This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).

Etik bildirimi: Lassa Ateşi hastalarının Tulane Üniversitesi, Harvard Üniversitesi, Broad Enstitüsü, Irrua Uzmanı Eğitim Hastanesi (ISTH), Kenema Devlet Hastanesi (KGH), Sağlık, Ibadan Oyo Devlet Bakanlığı insan denekler komiteleri tarafından onaylanan protokolleri kullanarak bu çalışmaya alındı , Nijerya ve Sağlık Sierra Leone Bakanlığı. Tüm hastalar bakım benzer bir standart ile muamele edildi ve çalışmaya katılmak için karar olup olmadığını ilaç Ribavirin, sunuldu. Lassa Ateşi (LF) hastalarda, Ribavirin ile tedavi şu anda tavsiye edilen kurallar takip ve genellikle kısa sürede LF kuvvetli şüphe gibi sunuldu. Nedeniyle Ebola virüsü Hastalığı (EVD) şiddetli salgın, hasta standart protokoller yoluyla razı olamazdı. EVD hastaların klinik aşırı örneklerin yerine kullanılması değerlendirilir ve Sierra Leone ve Harvard Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylandı. OffiSierra Leone Etik ve Bilimsel İnceleme Komisyonu, Sağlık ve Sanitasyon Sierra Leone Bakanlığı ve İnsan Deneklerin Kullanımına İlişkin Harvard Komitesi ce sırası ve hasta ve temas örneklerinden elde edilen kamuya açık viral dizileri yapmak için rıza bir feragat verdiğinizi Sierra Leone Ebola salgını sırasında toplanan. Bu organlar da salgın yanıt sırasında bakım alma tüm şüpheli EVD hastalardan toplanan de tanımlanan örnekler için klinik ve epidemiyolojik verilerin kullanımını verdi. Sağlık ve Sanitasyon Sierra Leone Bakanlığı da salgın örneklerinin genomik çalışmalar için geniş Enstitüsü ve Harvard Üniversitesi&#39;ne Sierra Leone bulaşıcı olmayan, biyolojik olmayan örneklerin gönderiler onayladı. Örnek RNA (Toplam RNA Çıkarılan kadar 55 ul ~ 4 saat) 1. DNaz tedavi <ol><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, bir biyo-güvenlik kabini, buz üzerinde 96 oyuklu bir plaka içerisinde, PCR DNaz reaksiyonu başlatacak </strong&gt; 1.1 (toplam hacim 70 ul / kuyucuk) Adım. Not: Bir ana karışımı hazırlanmış olabilir. </li><li> Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> RNA Katı Faz Döner İmmobilizasyonu (SPRI) boncuk kullanılarak Temizleme. <ol><li> Sıcak RNA taneleri oda sıcaklığında 30 dakika için. </li><li> Yavaşça yerleşmiş olabilir herhangi bir manyetik parçacıkların tekrar süspansiyon RNA boncuk şişe çalkalanır. DNaz ile muamele edilmiş RNA (70 ul) RNA tanelerin 1.8x hacmi (126 ul) ilave, pipetle 10 kere karıştırmak ve (iyi, 196 ul toplam hacim) oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> Manyetik istasyonunda karışımı yerleştirin. (- 10 dk 5) temizlemek için çözüm bekleyin. </li><li> ise pipet ve artıklar ile istasyonda temizlenir çözüm çıkarın. istasyonda da,% 70 etanol ile pelet içeren boncuk yıkama ve 1 dakika boyunca inkübe edin. Pipet ve ıskarta ile etanol çıkarın. İki yıkamadan toplam tekrarlayın. Not: tam olarak% 70 taze hazırlanmış et kullanılmasınumunenin 7 kaybına neden olabilir &lt;% 70 etanol ise daha yüksek bir yüzdesi, küçük ölçekli moleküllerin verimsiz yıkama neden olacaktır olarak HANOL, kritik öneme sahiptir. </li><li> istasyonunda plaka tutun ve kurumaya açık bırakın. Not: boncuk çatlamak başlayana kadar boncuklar tamamen kurumasını bekleyin emin olun. </li><li> RNA elüte etmek için plakaya nükleaz içermeyen su 55 ul ekle. iyice pipetleme boncuk ve su karışımı istasyonundan plakasını sökün. Not: Alternatif olarak, toplam RNA konsantre etmek için (10 ul ≤) daha az su kullanın. </li><li> geri istasyonunda plaka koyun. çözüm uzun süreli depolama için yeni vidalı kapaklı tüp pipet ile transfer temizler kadar bekleyin (-80 ° C). tükenmesi için yeni 96-PCR plaka 5 ul RNA yerleştirin (adım. 2.4). </li><li> İsteğe bağlı. Kaydedin ve rRNA QRT-PCR için 19 ul su (1:20) 1 ul seyreltik (örneğin, 18S, 28S rRNA) (Tablo 2) ve viral belirteçler 5 &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> Viral RNA Numune gelen Ribosomal ve Taşıyıcı RNA 2. Seçici tükenmesi (~ 4 saat) <ol><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi lineer akrilamid taşıyıcı ile 5x hibridizasyon ve 10x RNase H, reaksiyon tamponları ve nükleaz içermeyen su sağlayın. </li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, bir 96-yuvalı PCR plaka buz üzerinde rRNA tükenmesi oligolar (Tablo 3) ve oligo (dT) RNA birleştirerek melezleştirme reaksiyonu ayarlayın. Not: Bir ana karışımı hazırlanmış olabilir. Özel bir sentetik RNA (ERCCs 8) 50 femtogram (FG), viral sıralama işlemi ve potansiyel indeksi okunur çapraz kontaminasyonu iki izleme için ilave edilebilir. <ol><li> Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. saniyede -0.1 ° C de 45 ° C, 2 dakika, yavaş rampa 95 ° C&#39;de inkübe edin. 45 ° C &#39;de PCR Pause. </li></ol></li><li> açıklandığı gibi buz üzerinde RNaz H reaksiyon karışımı kurmakTablo 1 &#39;de D, daha sonra 2 dakika boyunca 45 ° C&#39;de ısıtın. Not: Bir ana karışımı hazırlanmış olabilir. <ol><li> 45 ° C &#39;de PCR plakası tutarken plaka melezleştirme reaksiyonu, önceden ısıtılmış RNase H karışımı ekleyin. </li><li> 8 kez - Nazik pipetleme 6 ile iyice karıştırın. 30 dakika daha 45 ° C&#39;de inkübe edin. buz üzerine yerleştirin. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde DNaz Reaksiyon karışımı ayarlama Not:. Bir ana karışımı hazırlanabilir. <ol><li> plaka RNaz H reaksiyonuna ekleme, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 5 ul 0.5 M EDTA ilave ederek DNase reaksiyonu durdurun. Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. </li></ol></li><li> Bir 1.8x hacmi (144 ul) boncuk kullanılarak RNA boncuk (adım 1.3) kullanılarak Temizleme. nükleaz içermeyen su 11 ul Zehir. Not: Güvenli soğuk hava deposu, mağaza RN tükenmişBir numuneler -80 ° C Ç / N. </li></ol> 3. cDNA Sentezi (~ 6 saat) <ol><li> Karışım rRNA / 96 oyuklu bir plaka, PCR buz üzerinde rastgele primerler taşıyıcı tükenmiş RNA Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. <ol><li> bir PCR, 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;ye kadar karışım ısıtılır. 5 dakika - hemen ısı denatürasyon sonra, 1 buz üzerinde RNA yerleştirin. RNA önce ilk iplikli tepki daha uzun 5 dakika boyunca (hatta buz üzerinde) durmasına izin vermeyin. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde birinci sarmal sentezi, reaksiyon karışımı ayarlayın. Not: Bir ana-mix hazırlanmış olabilir. <ol><li> plaka RNA / rastgele primer karışımı ekleyin, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. 10 dakika boyunca 25 ° C&#39;de - 22 C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 60 dakika boyunca bir hava kuluçka makinesi içinde 55 ° C&#39;de inkübe edin. Tepkimeyi sonlandırmak için buz üzerinde plaka koyun. DeğilE: Hava kuluçka kullanımı primerleri tavlama ve ilk şerit uzunlamasına başlar sırasında birinci dal reaksiyonu yavaş yavaş ısınmaya oluşturmak için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde ikinci sarmal sentezi, reaksiyon karışımı ayarlayın. Not: Bir ana-mix hazırlanmış olabilir. <ol><li> plaka birinci sarmal sentezi, reaksiyon ekleme, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. 16 ° C (25 ° C &#39;de kapağı tutmak) 2 saat süreyle inkübe edin. sıcaklığın 16 ° C&#39;nin üzerine çıkmasına izin vermeyin. </li><li> daha sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüj, yumuşak ve iyice karıştırın, 0.5 M EDTA, 5 ul ekleyerek reaksiyonu inaktive, buz üzerinde plaka koyun. </li></ol></li><li> boncuklar 1.8x hacmi (153 ul) kullanılarak DNA boncuk (protokolü için adım 1.3) ile Temizleme. Elüsyon tamponu 9 ul (EB) &#39;de Zehir. ölçümü için 1 ul kaydedin. subseque için cDNA 1 ng kullanımınt adımlar. cDNA konsantrasyonu tespit tagmentation için cDNA 4 ul kullanmak için çok düşük ise (adım 4.1). </li><li> Güvenli soğuk hava deposu, mağaza at cDNA çift sarmallı 4 ° CO / N veya -20 Uzun süreli depolama için ° C. </li></ol> 4. Kütüphane Hazırlık - DNA Kütüphane İnşaatı (~ 4 saat) <ol><li> Gerekirse, 96 oyuklu bir plakaya transfer cDNA 4 ul ve bir ikinci girişimde kalan cDNA kaydedin. </li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde tagmentation reaksiyonu ayarlayın. Not: Bir ana-mix hazırlanmış olabilir. arka plan ve genel maliyeti azaltmak için, tagmentation reaksiyonun toplam hacmi 20 ila 10 ul arasında azaltılır. CDNA, kısıtlayıcı bir faktör olduğu için, reaksiyonda kullanılan ATM (yani, transposome) miktarı, aynı zamanda entegrasyon sitelerinden sayısını azaltmak için azaltılır. <ol><li> 1 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 280 xg&#39;de yavaşça ve iyice ve santrifüj plaka, girdap cDNA için tagmentation karışımı ekleyin.10 ° C&#39;de tutun 5 dakika boyunca 55 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir kez 10 ° C&#39;de hemen reaksiyonu sona erdirmek için nötralize Tagment tamponu (NT) 2.5 ul ekle. yukarı pipetleme karıştırın ve aşağı, sonra 1 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 280 xg&#39;de santrifüj. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde PCR amplifikasyon reaksiyonu ayarlayın. <ol><li> Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edilen koşullar kullanılarak ısıl PCR gerçekleştirin. Not: PCR 12 çevrim tagmented cDNA 1 ng önerilmektedir; Ancak, viral klinik örneklerin çoğu kez cDNA belirlenemeyen miktarda var. cDNA (&lt;1 ng) düşük miktarlar için, sıralama için yeterli bir kütüphane oluşturmak için PCR 18 döngü kadar kullanabilirsiniz. </li></ol></li><li> Kütüphane Hazırlık - temizleme ve sıralama için havuzu <ol><li> EB ile 50 ul örnek getirin. </li><li> ile Temizleme0.6x hacmi (30 ul) boncuk kullanılarak DNA boncukları (protokolü için adım 1.3). 15 ul EB Zehir. </li><li> Bölge analizinden astar dimerleri (~ 120 bp) hariç Bioanalyzer yazılımını 9 kullanarak bölge analizi (150 bp 1,000) yaparak kitaplığı (Şekil 3) konsantrasyonunu belirlemek. Not: Alternatif olarak, qPCR kütüphaneleri 10 ölçmek için kullanılabilir. </li><li> 1 nM ya da daha düşük mol konsantrasyonda Havuz kütüphaneleri. Kütüphane 1 nM altında ise bu kütüphanelerden dizi bilgileri yakalamak için havuz (diğer kütüphanelerin ~ 1x hacmi) için kütüphaneye küçük bir hacim kazandırmak. </li><li> Yukarıda belirtildiği gibi 0.7x DNA boncuklar ile temizleme havuzu (bkz: adım 2). 15 ul EB Zehir. Not: tanelerin hacmi havuzunda nihai hacmine bağlı olacaktır. </li><li> Havuz 9 analiz edin. Bölge analizi (150 bp 1,000) 9 yaparak molar konsantrasyonunu belirlemek. Not: Alternatif olarak, qPCR kütüphanesi havuz 10 &lt;ölçmek için kullanılabilir/ Sup&gt;. </li><li> Çift barkod 11 okur ile 101 bp oluşturmak için 22:00 kütüphane konsantrasyonda yük sequencer, paired-end okur. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54117/54117fig3.jpg" /> Ebola virüsü Klinik Örneklerden inşa 3. Kütüphaneler Şekil. 4 temsilci Ebola virüsü (EboV) kütüphanelerin Jel görüntüsünü. Kütüphane ve astar dimerleri Bölgeler gösterilmiştir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Stremlau, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+rhabdoviruses+in+the+blood+of+healthy+individuals+from+West+Africa.">Discovery of novel rhabdoviruses in the blood of healthy individuals from West Africa.</a> PLoS Negl Trop Dis. 9, e0003631 (2015).</li><li>Gire, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+surveillance+elucidates+Ebola+virus+origin+and+transmission+during+the+2014+outbreak.">Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak.</a> Science. 345, 1369-1372 (2014).</li><li>Morlan, J. D., Qu, K., Sinicropi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+rRNA+enables+whole+transcriptome+profiling+of+archival+fixed+tissue.">Selective depletion of rRNA enables whole transcriptome profiling of archival fixed tissue.</a> PLoS One. 7, e42882 (2012).</li><li>Park, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+Epidemiology,+Transmission,+and+Evolution+during+Seven+Months+in+Sierra+Leone.">Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone.</a> Cell. 161, 1516-1526 (2015).</li><li>Andersen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Sequencing+Uncovers+Origins+and+Evolution+of+Lassa+Virus.">Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa Virus.</a> Cell. 162, 738-750 (2015).</li><li>Matranga, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+methods+for+unbiased+deep+sequencing+of+Lassa+and+Ebola+RNA+viruses+from+clinical+and+biological+samples.">Enhanced methods for unbiased deep sequencing of Lassa and Ebola RNA viruses from clinical and biological samples.</a> Genome Biol. 15, 519 (2014).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell.">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+spike-in+standards+for+RNA-seq+experiments.">Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments.</a> Genome Res. 21, 1543-1551 (2011).</li><li>. Kapa Biosystems Available from: <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2015)</li><li>. Illumina Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf</a> (2015)</li><li>Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+indexing+overcomes+inaccuracies+in+multiplex+sequencing+on+the+Illumina+platform.">Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3 (2012).</li><li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses,+arenaviruses,+and+New+World+hantaviruses.">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am J Trop Med Hyg. 82, 954-960 (2010).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+high-resolution+analysis+of+blood+virome+and+host+cytokines+expression+profile+of+a+patient+with+fatal+H7N9+infection+by+massively+parallel+RNA+sequencing.">Serial high-resolution analysis of blood virome and host cytokines expression profile of a patient with fatal H7N9 infection by massively parallel RNA sequencing.</a> Clin Microbiol Infect. 21, 713 (2015).</li><li>Simon-Loriere, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+lineages+of+Ebola+virus+in+Guinea+during+the+2014+West+African+epidemic.">Distinct lineages of Ebola virus in Guinea during the 2014 West African epidemic.</a> Nature. 524, 102-104 (2015).</li><li>Folarin, O. A., Happi, A. N., Happi, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+African+genomics+for+infectious+disease+control.">Empowering African genomics for infectious disease control.</a> Genome Biol. 15, 515 (2014).</li><li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+MDA+for+enumeration+of+total+nucleic+acid+contamination.">Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination.</a> Nucleic Acids Res. 39, 19 (2011).</li><li>Malboeuf, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+viral+RNA+genome+sequencing+of+ultra-low+copy+samples+by+sequence-independent+amplification.">Complete viral RNA genome sequencing of ultra-low copy samples by sequence-independent amplification.</a> Nucleic Acids Res. 41, 13 (2013).</li><li>Gonzalez, I. L., Sylvester, J. E., Smith, T. F., Stambolian, D., Schmickel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+gene+sequences+and+hominoid+phylogeny.">Ribosomal RNA gene sequences and hominoid phylogeny.</a> Mol Biol Evol. 7, 203-219 (1990).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nat Methods. 10, 623-629 (2013).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Özetlenen yaklaşım sağlam, evrensel, hızlı sıralama sağlar ve 2014 mihrak 2,4 sırasında Ebola virüsü sıralanması için kullanılmıştır. tagmentation kütüphane yapımı seçici tükenmesi ve cDNA sentezi birleşerek, genel işlem süresi bir önceki bağdaştırıcı ligasyon yöntemleri ~ 2 gün kadar azaltılmıştır. Daha yakın zamanlarda, bu protokol büyük bir başarı 15,16 ile uluslararası işbirlikçileri ve diğerleri tarafından istihdam edildi ve yerel genomik tabanlı araştırmalar ve teşhis 17 desteklemek için Batı Afrika&#39;da laboratuarlara görevlendirilecek. Burada açıklanan protokol Viral RNA&#39;ya DİZİ kütüphaneleri için cDNA hazırlamak için rastgele primerler kullanılır. Önceki Viral RNA&#39;ya DİZİ yaklaşımlardan farklı olarak, hiçbir özel bir virüs ya da dalının için sekans verileri veya karmaşık ve zaman alıcı bir primer tasarımı hakkında önsel bir bilgi gerektirmektedir. yöntem, herhangi bir viral RNA numunesinin tatbik edilebilir. Örneğin, her iki Ebola viral içeriği oluşturmak için kullanılanve Lassa örnekleri 6. Protokolü ayrıca ana transcriptomic, metagenomic ve patojen bulma dizi projelerine 1 için de kullanılabilir. protokol kritik bir safha, Rnaz H sindirim, yüksek verimli viral örnekleri istenmeyen bir taşıyıcı ve konakçı RNA çıkarmak için düşük maliyetli bir yöntemdir hedeflenmektedir. protokol seçici tükenmesi adımı birçok bileşenleri kullanır ve beceri ve doğruluk gerektirir. Ekstra zaman ve bakım ilk kurulum sırasında alınmalıdır. çoğu klinik serum ve plazma numuneleri genellikle çok az nükleik asit malzeme var gibi, kirlenme ve örnek kaybı yaygındır. Bu protokolü kullanırken bu sorunları önlemek için, özel bakım alınmalıdır. İlk olarak, RNA ayrışma son derece duyarlı olduğu; Bu nedenle tüm alanları temiz ve nükleazlar arındırılmış olmalıdır. İkinci olarak, bu protokolde kullanılmak için müsait örnekleri belirlemek için, her iki ana RNA ve virüs için QRT-PCR miktarının 5,6 kullanılmalıdır </sus&gt;. Giriş karşılaştıran protokolden sıralama sonuçları, sıralama başarı ile miktarlar zaman (yani, tam viral montaj için yeterli veri nesil) en az 100 pg toplam RNA ve virüsün 1,000 kopya içeren örnekleri ile ilişkili. Nükleik asitlerin, çevresel kaynaklardan Üçüncü olarak, maruz kaçınılmalıdır. Burada özetlenen protokol güvenlik önlemleri için bir biyogüvenlik kabini ve çevre kirleticileri sınırlamak için yapılır. Ayrıca, bizim grup ve diğerleri ticari enzimler düşük girdi örneklerinde 6,18 bakteriyel nükleik asitlerin kirletici başka bir kaynak olabileceğini fark etmiş. Temiz bir çalışma alanı (örneğin PCR kaput, biyogüvenlik kabini) ve negatif kontrollerin kullanımı (örneğin, su veya tampon), sırasıyla hafifletmek ve kirlenmeyi izlemenize yardımcı olacaktır. numuneler için &lt;toplam RNA 100 ug, sadece poli (rA), taşıyıcı RNA değil, rRNA, malzeme kaybını sınırlarken, yüksek kaliteli dizileme sonuçları elde etmek için tükenmiş edilmelidir. çokpoli (rA), taşıyıcı cDNA sentezi önce çıkarılmalıdır, ancak düşük giriş örnekleri, cDNA amplifikasyon yöntemleri, 19 daha uygun olabilir. Ev sahibi rRNA tükenmesi dizileme kütüphaneleri viral içeriğinden zenginleştiren ve serum veya plazma, kemirgenler ve insan olmayan primatlar 5,6 dokuların çok tip dahil olmak üzere farklı Numune alım için de geçerlidir. 28S rRNA tükenmesi sonra kalan insan olmayan organizmalar, rRNA, insan ve diğer türler 6,20 arasında daha az korunmuş bir 28S düşündürmektedir hizalama okunur. Insan olmayan izolatlar, bu yöntem kullanılarak, belirli bir ana bilgisayar 3,21 ıraksak rRNA dizilerine tamamlayıcı DNA oligo ile tamamlamak için gerekli olabilir. Protokol tarafsız olduğu viral toplam kütüphanesi içeriğinin sadece küçük bir bölümünü temsil edebilir okur. rRNA en bol konak RNA türlerinin ve sadece rRNA küçük bir yüzdesini okur (olmasına rağmen0% 1), seçici yok olmasından sonra, tüm diğer konakçı RNA (örneğin mRNA) yok olmasından sonra kalır ve bir çok dizi örnek okur için hesap bulunur. Bu nedenle &quot;örnekleme&quot; (yani, oversequencing), ayrı ayrı kütüphaneler, viral düzeneği ve varyant aramalar için yeterli kapsama alanı elde etmek için gereklidir. Bizim çalışmaları için, biz dizisine ~ 20 milyon viral genomik ve ilişkili varyantların analizi için yeterli derinlik yanı sıra metagenomic içeriğin 2,5 olması numune başına okur girişimi. metagenomic ve patojen bulma çalışmaları için, konakçı DNA kirletici DNase sindirilerek kaldırılır dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle DNA genomları ihtiva virüs ve diğer patojenleri sürecinde kaybolmuş olabilir, ancak RNA ara yine sıralı olabilir.

Klinik kaynaklardan virüslerin Gelecek nesil dizileme iletimi ve enfeksiyonların epidemiyolojisi, yanı sıra teşhis yardım desteği romanı, aşı ve tedavi gelişimini bilgilendirebilir. rastgele primerler kullanılarak cDNA sentez farklı eş bulaşmaya genomları ya da yeni bir virüs 1,2 algılama ve montaj sağladı. diğer tarafsız yöntemlerinde olduğu gibi, istenmeyen kirletici birçok sıralama okur ve olumsuz sıralama sonuçlarını etkileyebilir işgal. Sunucu ve poli (rA) taşıyıcı RNA birçok mevcut viral örnek koleksiyonlarında mevcut kirletici maddelerdir. protokol tarafsız toplam RNA seq dayalı derin sıralama RNA virüsüdür genom verimli ve maliyet-etkin bir şekilde açıklamaktadır. Yöntem istenmeyen konak ribozomal ve taşıyıcı RNA kaldırmak için bir RNase H seçici tükenmesi adımı 3 kullanır. Zayıflatılması viral içeriğine (Şekil 1) için zenginleştirir ve dizi verileri kalitesini artırırKlinik örneklerden (Şekil 2). Ayrıca, tagmentation önemli ölçüde kütüphane oluşturma süresini azaltır protokol uygulanır. Bu yöntemler, hızlı bir şekilde Ebola ve Lassa virüsü genomlarının 2,4,5 büyük veri kümelerini üretmek için kullanılmış ve RNA virüslerinin geniş bir çalışma için kullanılabilir. Son olarak, bu yaklaşım, insan örnekleri ile sınırlı değildir; zayıflatılması yardımcı Lassa enfekte kemirgen ve insan olmayan primat hastalık modellerinde 5,6 toplanan doku örnekleri üzerinde gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig1.jpg" /> Şekil 1. Toplam RNA İçerik Zenginleştirme Seçici tükenmesi kullanarak Lassa Virüsü İçerik yansıtır. Dokuz farklı klinik izole edilen rRNA tükenmesi üzerine genel içerik (RNA girişi) ve benzersiz Lassa virüsü (LASV) zenginleşmesine okur (Kütüphane içerik) başlatılıyor. Bu Şekil 6, modifiye edilmiş <em&gt;. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig2.jpg" /> Şekil 2. Yüksek Kalitede Dizi Taşıyıcı RNA tükenmesi. Poli sıralama döngüsü (rA) başına medyan baz nitelikleri Lassa virüsü kitaplıkları (kırmızı) ve QC raporu 13 den kontrol (siyah kütüphanesinde gözlenen hiçbir taşıyıcı) Kontamine sonra. Hem 1 okumak ve eşleştirilmiş sonu 2 kitaplık BAM dosyasında birleştirilir okur ve kalite puanları her üssünde gösterilmiştir okuyun. Bu rakam 6&#39;dan modifiye edilmiştir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> çıkarılan doğrudan kütüphanelerin viral RNA seq protokol detayları inşaatRNA klinik ve biyolojik örneklerden topladı. kişisel güvenliğini sağlamak için, tüm viral serum, plazma ve doku örnekleri RNA ekstraksiyonu öncesinde uygun tamponlar içinde inaktive edilmelidir. Bazı inaktivasyonu ve çıkarma kitleri, taşıyıcı poli (rA) RNA dahildir; Bu ilk RNase H zayıflatılması aşaması esnasında çıkarılır. tam iyileşme göre taşıyıcı RNA beklenen konsantrasyonu, 100 ng / ml. Protokolde, 110 ng / | il oligo dT RNA (1.1x taşıyıcı yoğunluğu) azalması için kullanılmaktadır. poli (rA), taşıyıcı numunede mevcut değilse, o zaman, oligo (dT) azalması önce ilave edilmemelidir. Aşağıdaki protokol (250 ul hacim kadar) PCR levha formatında 24 reaksiyonlar için tasarlanmıştır. Bu protokolün bir önceki sürümü Matranga, vd bildirildi. 6..

<table><tbody><tr><td>96-well PCR Plates</td><td>VWR</td><td>47743-953</td><td></td></tr><tr><td>Strips of Eight Caps</td><td>VWR</td><td>47745-512</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>post RNA extraction step, 2 U/&amp;micro;l, buffer included</td></tr><tr><td>PCR cycler</td><td></td><td></td><td>any PCR cyclers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP SPRI beads&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td><td>beads for RNA cleanup</td></tr><tr><td>Real Time qPCR system</td><td></td><td></td><td>any system</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>prepare fresh</td></tr><tr><td>qRT-PCR primers</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>see &lt;strong&gt;Table 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>5 M NaCl&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Linear acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Ambion&amp;nbsp;</td><td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos covering entire rRNA region</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>see &lt;strong&gt;Table 3&lt;/strong&gt;, order lab-ready at 100 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Oligo (dT)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>40 nt long, desalted</td></tr><tr><td>Hybridase Thermostable RNase H&amp;nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>H39100</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>post selective depletion step</td></tr><tr><td>SUPERase-In RNase Inhibitor</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Random Primers&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>48190-011</td><td>mostly hexamers</td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>with first-strand buffer, DTT</td></tr><tr><td>Air Incubator</td><td></td><td></td><td>any air incubator cyclers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B6117S</td><td>10x</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0205L</td><td>10 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA Polymerase I&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0209L</td><td>10 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0297L</td><td>2 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP SPRI beads</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td>beads for DNA cleanup</td></tr><tr><td>Elution Buffer&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>10 mM Tris HCl, pH 8.5</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Qubit fluorometer&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Index Kit&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2965AA</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Library Quantification Complete kit (Universal)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification</td></tr></tbody></table>

unbiased deep sequencing of rna viruses from clinical samples

Burada de novo meclisleri ve klinik ve biyolojik kaynaklardan toplanan viral genom içi konak varyant aramaları sağlayan yeni nesil RNA sıralama protokol özetlemektedir. yöntem tarafsız ve evrensel olduğu; Bu cDNA sentezi için, rastgele primerler kullanarak ve viral sekans içeriğine hiçbir ön bilgi gerektirir. dahil olmak üzere, poli (rA) taşıyıcı ve ribozomal RNA - - Viral RNA numunesinden kütüphane yapımı önce seçici RNase H tabanlı sindirim istenmeyen RNA tüketmek için kullanılır. Seçici tükenmesi veri kalitesini ve benzersiz sayısının viral RNA dizileme kütüphanelerde okur hem geliştirir. genel kütüphane oluşturma süresini azaltır Üstelik, bir transposaz dayalı &#39;tagmentation&#39; aşamalı protokol kullanılır. protokol hızlı derin sıralama sağladı 600&#39;ün üzerinde Lassa ve Ebola virüsü örnekleri dahil kan ve doku hem izolatları-ve diğer mikrobik genomik çalışmalar geniş çapta uygulanabilir tahsilatlar.

açıklanan protokol eşsiz viral içerik zenginleştirici ise yüksek kaliteli dizileme nesil düşük giriş viral RNA örnekleri okur sağlar. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bir protokol en az 18S rRNA (~ 100 pg toplam RNA)&#39; in en az bir milyon adet olan (sigara tükenmiş kontroller ile karşılaştırıldığında) Bütün numuneler, beş kat özgü Lassa virüsü içerik zenginleştirilmiş. Benzer şekilde, dizi başarısı, belirli bir örnek içinde virüs miktarı ile korelasyon gösterdi. Viral miktar için bir vekil, ~ en sık tam montajları oluşturulan 1.000 veya daha fazla virüs genom kopyaları içeren numune olarak QRT-PCR kullanılarak (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, poli (rA) taşıyıcının deliği (Şekil 2) okur temiz preparasyonlarda elde edilen ve daha iyi kalitede sıralama sağlanması kütüphanelerinde A ve T homopolimer dizileri azaltır. düşük giriş viral klinik örneklerden Final kütüphaneler genellikle 150 1000 bp geniş bir fragman uzunluğa sahip(Şekil 3). Sıralama sonra, havuz 12 içindeki kütüphaneleri arasında örnek yanlış tanımlanma problemleri ve karışma azaltmak için, sadece index 25 (S25) bir taban kalite puanı ile okur ve sıfır uyumsuzlukları demultiplexing sürecinde tutulur emin olun. Viral genom farklı virüs 2,4-6 özgü biyoenformatik boru hattı kullanılarak birleştirilebilir. Bu araçlar https://github.com/broadinstitute/viral-ngs ya da ticari bulut platformları 4 edinilebilir. <table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Adım 1.1: DNaz tepki </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> 10x DNaz tamponu </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Çıkarılan viral RNA&#39;nın </td><td> 55 </td></tr><tr><td> DNase (2 U / &amp; #181 L) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 70 </td></tr><tr><td> 5x hibridizasyon tamponu: 2.1 Adım </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> 1 ml hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5 M NaCI </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7.4) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> Adım 2.1: 10x RNaz H reaksiyon tamponu </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> 1 ml hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5 M NaCI </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7.5) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 1 M MgCI2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> Aşama 2.1: su wi sayılı lineer akrilamid </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> 1 ml tampon için Volume (ul) </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 992 </td></tr><tr><td> Doğrusal akrilamid (5 mg / ml) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 1000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Aşama 2.2: zayıflatılması için bir melezleştirme tepkimesi </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5x hibridizasyon tampon </td><td> 2 </td></tr><tr><td> rRNA-tükenmesi oligo karışımı (100 uM) </td><td> 1.22 </td></tr><tr><td> Oligo (D) S (550 ng / | il), </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNaz ile muamele edilmiş toplam RNA, </td><td> 5 e kadar </td></tr><tr><td> Spike-RNA (Bu isteğe bağlıdır) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Su (lineer akrilamid ile) </td><td> 10 toplam getirmek </td></tr><tr><td> Toplam VOLUben mi </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Adım 2.3: seçici tükenmesi için RNaz H tepki </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> 10x RNase H Reaksiyon Tamponu </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Su (lineer akrilamid ile) </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Termo RNaz H (5 U / ul) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Adım 2.4: DNaz reaksiyon sonrası seçici tükenmesi </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> 10x DNaz Tampon </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Su (lineer akrilamid ile) </td><td> 44.5 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü (20 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rnaz içermeyen Dnaz I (2.72 U / ml) </td><td> 2 </td></tr&gt; <tr><td> Toplam hacim (Rnaz H reaksiyonu ile) </td><td> 75 </td></tr><tr><td colspan="2"> Adım 3.1: cDNA sentezi, rasgele primer melezleme </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> rRNA / taşıyıcı tükenmiş RNA </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3 ug rasgele primer </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Aşama 3.2: Birinci sarmal cDNA sentez reaksiyonu </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5x İlk Strand Reaction Buffer </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP karışımı </td><td> 1 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü (20 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ters transkriptaz (son ekleyin) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> (Yukarıdaki RNA) ile toplam hacmi &lt;/ Td&gt; <td> 20 </td></tr><tr><td colspan="2"> Adım 3.3: İkinci iplik cDNA sentezi reaksiyonu </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> RNaz içermeyen su </td><td> 43 </td></tr><tr><td> 10x İkinci Strand Reaction Buffer </td><td> 8 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP karışımı </td><td> 3 </td></tr><tr><td> E. Coli DNA ligaz (10 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> E. coli DNA polimeraz I (10 U / ul) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> E.coli RNaz H (2 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Toplam hacim (1 inci iplikçik reaksiyon) </td><td> 80 </td></tr><tr><td> Adım 4.2: Tagmentation reaksiyonu </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> Amplikon Tagment Mix (ATM) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tagment DNA Tampon (TD) </td&gt; <td> 5 </td></tr><tr><td> Toplam hacim (cDNA) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Kütüphane PCR reaksiyonu: 4.3 Adım </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> PCR Master Mix (YKY) </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Endeks 1 astar (i7) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Endeks 2 primer (i5) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Toplam hacim (cDNA tagmented) ile </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Aşama 4.3.2: Kütüphane PCR koşulları </td><td></td></tr><tr><td> 72 ° C, 3 dakika </td><td></td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 saniye </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 95 ° C&#39;de 18 devir-10 saniye, 55 ° C&#39;de 30 saniye, 30 saniye için 72 ° C &#39;de </td></tr><tr><td> 72 ° C, 5 dakika </td><td></td></tr><tr><td> 10 ° C, sonsuza </td><td></td></tr></tbody></table>Tablo 1:. Reaksiyon set-up ve tamponlar Adım adım tüm tamponlar ve reaksiyon karışımlarının içeriği ile tablolar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> oligo Adı </td><td> Sıra (5 &#39;ila 3&#39;) </td></tr><tr><td> Ebola KGH FW </td><td> GTCGTTCCAACAATCGAGCG </td></tr><tr><td> Ebola KGH RV </td><td> CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT </td></tr><tr><td> Ebola KULESH FW </td><td> TCTGACATGGATTACCACAAGATC </td></tr><tr><td> Ebola KULESH RV </td><td> GGATGACTCTTTGCCGAACAATC </td></tr><tr><td> Lassa SL FW </td><td> GTA AGC CCA OBEB GYA AAB CC </td></tr><tr><td> Lassa SL RV </td><td> AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A </td></tr><tr><td> 18S rRNA FW </td><td> TCCTTTAACGAGGATCCATTGG </td></tr><tr><td> 18S rRNA RV </td><td> CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT </td></tr></tbody></tmümkün&gt; Tablo 2: QRT-PCR Astarlar Diziler ana bilgisayar (18S rRNA) ve viral (Ebola ve Lassa) içeriği ölçmek için kullanılan primerler.. &#39;KGH&#39; Ebola primerleri 2 test edildi Sierra Leone, içinde Kenema Devlet Hastanesi olduğunu. &#39;Kulesh&#39; primer 14 set tasarlanmış araştırmacı olduğunu. Tablo 3: Ribozomal RNA (rRNA) tükenmesi Oligo seçici tükenmesi adım 6 insan rRNA tamamlayıcı 195 50 nükleotid uzunluğunda diziler.. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples at JoVE.com

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

unbiased-deep-sequencing-of-rna-viruses-from-clinical-samples

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

16.8K Görüntüleme.  Broad Institute of MIT and Harvard. This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Video: Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

Ortak Liquid Handling Robotlar TruTip Teknoloji kullanarak Klinik Örneklerden DNA ve RNA yüksek verimlilik, Otomatik Ekstraksiyon

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Biyomühendislik

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Nanopore sıralamayı kullanarak tüm kan mRNA sıralaması

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Genetik

Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for several different viruses. These approaches utilize an overlapping amplicon-based approach which can be used to target a specific virus or group of genetically related viruses. In addition to confirmation of the virus presence, sequencing can be used for genomic epidemiology studies, to track viruses and unravel origins, reservoirs and modes of transmission. For such applications, it is crucial to understand possible effects of the error rate associated with the platform used. Routine application in clinical and public health settings require that this is documented with every important change in the protocol. Previously, a protocol for whole genome Usutu virus sequencing on the nanopore sequencing platform was validated (R9.4 flowcell) by direct comparison to Illumina sequencing. Here, we describe the method used to determine the required read coverage, using the comparison between the R10 flow cell and Illumina sequencing as an example.

We previously validated a protocol for amplicon-based whole genome Usutu virus (USUV) sequencing on a nanopore sequencing platform. Here, we describe the methods used in more detail and determine the error rate of the nanopore R10 flow cell.

Tüm Genom Nanopore Sıralama doğrulama, Örnek olarak Usutu Virüs kullanarak

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for ...

Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples

Wastewater-based epidemiology has emerged as a promising and efficacious surveillance system for SARS-CoV-2 and other infectious diseases in many nations. The process typically involves wastewater concentration, nucleic acid extraction, amplification of selected genomic segments, and detection and quantification of the amplified genomic segment. This methodology can similarly be leveraged to detect and quantify infectious agents, such as SARS-CoV-2, in air samples. Initially, SARS-CoV-2 was presumed to spread primarily through close personal contact with droplets generated by an infected individual while speaking, sneezing, coughing, singing, or breathing. However, a growing number of studies have reported the presence of SARS-CoV-2 RNA in the air of healthcare facilities, establishing airborne transmission as a viable route for the virus. This study presents a composite of established protocols to facilitate environmental detection, quantification, and sequencing of viruses from both wastewater and air samples.

This protocol aims to quantify SARS-CoV-2 RNA in wastewater and air samples to be used for wastewater-based epidemiology studies and to assess the exposure risk to SARS-CoV-2 in indoor and outdoor aerosols. This protocol also describes a tiled amplicon long-template sequencing approach for SARS-CoV-2 whole genome characterization.

Atık Su ve Hava Örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'sının Miktar Tayini ve Tüm Genom Karakterizasyonu

Wastewater-based epidemiology has emerged as a promising and efficacious surveillance system for SARS-CoV-2 and other infectious diseases in many nations. ...

Çevre

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries implemented strategies based on direct human testing, face covering, and surface disinfection. Under the assumption that the main route of transmission includes aerosols and respiratory droplets, efforts to detect SARS-CoV-2 in fomites have focused on locations suspected of high prevalence (e.g., hospital wards, cruise ships, and mass transportation systems). To investigate the presence of SARS-CoV-2 on surfaces in the urban environment that are rarely cleaned and&#160;seldomly disinfected, 350 citizens were enlisted from the greater San Diego County. In total, these citizen scientists collected 4,080 samples. An online platform was developed to monitor sampling kit delivery and pickup, as well as to collect sample data. The sampling kits were mostly built from supplies available in pandemic-stressed stores. Samples were processed using reagents that were easy to access despite the recurrent supply shortage. The methods used were highly sensitive and resistant to inhibitors that are commonly present in environmental samples. The proposed experimental design and processing methods were successful at engaging numerous citizen scientists who effectively gathered samples from diverse surface areas. The workflow and methods described here are relevant to survey the urban environment for other viruses, which are of public health concern and pose a threat for&#160;future pandemics.

A citizen science project was designed to recruit San Diego residents to collect environmental samples for SARS-CoV-2. A multilingual web-based platform was created for data submission using a user-friendly mobile device interface. A laboratory information management system facilitated the collection of thousands of geographically diverse samples with real-time outcome tracking.

Kentsel Çevrenin Taranması - Çevre Rezervuarlarından SARS-CoV-2'nin Örneklemesi ve Tespiti için Bir Boru Hattı

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Biyoloji

Düşük Gelirli Ülkelerde Kuduzu Kontrol Etmek için Nano Gözenek Tabanlı Genomik Bir Yaklaşım

Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic surveillance remains limited in many low- and middle-income countries (LMICs), where dog-mediated rabies and/or rabies transmitted by wildlife such as vampire bats pose major public health and economic concerns. We present here a rapid and affordable sample-to-sequence-to-interpretation workflow using nanopore technology. Protocols for sample collection and the diagnosis of rabies are briefly described, followed by details of the optimized whole genome sequencing workflow, including primer design and optimization for multiplex polymerase chain reaction (PCR), a modified, low-cost sequencing library preparation, sequencing with live and offline base calling, genetic lineage designation, and phylogenetic analysis. Implementation of the workflow is demonstrated, and critical steps are highlighted for local deployment, such as pipeline validation, primer optimization, inclusion of negative controls, and the use of publicly available data and genomic tools (GLUE, MADDOG) for classification and placement within regional and global phylogenies. The turnaround time for the workflow is 2-3 days, and the cost ranges from $25 per sample for a 96 sample run to $80 per sample for a 12 sample run. We conclude that setting up rabies virus genomic surveillance in LMICs is feasible and can support progress toward the global goal of zero dog-mediated human rabies deaths by 2030, as well as enhanced monitoring of wildlife rabies spread. Moreover, the platform can be adapted for other pathogens, helping to build a versatile genomic capacity that contributes to epidemic and pandemic preparedness.

Yazar Spotlight: Kaynak Sınırlı Ortamlarda Kuduz Kontrolünü İlerletmek için Uygun Maliyetli Bir Genomik İş Akışı 

Here, we present a rapid and cost-effective workflow for characterizing rabies virus (RABV) genomes using nanopore technology. The workflow is intended to support genomics-informed surveillance at a local level, providing information on circulating RABV lineages and their placement within regional phylogenies to guide rabies control measures.

Nanopor Teknolojisi Kullanılarak Kuduz Virüsünün Hızlı Karakterizasyonu için Tüm Genom Dizilimi

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic ...