+for+the+XLI+analytical+ultracentrifuge.">Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge.</a> Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).</li><li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions+-+Methods+for+Detection+and+Analysis.">Protein-Protein Interactions - Methods for Detection and Analysis.</a> Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).</li><li>Alexandrov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+high-throughput+co-expression+of+protein+pairs.">A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).</li><li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterisation+and+functional+significance+of+transient+protein-protein+interactions.">Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions.</a> J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).</li><li>Ebel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+velocity+to+characterize+surfactants+and+solubilized+membrane+proteins.">Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins.</a> Methods. 54, 56-66 (2011).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+reversible+macromolecular+associations+via+sedimentation+equilibrium:+an+introduction.">Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction.</a> Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).</li><li>Dowell, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+is+an+important+cause+of+community-acquired+lower+respiratory+infection+among+hospitalized+adults.">Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults.</a> J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).</li><li>Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+respiratory+syncytial+virus+from+which+the+entire+SH+gene+has+been+deleted+grows+efficiently+in+cell+culture+and+exhibits+site-specific+attenuation+in+the+respiratory+tract+of+the+mouse.">Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse.</a> J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).</li><li>Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+respiratory+syncytial+virus+small+hydrophobic+protein.">Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein.</a> J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).</li><li>Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+respiratory+syncytial+viruses+with+deletions+in+the+NS1,+NS2,+SH,+and+M2-2+genes+are+attenuated+in+vitro+and+in+vivo.">Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo.</a> Virology. 273, 210-218 (2000).</li><li>Karron, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+(RSV)+SH+and+G+proteins+are+not+essential+for+viral+replication+in+vitro:+clinical+evaluation+and+molecular+characterization+of+a+cold-passaged,+attenuated+RSV+subgroup+B.">Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).</li><li>Whitehead, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+respiratory+syncytial+virus+bearing+a+deletion+of+either+the+NS2+or+SH+gene+is+attenuated+in+chimpanzees.">Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees.</a> J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).</li><li>Rixon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+hydrophobic+(SH)+protein+accumulates+within+lipid-raft+structures+of+the+Golgi+complex+during+respiratory+syncytial+virus+infection.">The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection.</a> J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).</li><li>Collins, P. L., Mottet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+orientation+and+oligomerization+of+the+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus.">Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus.</a> J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).</li><li>Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus:+comparison+between+antigenic+subgroups+A+and+B.">The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B.</a> J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).</li><li>Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+respiratory+syncytial+virus+SH+gene.">Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene.</a> J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).</li><li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+hydrophobic+protein+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+forms+pentameric+ion+channels.">The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li><li>Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein Sci. 17, 813-820 (2008).</li><li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Small+Hydrophobic+Protein+and+Structural+variations+in+a+bicelle+environment.">Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment.</a> J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).</li><li>Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+membrane+protein+molecular+weights+and+association+equilibrium+constants+using+sedimentation+equilibrium+and+sedimentation+velocity.">Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity.</a> Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).</li><li>Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation:+Sedimentation+Velocity+and+Sedimentation+Equilibrium.">Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium.</a> Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).</li><li>Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+membrane+protein+molecular+weight+using+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation.">Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+membrane+proteins+in+detergent+solution+by+analytical+ultracentrifugation:+Different+methods+for+density+matching.">Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching.</a> Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).</li><li>Laue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+20.3.">Ch. 20.3.</a> Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).</li><li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Small+Hydrophobic+Protein+Of+The+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Forms+Pentameric+Ion+Channels.">The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li><li>Bevington, P. R., Robinson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).</li><li>Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+equilibrium+analysis+of+recombinant+mouse+FcRn+with+murine+IgG1.">Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1.</a> Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).</li><li>Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+simultaneous+homo-oligomeric+size+determination+and+monodispersity+conditions+for+membrane+proteins.">A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins.</a> Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).</li><li>Montserret, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+structure+and+ion+channel+activity+of+the+p7+protein+from+hepatitis+C+virus).">NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus).</a> J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).</li><li>Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation+Studies+of+the+Influenza+M2+Homotetramerization+Equilibrium+in+Detergent+Solutions.">Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions.</a> Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).</li><li>Sorkin, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+endocytosis:+Close+encounters+of+many+kinds.">Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).</li><li>Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışma, numune hazırlama ve denge sedimantasyon kullanılarak deterjan küçük bir zar proteini oligomerizasyon analizi için bir deney protokolü sağlar. yoğunluk eşleme aşaması gerekli değildir olarak açıklanan protokol, aynı derecede geçerlidir -ve çözünür proteinler için simpler- olup. Gerçekten de, deterjanlar ve proteinin bir karışımından teşekkül eder. Parçacık flotasyon katkıda bulunmaz, böylece sedimantasyon çalışmalar yapmak, deterjan yerçekimi alanına görünmez olmalı...

Analitik Ultrasantrifügasyon 1-5, fizyolojik koşullar altında makromoleküllerin etkileşimleri incelemek zayıf ve güçlü etkileşimler hem erişilebilir olmasının en önemli yöntemlerden biridir. yöntem etiketi içermez ve ışık emiliminin veya girişim kullanır ve hatta floresan optik sistemler büyüklüğü 6 birkaç düzeyleri üzerinde konsantrasyon aralıkları ulaşmak için kullanılabilir. En biyokimyasal işlemler tersine etkileşimine bağlıdır, bu yöntem özellikle faydalıdır. Bu etkileşimlerin stoikiometri ve gücü kantitatif biyolojik süreçleri anlamak için karakterize lazım, ve bir dizi yöntem, bu amaçla 7, 8 için var. Bununla birlikte, geçici etkileşimler 9 çalışma zordur. makromoleküler etkileşimleri tanımlamak için bir yöntem seçimi statik veya dinamik doğasına bağlıdır. İlk durumda, Sedim<html> yönelimi hızı (SV) radyal ulaşım oranı ölçülür ve kompleksleri yüzer kütle ve şekil farklılıkları esasında kesirleştirilmiştir yerlerde kullanılır. Buna karşılık, deney zaman ölçeği üzerinde ters çevrilebilir dinamik dernekler fiziksel ayrılamaz. Bu durumda, kendi kendine ya da kovalent olmayan etkileşimlerin neden hetero etkileşimleri toplam protein konsantrasyonuna bağlı olan bir denge içindedir. Bu dinamik etkileşimler sedimantasyon denge (SE) ve sedimantasyon hızı (SV) 10 hem ele alınabilir. Bununla birlikte, birinci yöntem gerçekleştirmek için basit ve burada tarif edilmiştir. Bir denge difüzyon ve çökelme ile ulaşılır, böylece SE olarak, santrifüj, yeterince düşük bir hızda gerçekleştirilir. Bu noktada her iki radyal mesafenin bir fonksiyonu olarak, bir optik işaret (UV-VIS) denge profili, dernekler 11 için önceden belirlenmiş bir termodinamik modeller kullanılarak analiz edilebilir. ve_content &quot;&gt; Bu yazıda, bir sedimentasyon dengeleme çalışması nedeniyle hidrofobisite. iyon kanallarını oluşturur viral zar proteininin kendi kendine birleşmeme özelliği sunulmuştur deney deterjan varlığında gerçekleştirilir, ve bu durumda yoğunluk olduğu Çözücü deterjan edilene uyumlu olması gerekir. Bununla birlikte, protokol solvent yoğunluk eşleme gerekli olacaktır, bunun dışında, suda çözünür protein halinde olur aynı tanımladı. kullanılan protein, insan solunum sinsisyal virüsü (hRSV), alt solunum yolu bebeklerde hastalığı, yaşlılar ve bağışıklık popülasyonları Dünya çapında 12 neden Paramyxoviridae ailesinden bir zarflı Pneumovirus kodlanmıştır. HRSV enfeksiyonu kadar 64 milyon bildirilen vaka ve ölüm 160,000 her yıl meydana gelir. hRSV genom üç membran proteinleri, F, G ve küçük hidrofobik (SH) dahil olmak üzere 11 proteinleri transkripsiyonunu yapar. SH proteini katılırRSV enfeksiyonu patogenezinde. SH gen (RSVΔSH) eksik RSV mümkün olduğunu sinsitiyumların oluşmasına neden ve vahşi tip (WT) virüsü 13-16 kadar büyüdü. Bununla birlikte, RSVΔSH virüsü üst solunum yolu 15, 16 WT daha az verimli bir şekilde 10-kat çoğaltılır. Ayrıca, RSVΔSH virüs in vivo fare ve şempanze modelleri 13, 17 in zayıflatılmış oldu. SH proteini 64 (RSV alt grup A) veya 65 (RSV alt grup B) amino asitler, uzun türü Golgi 18 zarlarına çoğunlukla birikir II integral membran proteinidir. SH proteini, tek bir yüksek 20,21 korunmuş bir sarmal transmembran (TM) etki 19 tahmin vardır. C- ve N-terminal extramembrane etki lumenally / hücre dışı ve sitoplazmik sırasıyla yönlendirilir. Hem sentetik TM domeni (kalıntılar 18-43) Ve tam uzunlukta SH proteini deterjanların çeşitli homopentamers oluşturmak için gösterilmiştir. homopentameric bir şekilde düzlemsel bir lipid çift tabakaları 22,23 kanal aktivitesi için sorumludur. Lipit TM monomerlerin doğru yönlendirme ilk His-22, bir lümene ilişkin olması yakın yönde arası sarmal için gösterdi alana özel kızılötesi dikroizma 23 kullanılarak belirlenmiştir. Aynı TM domeni yönü (DPC) dodesilfosfokolin olarak pentamerik proteinin tam uzunluğunun bir sarmal demeti yeniden 22 miseller NMR çalışmaları ile teyit edilmiştir. Bu &#39;misel&#39; modelinde, tek bir a-helis TM domeni bir genişletilmiş B-hairpin C-terminal a-helisin göre N-terminal olarak sınırlanan ve edilmiştir. SH proteininin iki protonize kalıntıları, His-22 ve His-51, TM domeni (lumenally yönelimli) bulunur ve extramembrane C-terminali β firketenin ucunda sırasıyla (kadar kanal gözeneğinden). Bir bicellar Çevreyinment, ancak TM α-heliks His-51 kadar uzanır ve her ikisi de His artığı kanalı 24 lümenine erişilebilir. 22 hidrofobik yan zincirler (Ile-32, Ile-36, Ile-40 ve Leu-44), ve kaplı olan kanal yapısı, bir huni benzeri bir mimari 22 dar bölümün benimser (Cys-45, Ser-29) Ile-36 kanal lümen dar noktasını tanımlar. His-51 küçük açıklığın ucunda ise His-22, bu huni büyük açıklık yer almaktadır. Bu yazıda, bir sedimantasyon denge modunda analitik santrifüj O&#39;nun protonlanma SH, protein pentamerin istikrar etkiler olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Bu durumda, SH protein, literatürde bu SH protein yapılarını pentamerik oligomerler 22 göstermek için daha önce kullanılmış olan C14-betain deterjan içinde çözünmüştür.

<table><tbody><tr><td>3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate</td><td>Sigma</td><td>T0807</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide 99.8%</td><td>Cambridge Isotope</td><td>DLM-4-99.8</td><td></td></tr><tr><td>An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place</td><td>Beckman Coulter</td><td>361964</td><td></td></tr><tr><td>Cell housing</td><td>Beckman Coulter</td><td>334784</td><td></td></tr><tr><td>12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled</td><td>Beckman Coulter</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>Window holder</td><td>Beckman Coulter</td><td>305037</td><td></td></tr><tr><td>Window gasket</td><td>Beckman Coulter</td><td>327021</td><td></td></tr><tr><td>Window liner</td><td>Beckman Coulter</td><td>362329</td><td></td></tr><tr><td>Sapphire window</td><td>Beckman Coulter</td><td>307177</td><td></td></tr><tr><td>Quartz window</td><td>Beckman Coulter</td><td>301730</td><td></td></tr><tr><td>Screw-ring washer</td><td>Beckman Coulter</td><td>362328</td><td></td></tr><tr><td>Screw ring</td><td>Beckman Coulter</td><td>301922</td><td></td></tr><tr><td>Spinkote</td><td>Beckman Coulter</td><td>306812</td><td></td></tr><tr><td>Torque stand assembly</td><td>Beckman Coulter</td><td>361318</td><td></td></tr><tr><td>Counterbalance</td><td>Beckman Coulter</td><td>360219</td><td></td></tr><tr><td>Cell alignment tool</td><td>Beckman Coulter</td><td>362340</td><td></td></tr><tr><td>SEDNTERP</td><td></td><td></td><td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td></tr><tr><td>HeteroAnalysis&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td></tr><tr><td>SEDFIT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation&lt;br/&gt; .com/sedfit.htm</td></tr><tr><td>SEDPHAT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation&lt;br/&gt; .com/sedphat/default.htm</td></tr></tbody></table>

sedimentation equilibrium of a small oligomer-forming membrane protein: effect of histidine protonation on pentameric stability

Analitik ultrasantrifügasyon, (EAA) etkileşim kuvvetleri geniş bir aralıkta ve fizyolojik koşullar altında, makro moleküller arasındaki tersine çevrilebilir etkileşimler üzerinde çalışmak için de kullanılabilir. Bu AUC&#39;sini nicel stoikiyometri ve homo ve biyokimyasal süreçlerde geçici ve geri dönüşümlüdür hetero-Dernek termodinamik değerlendirmek için bir seçim yöntemi yapar. Sedimantasyon denge yöntemi (SE) &#39;de, difüzyon ve çökelme arasında bir denge, belirli bir ilişki modeline bağlıdır radyal mesafenin bir fonksiyonu olarak, bir profil sağlar. Burada detaylı bir GD protokolü bir analitik ultrasantrifüj kullanarak küçük bir zar proteini oligomerin boyut ve monomer ilişki enerjisini tespit etmek üzere tarif edilmiştir. AUC-ES sadece fiziksel ilkelere dayalı, etiket-ücretsiz, ve hem suda çözünür ve membran proteinleri kullanılabilir. Bir örnek ikincisinin gösterilir, insan solunum sinsisyal virüsü küçük hidrofobik (SH) proteini (hRSV), Pentamerik iyon kanallarını oluşturan tek bir α-sarmal transmembran (TM) etki alanı ile 65-amino asit polipeptit. NMR tabanlı yapısal veriler SH proteini kanalının lümen bakan yönlendirilmiş olan zar ötesi etki protonlaştırılabilir iki His kalıntılarını sahip olduğunu göstermektedir. SE deneyleri pH dernek sabiti ve SH protein oligomerik boyutunu nasıl etkilediğini belirlemek için tasarlanmıştır. Pentamerik bir şekilde her durumda muhafaza ederken, bunun birleşme sabiti düşük pH değerinde indirgendi. Bu veriler, SH proteinde iki His tortularının bir lümene ilişkin yönlendirme ile tutarlı SH kanal aktivitesi için gözlenen benzer bir pH bağımlılığı ile uyum içindedir. ikincisi, düşük pH elektrostatik itme ve düşük oligomer istikrarı karşılaşabilirsiniz. Fizyolojik koşullarda ince, protein-protein ilişki değişiklikler hakkında niceliksel bilgi olarak ölçülmesi için her Özetle, bu yöntem uygulanabilir.

50 mM Tris, C14SB deterjan miseller radyal dağılım profili, 100 mM NaCI, pH 7.3 formları doğrusal modeli (Şekil 7A) monte edilebilir, çok sığ bir üslü. Bu dağılım eğimi ters D 2 O konsantrasyonu (Şekil 7B) ile korele edilir. eğim sıfır olduğu nokta, eşleştirme D 2 O konsantrasyonu,% 32.3 olarak bulunmuştur, yani. Aşağıda Şekil 7 Bkz. Aynı deney f...

Watch this Scientific Journal Video about Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability at JoVE.com

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Küçük oligomer oluşturan Membran Protein Sedimantasyon Denge: pentameric İstikrar Histidine Protonasyon Etkisi

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

sedimentation-equilibrium-small-oligomer-forming-membrane-protein

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Acids and Bases

SCIENTISTS IN ACTION

10.5K Görüntüleme.  Nanyang Technological University. Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Video: Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue located at or near the N-terminus of a helix is often more acidic than that at or near the C-terminus 1-6. Although extensive experimental studies on the acid-base properties of peptides have been carried out in the condensed phase, in particular in aqueous solutions 6-8, the results are often complicated by solvent effects 7. In fact, most of the active sites in proteins are located near the interior region where solvent effects have been minimized 9,10. In order to understand intrinsic acid-base properties of peptides and proteins, it is important to perform the studies in a solvent-free environment.
We present a method to measure the acidities of oligopeptides in the gas-phase. We use a cysteine-containing oligopeptide, Ala3CysNH2 (A3CH), as the model compound. The measurements are based on the well-established extended Cooks kinetic method (Figure 1) 11-16. The experiments are carried out using a triple-quadrupole mass spectrometer interfaced with an electrospray ionization (ESI) ion source (Figure 2). For each peptide sample, several reference acids are selected. The reference acids are structurally similar organic compounds with known gas-phase acidities. A solution of the mixture of the peptide and a reference acid is introduced into the mass spectrometer, and a gas-phase proton-bound anionic cluster of peptide-reference acid is formed. The proton-bound cluster is mass isolated and subsequently fragmented via collision-induced dissociation (CID) experiments. The resulting fragment ion abundances are analyzed using a relationship between the acidities and the cluster ion dissociation kinetics. The gas-phase acidity of the peptide is then obtained by linear regression of the thermo-kinetic plots 17,18.
The method can be applied to a variety of molecular systems, including organic compounds, amino acids and their derivatives, oligonucleotides, and oligopeptides. By comparing the gas-phase acidities measured experimentally with those values calculated for different conformers, conformational effects on the acidities can be evaluated.

The determination of the gas-phase acidities of cysteine-containing oligopeptides is described. The experiments are performed using a triple quadrupole mass spectrometer. The relative acidities of the peptides are measured using collision-induced dissociation experiments, and the quantitative acidities are determined using the extended Cooks kinetic method.

Oligopeptidlerin Gaz fazlı asitliğe belirlenmesi

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

Kimya

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Biyomühendislik

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.

Channels for the transportation of water molecules in enzymes influence active site solvation and catalysis. Herein we present a protocol for the engineering of these additional catalytic motifs based on in silico computer modeling and experiments. This will enhance our understanding of the influence of solvent dynamics on enzyme catalysis.

Membran Enzim Solvent Dynamics Bağlı çözülüyor Entropic Oranı İvme

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Biyokimya

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve classes of intrinsically disordered proteins (IDPs) to reduce oxidative and osmotic stress. This article uses a combination of capillary gel electrophoresis (CGE) and mobility shift affinity electrophoresis (ACE) in order to describe the binding behavior of different conformers of the IDP AtHIRD11 from Arabidopsis thaliana. CGE is used to confirm the purity of AtHIRD11 and to exclude fragments, posttranslational modifications, and other impurities as reasons for complex peak patterns. In this part of the experiment, the different sample components are separated by a viscous gel inside a capillary by their different masses and detected with a diode array detector. Afterward, the binding behavior of the sample towards various metal ions is investigated by ACE. In this case, the ligand is added to the buffer solution and the shift in migration time is measured in order to determine whether a binding event has occurred or not. One of the advantages of using the combination of CGE and ACE to determine the binding behavior of an IDP is the possibility to automate the gel electrophoresis and the binding assay. Furthermore, CGE shows a lower limit of detection than the classical gel electrophoresis and ACE is able to determine the manner of binding a ligand in a fast manner. In addition, ACE can also be applied to other charged species than metal ions. However, the use of this method for binding experiments is limited in its ability to determine the number of binding sites. Nevertheless, the combination of CGE and ACE can be adapted for characterizing the binding behavior of any protein sample towards numerous charged ligands.

This protocol combines the characterization of a protein sample by capillary gel electrophoresis and a fast-binding screening for charged ligands by affinity capillary electrophoresis. It is recommended for proteins with a flexible structure, such as intrinsically disordered proteins, to determine any differences in binding for different conformers.

AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the investigation of biological materials, biofuel processing, and bio-inspired materials covering nanometer to micrometer length scales. The methods presented here for investigating physical properties (i.e., size and shape) of membrane proteins (here, MmIAP, an intramembrane aspartyl protease from Methanoculleus marisnigri) in solutions of micelle-forming detergents are well-suited for this small-angle neutron scattering instrument, among others. Other biophysical characterization techniques are hindered by their inability to address the detergent contributions in a protein-detergent complex structure. Additionally, access to the Bio-Deuteration Lab provides unique capabilities for preparing large-scale cultivations and expressing deuterium-labeled proteins for enhanced scattering signal from the protein. While this technique does not provide structural details at high-resolution, the structural knowledge gap for membrane proteins contains many addressable areas of research without requiring near-atomic resolution. For example, these areas include determination of oligomeric states, complex formation, conformational changes during perturbation, and folding/unfolding events. These investigations can be readily accomplished through applications of this method.

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

This protocol demonstrates how to obtain a low-resolution ab initio model and structural details of a detergent-solubilized membrane protein in solution using small-angle neutron scattering with contrast-matching of the detergent.

Kontrast eşleştirme deterjan küçük açı Nötron saçılma deneylerde membran proteini yapısal analiz ve Ab Initio modelleme

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and enzyme-substrate interactions. Among its many benefits, HDX-MS consumes only small amounts of material, can be performed under near native conditions without the need for enzyme/substrate labeling, and can provide spatially resolved information on enzyme conformational dynamics&#8722;even for large enzymes and multiprotein complexes. The method is initiated by the dilution of the enzyme of interest into buffer prepared in D2O. This triggers the exchange of protium in peptide bond amides (N-H) with deuterium (N-D). At the desired exchange time points, reaction aliquots are quenched, the enzyme is proteolyzed into peptides, the peptides are separated by ultra-performance liquid chromatography (UPLC), and the change in mass of each peptide (due to the exchange of hydrogen for deuterium) is recorded by MS. The amount of deuterium uptake by each peptide is strongly dependent on the local hydrogen bonding environment of that peptide. Peptides present in very dynamic regions of the enzyme exchange deuterium very rapidly, whereas peptides derived from well-ordered regions undergo exchange much more slowly. In this manner, the HDX rate reports on local enzyme conformational dynamics. Perturbations to deuterium uptake levels in the presence of different ligands can then be used to map ligand binding sites, identify allosteric networks, and to understand the role of conformational dynamics in enzyme function. Here, we illustrate how we have used HDX-MS to better understand the biosynthesis of a type of peptide natural products called lanthipeptides. Lanthipeptides are genetically encoded peptides that are post-translationally modified by large, multifunctional, conformationally dynamic enzymes that are difficult to study with traditional structural biology approaches. HDX-MS provides an ideal and adaptable platform for investigating the mechanistic properties of these types of enzymes.

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Lanthipeptide synthetases catalyze multistep reactions during the biosynthesis of peptide natural products. Here, we describe a continuous, bottom-up, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) workflow that can be employed to study the conformational dynamics of lanthipeptide synthetases, as well as other similar enzymes involved in peptide natural product biosynthesis.

Peptit Biyosintetik Enzimleri Araştırmak için Hidrojen-Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi (HDX-MS) Platformu

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...