This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).

declaración de la ética: los pacientes con fiebre de Lassa fueron reclutados para este estudio utilizando los protocolos aprobados por los comités de los sujetos humanos en la Universidad de Tulane, Universidad de Harvard, Instituto Broad, Irrua Especialista Hospital Universitario (ISTH), Hospital del Gobierno de Kenema (KGH), Oyo Ministerio de Salud, Ibadan Estado , Nigeria y Sierra Leona Ministerio de Salud. Todos los pacientes fueron tratados con un nivel similar de la atención y se les ofreció el fármaco ribavirina, ya sea o no que decidieron participar en el estudio. Para los pacientes con fiebre de Lassa (LF), el tratamiento con ribavirina a las directrices recomendadas actualmente y en general fue ofrecido tan pronto como LF se sospecha fuertemente. Debido a la grave brote de virus del Ébola de Enfermedades (EVD), pacientes no pudieron ser consintieron a través de nuestros protocolos estándar. En cambio el uso de muestras clínicas de pacientes exceso EVD fue evaluado y aprobado por las Juntas de Revisión Institucional en Sierra Leona y en la Universidad de Harvard. el OffiCE de la Comisión Sierra Leona Ética y Revisión Científica, el ministerio de Sierra Leona de Salud y Saneamiento, y el Comité de Harvard sobre el Uso de Sujetos Humanos han concedido una exención del consentimiento para secuenciar y hacer secuencias virales públicamente disponibles obtenidos a partir de muestras de pacientes y datos de contacto recogida durante el brote de Ébola en Sierra Leona. Estos organismos también concedió el uso de datos clínicos y epidemiológicos para muestras sin identificación recogidos de todos los pacientes que reciben atención EVD sospechosos durante la respuesta a los brotes. La Leona Ministerio de Salud y Sanidad de Sierra también aprobó los envíos de no infecciosas, las muestras no biológicas desde Sierra Leona a Broad Institute y la Universidad de Harvard para estudios genómicos de muestras de brotes. 1.-DNasa tratamiento de ARN de la muestra (hasta 55 l extraídos ARN total, ~ 4 h) <ol><li> Configurar la reacción de DNasa en una placa de 96 pocillos PCR en hielo en una cabina de bioseguridad como se describe en la Tabla 1 </strong&gt;, Etapa 1.1 (volumen total, 70 l / pocillo). Nota: Un maestro de la mezcla puede ser preparada. </li><li> Vórtice suave y profundamente, centrifugar a 280 xg a temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> La limpieza usando perlas de ARN en Fase sólida reversible Inmovilización (SPRI). <ol><li> perlas de ARN calentar a ta durante 30 min. </li><li> Agitar suavemente la botella de perlas de ARN para volver a suspender las partículas magnéticas que se haya asentado. Añadir un volumen 1,8 veces (126 l) de perlas de ARN a ARN tratado con DNasa (70 l), mezclar con una pipeta de 10 veces y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente (volumen total en el pozo, 196 l). </li><li> Coloque la mezcla en la estación magnético. Espere a que la solución para limpiar (de 5 - 10 min). </li><li> Eliminar la solución de aclarado, mientras que en la estación mediante una pipeta y el descarte. Mientras que en la estación, lavar los granos cubriendo pellet con etanol al 70% y se incuba durante 1 min. Eliminar el etanol con la pipeta y descarte. Repita para un total de dos lavados. Nota: El uso y precisión del 70% recién preparadaHanol es crítico, ya que un porcentaje más alto dará como resultado en el lavado ineficiente de moléculas de menor tamaño, mientras que &lt;70% de etanol podría causar la pérdida de la muestra 7. </li><li> Mantenga la placa en la estación y dejar abierta secar al aire. Nota: Asegúrese de permitir que las perlas se sequen por completo hasta que los granos comienzan a agrietarse. </li><li> Añadir 55 l de agua libre de nucleasa a la placa para eluir el ARN. Retire la placa de la estación de mezclar los granos y el agua al vaso a fondo. Nota: Como alternativa, utilizar menos agua (≤ 10 l) con el fin de concentrar el ARN total. </li><li> Coloque la placa posterior de la estación. Espere hasta que la solución limpia para transferir mediante una pipeta a un nuevo tubo con tapón de rosca para el almacenamiento a largo plazo (-80 ° C). Coloca 5 l de ARN en una nueva placa de 96 pocillos de PCR para el agotamiento (. El paso 2.4). </li><li> Opcional:. Guardar y diluir 1 l en 19 l de agua (1:20) para QRT-PCR de rRNA (por ejemplo, 18S, 28S rRNA) (Tabla 2) y los marcadores virales 5 &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 2. El agotamiento selectivo de ARN ribosomal y Carrier de ARN viral de la muestra (~ 4 h) <ol><li> Hacer hibridación 5x y 10x tampones de reacción de RNasa H, y agua libre de nucleasa con el portador de acrilamida lineal como se describe en la Tabla 1. </li><li> Configurar reacción de hibridación mediante la combinación de ARN con oligos de agotamiento de rRNA (Tabla 3) y oligo (dT) en hielo en una placa de 96 pocillos de PCR como se describe en la Tabla 1. Nota: Un maestro de la mezcla puede ser preparada. 50 femtogramos (fg) de un ARN sintético único (ERCCs 8) se pueden agregar para el seguimiento tanto del proceso de secuenciación viral y potencial leer índice de contaminación cruzada. <ol><li> Vórtice suave y profundamente, centrifugar a 280 xg a temperatura ambiente durante 1 min. Incubar a 95 ° C durante 2 min, rampa lenta a 45 ° C a -0,1 ° C por segundo. Una pausa en el termociclador a 45 ° C. </li></ol></li><li> Configurar la RNasa H de la mezcla de reacción en hielo como se ha descritod en la Tabla 1, a continuación, precalentar a 45 ° C durante 2 min. Nota: Un maestro de la mezcla puede ser preparada. <ol><li> Añadir la mezcla de la RNasa H precalentado a la reacción de hibridación en placa, manteniendo la placa en el termociclador a 45 ° C. </li><li> Mezclar bien pipeteando suavemente 6 - 8 veces. Incubar a 45 ° C durante otros 30 min. Colocar sobre hielo. </li></ol></li><li> Configurar la mezcla de reacción en hielo DNasa tal como se describe en la Tabla 1 Nota:. Un maestro de la mezcla se puede preparar. <ol><li> Añadir a la reacción de la RNasa H en la placa, vórtice suave y profundamente, centrifugar a 280 xg a temperatura ambiente durante 1 min. Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Detener la reacción mediante la adición de DNasa 5 l 0,5 M EDTA. Vórtice suave y profundamente, centrifugar a 280 xg a temperatura ambiente durante 1 min. </li></ol></li><li> La limpieza usando perlas de ARN (véase el paso 1.3) utilizando un volumen de 1,8 veces (144 l) perlas. Eluir en 11 l de agua libre de nucleasa. Nota: Para el almacenamiento en frío seguro, almacenar agota RNA las muestras a -80 ° C O / N. </li></ol> 3. Síntesis de ADNc (~ 6 hr) <ol><li> Mix rRNA / ARN carrier-empobrecido con cebadores aleatorios en hielo en una placa de 96 pocillos de PCR como se describe en la Tabla 1, vórtice suave y completamente, a continuación, se centrifuga a 280 xg a TA durante 1 min. <ol><li> Se calienta la mezcla a 70 ° C durante 10 minutos en un termociclador. Inmediatamente después de desnaturalización por calor, coloque el ARN en hielo durante 1 - 5 min. No permita que el ARN a pie (incluso en hielo) durante más de 5 minutos antes de la primera cadena de reacción. </li></ol></li><li> Configurar el primer capítulo de la síntesis de la mezcla de reacción en hielo como se describe en la Tabla 1. Nota: Una mezcla maestra puede ser preparado. <ol><li> Agregar a la mezcla de cebadores de ARN / azar en la placa, vórtice suave y profundamente, centrifugar a 280 xg a temperatura ambiente durante 1 min. Se incuba a 22-25 ° C durante 10 min. </li><li> Incubar a 55 ° C en una incubadora de aire para 60 min. Colocar la placa en el hielo para terminar la reacción. Noe: El uso de una incubadora de aire se recomienda para crear el calentamiento gradual de la primera hebra de reacción durante el cual los cebadores de recocido y la primera hebra comienza a alargarse. </li></ol></li><li> Configurar la segunda cadena de la mezcla de reacción de síntesis sobre hielo como se describe en la Tabla 1. Nota: Una mezcla maestra puede ser preparado. <ol><li> Añadir a la primera cadena de reacción de síntesis de la placa, vórtice suave y profundamente, centrifugar a 280 xg a temperatura ambiente durante 1 min. Incubar durante 2 horas a 16 ° C (mantener la tapa a 25 ° C). No permita que la temperatura se eleve por encima de 16 ° C. </li><li> Colocar la placa en el hielo, entonces inactivar la reacción mediante la adición de 5 l de EDTA 0,5 M, mezclar suavemente y en profundidad, centrifugar a 280 xg a temperatura ambiente durante 1 min. </li></ol></li><li> De limpieza con los granos de ADN (véase el paso 1.3 para protocolo) utilizando el volumen de 1.8x (153 l) de perlas. Eluir en 9 l de tampón de elución (EB). Guardar 1 l para su cuantificación. Utilice 1 ng de cDNA para subsequepasos NT. Si la concentración de cDNA es demasiado baja para detectar, utilizar 4 l de cDNA para tagmentation (véase el paso 4.1). </li><li> Para el almacenamiento en frío seguro, almacenar doble hebra de ADNc a 4 ° CO / N o -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 4. Preparación Biblioteca - ADN de construcción de biblioteca (~ 4 h) <ol><li> Transferencia de 4 l de cDNA a una placa de 96 pocillos y guardar el cDNA restante para un segundo intento si es necesario. </li><li> Configurar la reacción tagmentation en hielo como se describe en la Tabla 1. Nota: Una mezcla maestra puede ser preparado. Para reducir el fondo y el coste total, el volumen total de la reacción tagmentation se reduce de 20 a 10 l. Como cDNA es el factor limitante, la cantidad de ATM (es decir, transposome) utilizado en la reacción también se reduce para disminuir el número de sitios de integración. <ol><li> Añadir la mezcla tagmentation de cDNA en la placa, vórtice suave y completamente y se centrifuga a 280 xg (a temperatura ambiente) durante 1 min.Se incuba a 55 ° C durante 5 min, mantenido a 10 ° C. </li><li> Una vez a 10 ° C, añadir 2,5 l de inmediato Neutralizar Tagment Buffer (NT) para terminar la reacción. Mezclar pipeteando arriba y abajo y centrifugar a 280 xg (a temperatura ambiente) durante 1 min. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li></ol></li><li> Configurar reacción de amplificación PCR en hielo como se describe en la Tabla 1. <ol><li> Vórtice suave y profundamente, centrifugar a 280 xg a temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Realizar PCR en termociclador usando las condiciones descritas en la Tabla 1. Nota: 12 ciclos de PCR se sugieren para 1 ng de cDNA tagmented; sin embargo, muestras clínicas virales a menudo tienen cantidades indetectables de cDNA. Para bajas cantidades de cDNA (&lt;1 ng), utilizar hasta 18 ciclos de PCR para crear suficiente biblioteca para la secuenciación. </li></ol></li><li> Biblioteca preparación - la limpieza y la puesta en común para la secuenciación <ol><li> Llevar la muestra hasta 50 l con EB. </li><li> limpieza con los mediosperlas de ADN (véase el paso 1.3 para protocolo) utilizando el volumen de 0.6x (30 l) perlas. Eluir en 15 l EB. </li><li> Determinar la concentración de la biblioteca (Figura 3) mediante la realización de análisis de región (150 a 1000 pb) utilizando software Bioanalyzer 9, con exclusión de los dímeros de cebadores (~ 120 pb) a partir del análisis región. Nota: Como alternativa, qPCR se puede utilizar para cuantificar las bibliotecas 10. </li><li> Las bibliotecas de la piscina en la concentración molar más baja de 1 nm o mayores. Si la biblioteca es inferior a 1 nM, añadir un pequeño volumen de la biblioteca a la piscina (~ 1 x volumen de otras bibliotecas) para capturar información de la secuencia de estas bibliotecas. </li><li> piscina de limpieza con los granos de ADN 0.7x como se indica más arriba (véase el paso 2). Eluir en 15 l EB. Nota: El volumen de los granos dependerá del volumen final de la piscina. </li><li> Analizar la piscina 9. Determinar la concentración molar mediante la realización de análisis de región (150 a 1000 pb) 9. Nota: Como alternativa, qPCR puede ser utilizado para cuantificar la piscina biblioteca 10 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Cargar secuenciador a las 10 pm concentración biblioteca para generar 101 pb, de extremo emparejado con doble lee el código de barras lee 11. </li></ol></li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig3.jpg" /> Figura 3. bibliotecas construidas a partir de virus Ébola muestras clínicas. Gel de imagen de las bibliotecas 4 representativa del virus del Ébola (EBOV). Se muestran las regiones de biblioteca y de cebadores dímeros. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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	<li>Stremlau, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+rhabdoviruses+in+the+blood+of+healthy+individuals+from+West+Africa.">Discovery of novel rhabdoviruses in the blood of healthy individuals from West Africa.</a> PLoS Negl Trop Dis. 9, e0003631 (2015).</li><li>Gire, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+surveillance+elucidates+Ebola+virus+origin+and+transmission+during+the+2014+outbreak.">Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak.</a> Science. 345, 1369-1372 (2014).</li><li>Morlan, J. D., Qu, K., Sinicropi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+rRNA+enables+whole+transcriptome+profiling+of+archival+fixed+tissue.">Selective depletion of rRNA enables whole transcriptome profiling of archival fixed tissue.</a> PLoS One. 7, e42882 (2012).</li><li>Park, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+Epidemiology,+Transmission,+and+Evolution+during+Seven+Months+in+Sierra+Leone.">Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone.</a> Cell. 161, 1516-1526 (2015).</li><li>Andersen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Sequencing+Uncovers+Origins+and+Evolution+of+Lassa+Virus.">Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa Virus.</a> Cell. 162, 738-750 (2015).</li><li>Matranga, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+methods+for+unbiased+deep+sequencing+of+Lassa+and+Ebola+RNA+viruses+from+clinical+and+biological+samples.">Enhanced methods for unbiased deep sequencing of Lassa and Ebola RNA viruses from clinical and biological samples.</a> Genome Biol. 15, 519 (2014).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell.">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+spike-in+standards+for+RNA-seq+experiments.">Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments.</a> Genome Res. 21, 1543-1551 (2011).</li><li>. Kapa Biosystems Available from: <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2015)</li><li>. Illumina Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf</a> (2015)</li><li>Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+indexing+overcomes+inaccuracies+in+multiplex+sequencing+on+the+Illumina+platform.">Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3 (2012).</li><li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses,+arenaviruses,+and+New+World+hantaviruses.">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am J Trop Med Hyg. 82, 954-960 (2010).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+high-resolution+analysis+of+blood+virome+and+host+cytokines+expression+profile+of+a+patient+with+fatal+H7N9+infection+by+massively+parallel+RNA+sequencing.">Serial high-resolution analysis of blood virome and host cytokines expression profile of a patient with fatal H7N9 infection by massively parallel RNA sequencing.</a> Clin Microbiol Infect. 21, 713 (2015).</li><li>Simon-Loriere, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+lineages+of+Ebola+virus+in+Guinea+during+the+2014+West+African+epidemic.">Distinct lineages of Ebola virus in Guinea during the 2014 West African epidemic.</a> Nature. 524, 102-104 (2015).</li><li>Folarin, O. A., Happi, A. N., Happi, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+African+genomics+for+infectious+disease+control.">Empowering African genomics for infectious disease control.</a> Genome Biol. 15, 515 (2014).</li><li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+MDA+for+enumeration+of+total+nucleic+acid+contamination.">Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination.</a> Nucleic Acids Res. 39, 19 (2011).</li><li>Malboeuf, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+viral+RNA+genome+sequencing+of+ultra-low+copy+samples+by+sequence-independent+amplification.">Complete viral RNA genome sequencing of ultra-low copy samples by sequence-independent amplification.</a> Nucleic Acids Res. 41, 13 (2013).</li><li>Gonzalez, I. L., Sylvester, J. E., Smith, T. F., Stambolian, D., Schmickel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+gene+sequences+and+hominoid+phylogeny.">Ribosomal RNA gene sequences and hominoid phylogeny.</a> Mol Biol Evol. 7, 203-219 (1990).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nat Methods. 10, 623-629 (2013).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

El enfoque descrito permite la secuenciación robusto, universal, rápido y fue utilizado para secuenciar el virus del Ébola durante el brote de 2014 2,4. Mediante el acoplamiento de depleción selectiva y la síntesis de ADNc con la construcción de la biblioteca tagmentation, el tiempo de proceso total se redujo en un ~ 2 días a partir de métodos adaptador ligadura anteriores. Más recientemente, este protocolo se empleó por colaboradores internacionales y otros con gran éxito 15,16 y será enviado a los laboratorios en África Occidental para apoyar los estudios de investigación basada en la genómica y diagnóstico local 17. El protocolo descrito aquí utiliza cebadores aleatorios para preparar cDNA para las bibliotecas de ARN-seq virales. A diferencia de los enfoques de ARN-seq virales anteriores, que no requiere un conocimiento a priori de los datos de secuencia o el diseño de cebadores elaborada y requiere mucho tiempo de un virus o clado específico. El método puede aplicarse a cualquier muestra de ARN viral. Por ejemplo, se utiliza para generar el contenido viral de ambos Ebolay muestras de Lassa 6. El protocolo también se puede usar para transcriptómica anfitrión, proyectos de secuenciación metagenomic y descubrimiento patógeno 1. Un paso crítico del protocolo está dirigido digestión RNasa H, un alto rendimiento, método de bajo coste para la eliminación de portadora no deseada y el ARN huésped a partir de muestras virales. La etapa de depleción selectiva del protocolo utiliza muchos componentes y requiere habilidad y precisión. tiempo extra y se debe tener cuidado durante la configuración inicial. Como la mayoría de las muestras de suero y plasma clínicos a menudo tienen muy poco material de ácido nucleico, la contaminación y la pérdida de la muestra son comunes. Para evitar estos problemas, especial se debe tener cuidado al usar este protocolo. En primer lugar, el ARN es altamente susceptible a la degradación; Por lo tanto, todas las áreas deben estar limpias y libres de nucleasas. En segundo lugar, para identificar las muestras adecuadas para su uso en este protocolo, los ensayos de QRT-PCR para ambos ARN del virus de acogida y deben utilizarse para la cuantificación 5,6 </sup&gt;. Cuando se compara con la entrada asciende resultados de la secuenciación del protocolo, el éxito de secuenciación (es decir, la generación de datos suficientes para el ensamblaje viral completo) se correlacionaron con las muestras que contenían al menos 100 pg de ARN total y 1.000 copias del virus. En tercer lugar, la exposición a las fuentes ambientales de los ácidos nucleicos debe ser evitado. El protocolo descrito aquí está hecho en una cabina de bioseguridad como medida de seguridad y para limitar los contaminantes ambientales. Por otra parte, nuestro grupo y otros han dado cuenta de que las enzimas comerciales pueden ser otra fuente de ácidos nucleicos contaminantes bacterianos en muestras de entrada bajas 6,18. El uso de un espacio de trabajo limpio (por ejemplo, PCR capó, cabina de bioseguridad) y controles negativos (por ejemplo, agua o tampón) ayudarán a aliviar y realizar un seguimiento de la contaminación, respectivamente. Para muestras con &lt;100 pg de ARN total, sólo el poli (rA) ARN portador, no rRNA, deberá ser agotado para garantizar resultados de la secuenciación de alta calidad al tiempo que limita la pérdida de material. por muymuestras de entrada bajas, los métodos de amplificación de cDNA pueden ser más adecuados 19, a pesar de poli (rA) portador debe ser eliminado antes de la síntesis de ADNc. El agotamiento de anfitrión rRNA enriquece para el contenido viral en las bibliotecas de secuenciación y es aplicable a diferentes colecciones de muestras incluyendo suero o plasma, y múltiples tipos de tejidos de roedores y primates no humanos 5,6. En los organismos no humanos, las lecturas alinear a 28S rRNA se mantuvo después de la depleción, lo que sugiere 28S rRNA es menos conservadas entre los seres humanos y otras especies de 6,20. Al utilizar este método con los aislados no humanos, puede ser necesario complementar con oligos de ADN complementarias a las secuencias de rRNA divergentes del 3,21 host específico. Dado que el protocolo es imparcial, viral lee puede representar sólo una pequeña fracción del contenido total de biblioteca. Aunque rRNA es la especie más abundante de ARN de acogida y sólo un pequeño porcentaje de ARNr (lee0; 1%) se encuentran después de la depleción selectiva, el resto de ARN huésped (por ejemplo, ARNm) se mantendrá después de agotamiento y puede dar cuenta de que muchos de secuenciación lee de la muestra. Por lo tanto &quot;sobremuestreo&quot; (es decir, oversequencing) bibliotecas individuales se requiere con el fin de tener suficiente cobertura para montaje y variantes virales llamadas. Para nuestros estudios, se intenta secuencia de ~ 20 millones de lecturas por muestra para tener suficiente profundidad para el análisis de variantes genómicas y asociadas a virus, así como el contenido de metagenómica 2,5. Para los estudios de descubrimiento metagenomic y patógenos, es importante tener en cuenta que la contaminación de ADN huésped se retira por digestión con DNasa. Por lo tanto virus y otros patógenos que contienen genomas de ADN se pueden perder durante el proceso, sin embargo intermedios de ARN todavía pueden ser secuenciados.

secuenciación de próxima generación de virus a partir de fuentes clínicas puede informar a la transmisión y la epidemiología de infecciones, así como el apoyo ayuda novela de diagnóstico, y desarrollo de vacunas terapéuticas. la síntesis de ADNc usando cebadores aleatorios ha permitido la detección y el conjunto de los genomas de divergente, co-infectante o incluso nuevos virus 1,2. Al igual que con otros métodos imparciales, los contaminantes no deseados ocupan muchos secuenciación lee y un impacto negativo en los resultados de secuenciación. Anfitrión y poli (rA) ARN transportador son contaminantes presentes en muchas colecciones de muestras virales existentes. El protocolo describe una forma eficiente y rentable de los genomas de virus de ARN de la secuencia de profundidad sobre la base de imparcial RNA-seq total. El método utiliza una RNasa H paso depleción selectiva 3 para eliminar ribosomal de acogida no deseada y el ARN portador. Depleción selectiva enriquece para el contenido viral (Figura 1) y mejora la calidad general de los datos de secuenciación(Figura 2) a partir de muestras clínicas. Por otra parte, tagmentation se aplica al protocolo, ya que reduce significativamente el tiempo de construcción de la biblioteca. Estos métodos se han utilizado para generar rápidamente grandes conjuntos de datos de Ébola y Lassa genomas de virus 2,4,5 y se pueden utilizar para estudiar una amplia gama de virus de ARN. Por último, el enfoque no se limita a las muestras humanas; la utilidad de la depleción selectiva se demostró en muestras de tejido recogidas de roedores infectados por Lassa y modelos de enfermedad de primates no humanos 5,6. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig1.jpg" /> Figura 1. El ARN total contenido refleja Enriquecimiento del contenido de Lassa virus mediante depleción selectiva. A partir contenido global (entrada de ARN) y el enriquecimiento del virus de Lassa única (LASV) lee (contenido de la Biblioteca) en el agotamiento del ARNr a partir de nueve aislados clínicos diferentes. Esta cifra ha sido modificado a partir de 6 <em&gt;. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig2.jpg" /> Figura 2. Calidad Superior Secuenciación Después Carrier RNA agotamiento. Calidades de base mediana de secuenciación por ciclo de poli (rA) contaminadas con el virus de Lassa bibliotecas (rojo) y el control (sin soporte observado en la biblioteca, negro) del informe de control de calidad 13. Ambos leen 1 y 2 de leer extremo emparejado lecturas se fusionan en el archivo de BAM biblioteca y las puntuaciones de calidad se muestran en cada base. Esta cifra ha sido modificado a partir de 6. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> El ARN viral siguientes detalles del protocolo de construcción de bibliotecas directamente desde extraídaARN recogido de muestras clínicas y biológicas. Para garantizar la seguridad personal, todas las muestras de suero, plasma y tejidos virales deben ser inactivados en tampones apropiados antes de la extracción de RNA. En algunos kits de inactivación y de extracción, se incluye poli portador (rA) RNA; este será eliminado durante la etapa inicial de agotamiento selectivo de RNasa H. Sobre la base de la recuperación completa, la concentración esperada de ARN portador es 100 ng / l. En el protocolo, 110 ng / l oligo dT ARN (1,1x concentración de portadores) se utiliza para el agotamiento. Si poli (rA) portadora no está presente en la muestra, a continuación, oligo (dT) no se debe añadir antes de agotamiento. El siguiente protocolo está diseñado para 24 reacciones en formato de placa de PCR (hasta 250 l de volumen). Una versión anterior de este protocolo se informó en Matranga, et al. 6.

<table><tbody><tr><td>96-well PCR Plates</td><td>VWR</td><td>47743-953</td><td></td></tr><tr><td>Strips of Eight Caps</td><td>VWR</td><td>47745-512</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>post RNA extraction step, 2 U/&amp;micro;l, buffer included</td></tr><tr><td>PCR cycler</td><td></td><td></td><td>any PCR cyclers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP SPRI beads&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td><td>beads for RNA cleanup</td></tr><tr><td>Real Time qPCR system</td><td></td><td></td><td>any system</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>prepare fresh</td></tr><tr><td>qRT-PCR primers</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>see &lt;strong&gt;Table 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>5 M NaCl&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Linear acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Ambion&amp;nbsp;</td><td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos covering entire rRNA region</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>see &lt;strong&gt;Table 3&lt;/strong&gt;, order lab-ready at 100 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Oligo (dT)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>40 nt long, desalted</td></tr><tr><td>Hybridase Thermostable RNase H&amp;nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>H39100</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>post selective depletion step</td></tr><tr><td>SUPERase-In RNase Inhibitor</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Random Primers&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>48190-011</td><td>mostly hexamers</td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>with first-strand buffer, DTT</td></tr><tr><td>Air Incubator</td><td></td><td></td><td>any air incubator cyclers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B6117S</td><td>10x</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0205L</td><td>10 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA Polymerase I&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0209L</td><td>10 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0297L</td><td>2 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP SPRI beads</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td>beads for DNA cleanup</td></tr><tr><td>Elution Buffer&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>10 mM Tris HCl, pH 8.5</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Qubit fluorometer&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Index Kit&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2965AA</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Library Quantification Complete kit (Universal)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification</td></tr></tbody></table>

unbiased deep sequencing of rna viruses from clinical samples

Aquí describimos un protocolo de secuenciación de ARN de última generación que permite a los conjuntos de novo y variantes llamadas intra-anfitriones de los genomas virales obtenidos de fuentes clínicas y biológicas. El método es imparcial y universal; que utiliza cebadores aleatorios para la síntesis de cDNA y no requiere conocimiento previo de la contenido de la secuencia viral. Antes de la construcción de bibliotecas, selectiva digestión a base de RNasa H se utiliza para agotar no deseada de ARN - vehículo que incluye poli (rA) y el ARN ribosomal - a partir de la muestra de ARN viral. depleción selectiva mejora tanto la calidad de los datos y el número de única lee en las bibliotecas de secuenciación del ARN viral. Por otra parte, el paso de una a base de transposasa &#39;tagmentation&#39; se utiliza en el protocolo, ya que reduce el tiempo total de construcción de la biblioteca. El protocolo ha permitido profunda secuenciación rápida de más de 600 muestras, incluyendo el virus de Lassa y Ebola colecciones de sangre y tejido aislados y es ampliamente aplicable a otros estudios de genómica microbiana.

El protocolo descrito permite la generación de secuenciación de alta calidad se lee a partir de muestras de ARN viral de bajos insumos, mientras que para el enriquecimiento de contenido viral única. Como se muestra en la Figura 1, el protocolo enriquecido contenido único virus Lassa al menos cinco veces en todas las muestras (en comparación con los controles no agotado) con al menos un millón de copias de 18S rRNA (~ 100 pg de ARN total). Del mismo modo, el éxito de secuenciación también se correlacionó con la cantidad de virus en una muestra dada. Uso de QRT-PCR como un sustituto para la cantidad viral, las muestras que contenían ~ 1.000 o más copias del genoma viral con más frecuencia creados conjuntos completos (datos no mostrados). Además, el agotamiento de poli portador (rA) reduce secuencias de homopolímero de A y T en las bibliotecas, lo que resulta en las preparaciones más limpias y garantizar una mejor calidad de secuenciación lee (Figura 2). bibliotecas finales a partir de muestras clínicas viral baja de entrada a menudo tienen una amplia longitud de los fragmentos de 150 a 1.000 pb(Figura 3). Después de la secuenciación, para reducir los errores de identificación de la muestra y la diafonía entre las bibliotecas dentro de una piscina de 12, sólo el índice lee con una puntuación de calidad de base de 25 (q25) y asegúrese de cero desajustes se mantienen durante el proceso de demultiplexación. Los genomas virales se ensamblan usando una tubería de bioinformática específico para los virus divergentes 2,4-6. Estas herramientas están disponibles en https://github.com/broadinstitute/viral-ngs oa través de plataformas en la nube comerciales 4. <table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Paso 1.1: Reacción DNasa </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen por reacción (l) </td></tr><tr><td> 10x tampón ADNasa </td><td> 7 </td></tr><tr><td> agua libre de nucleasa </td><td> 6 </td></tr><tr><td> ARN viral extraído </td><td> 55 </td></tr><tr><td> DNasa (2 U / &amp; #181; l) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 70 </td></tr><tr><td> Paso 2.1: 5x tampón de hibridación </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen de 1 ml (l) </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7,4) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> agua libre de nucleasa </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> Paso 2.1: 10x tampón de reacción de RNasa H </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen de 1 ml (l) </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7,5) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> agua libre de nucleasa </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> Paso 2.1: El agua wacrilamida lineal ITH </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen de 1 ml de tampón (l) </td></tr><tr><td> agua libre de nucleasa </td><td> 992 </td></tr><tr><td> acrilamida lineal (5 mg / ml) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 1000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Paso 2.2: reacción de hibridación para el agotamiento selectivo </td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen por reacción (l) </td></tr><tr><td> 5x Tampón de Hibridación </td><td> 2 </td></tr><tr><td> rRNA-agotamiento mezcla oligo (100 M) </td><td> 1.22 </td></tr><tr><td> Oligo (d) T (550 ng / l) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tratado con DNasa ARN total </td><td> hasta 5 </td></tr><tr><td> Pico-a ARN (Esto es opcional) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Agua (con acrilamida lineal) </td><td> llevar hasta 10 totales </td></tr><tr><td> volu totalyo </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Paso 2.3: RNasa H de reacción para el agotamiento selectivo </td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen por reacción (l) </td></tr><tr><td> 10x RNasa H Reaction Buffer </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Agua (con acrilamida lineal) </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Termoestable RNasa H (5 U / l) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Paso 2.4: DNasa posterior reacción depleción selectiva </td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen por reacción (l) </td></tr><tr><td> 10x tampón de ADNasa </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Agua (con acrilamida lineal) </td><td> 44.5 </td></tr><tr><td> inhibidor de RNasa (20 U / l) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNasa libre de RNasa I (2,72 U / l) </td><td> 2 </td></tr&gt; <tr><td> Volumen total (con la reacción de RNasa H) </td><td> 75 </td></tr><tr><td colspan="2"> Paso 3.1: síntesis de ADNc, la hibridación del cebador aleatorio </td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen por reacción (l) </td></tr><tr><td> rRNA / ARN portador-agotado </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3 g de cebador al azar </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Paso 3.2: La primera cadena de reacción de síntesis de ADNc </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen (l) </td></tr><tr><td> 5x First-Strand Buffer de Reacción </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT 0,1 M </td><td> 2 </td></tr><tr><td> mezcla de dNTP 10 mM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> inhibidor de RNasa (20 U / l) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> La transcriptasa inversa (añadir última) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Volumen total (con ARN arriba) &lt;/ Td&gt; <td> 20 </td></tr><tr><td colspan="2"> Paso 3.3: de la segunda cadena de reacción de síntesis de ADNc </td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen (l) </td></tr><tr><td> agua libre de RNasa </td><td> 43 </td></tr><tr><td> 10x tampón de reacción de la segunda Strand </td><td> 8 </td></tr><tr><td> mezcla de dNTP 10 mM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> E. coli ADN ligasa (10 U / l) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ADN de E. coli polimerasa I (10 U / l) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> E. coli RNasa H (2 U / l) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Volumen total (con 1 pt reacción de cadena) </td><td> 80 </td></tr><tr><td> Paso 4.2: Reacción Tagmentation </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen (l) </td></tr><tr><td> Amplicón Tagment Mix (ATM) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tagment ADN Buffer (TD) </td&gt; <td> 5 </td></tr><tr><td> Volumen total (con cDNA) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Paso 4.3: Biblioteca de reacción de PCR </td><td></td></tr><tr><td> Reactivo </td><td> Volumen (l) </td></tr><tr><td> PCR Master Mix (NPM) </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Índice 1 imprimación (i7) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Índice 2 imprimación (i5) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Volumen total (con tagmented cDNA) </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Paso 4.3.2: Las condiciones de PCR Biblioteca </td><td></td></tr><tr><td> 72 ° C, 3 min </td><td></td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 seg </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> hasta 18 ciclos de 10 segundos a 95 ° C, 30 seg a 55 ° C, 30 seg a 72 ° C </td></tr><tr><td> 72 ° C, 5 min </td><td></td></tr><tr><td> 10 ° C, para siempre </td><td></td></tr></tbody></table>Tabla 1:. Reacción puesta a punto y tampones paso a paso tablas con contenido de todos los tampones y las mezclas de reacción. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nombre oligo </td><td> Secuencia (5 &#39;a 3&#39;) </td></tr><tr><td> Ébola KGH FW </td><td> GTCGTTCCAACAATCGAGCG </td></tr><tr><td> Ébola KGH RV </td><td> CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT </td></tr><tr><td> Ébola kulesh FW </td><td> TCTGACATGGATTACCACAAGATC </td></tr><tr><td> Ébola kulesh RV </td><td> GGATGACTCTTTGCCGAACAATC </td></tr><tr><td> Lassa SL FW </td><td> GTA AGC CCA GCD GYA AAB CC </td></tr><tr><td> Lassa SL RV </td><td> AAG CCA CAG AAA ECA SGG AGC A </td></tr><tr><td> 18S rRNA FW </td><td> TCCTTTAACGAGGATCCATTGG </td></tr><tr><td> 18S rRNA RV </td><td> CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT </td></tr></tbody></tcapaces&gt; Tabla 2: QRT-PCR Primers secuencias de los cebadores utilizados para la medición de acogida (18S rRNA) y virales contenidos (Ébola y Lassa).. &#39;KGH&#39; es el hospital público de Kenema en Sierra Leona, donde los cebadores de Ébola se probaron 2. &#39;Kulesh&#39; es el investigador que diseñó el conjunto de cebadores 14. Tabla 3: ARN ribosomal (ARNr) Agotamiento Oligos 195 largas secuencias de 50 nucleótidos complementarios al ARNr humana para el paso depleción selectiva 6.. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

La secuenciación profunda imparcial de virus de ARN de muestras clínicas

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

unbiased-deep-sequencing-of-rna-viruses-from-clinical-samples

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

16.8K vistas.  Broad Institute of MIT and Harvard. This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Investigación

Inmunología e Infección

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

De alto rendimiento, extracción automática de ADN y RNA de muestras clínicas utilizando la tecnología TruTip en común Robots Manejo de líquidos

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Bioingeniería

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Secuenciación de ARNm de sangre entera utilizando secuenciación de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Genética

Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for several different viruses. These approaches utilize an overlapping amplicon-based approach which can be used to target a specific virus or group of genetically related viruses. In addition to confirmation of the virus presence, sequencing can be used for genomic epidemiology studies, to track viruses and unravel origins, reservoirs and modes of transmission. For such applications, it is crucial to understand possible effects of the error rate associated with the platform used. Routine application in clinical and public health settings require that this is documented with every important change in the protocol. Previously, a protocol for whole genome Usutu virus sequencing on the nanopore sequencing platform was validated (R9.4 flowcell) by direct comparison to Illumina sequencing. Here, we describe the method used to determine the required read coverage, using the comparison between the R10 flow cell and Illumina sequencing as an example.

We previously validated a protocol for amplicon-based whole genome Usutu virus (USUV) sequencing on a nanopore sequencing platform. Here, we describe the methods used in more detail and determine the error rate of the nanopore R10 flow cell.

Validación de la secuenciación de nanoporos del genoma completo, utilizando el virus Usutu como ejemplo

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for ...

Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples

Wastewater-based epidemiology has emerged as a promising and efficacious surveillance system for SARS-CoV-2 and other infectious diseases in many nations. The process typically involves wastewater concentration, nucleic acid extraction, amplification of selected genomic segments, and detection and quantification of the amplified genomic segment. This methodology can similarly be leveraged to detect and quantify infectious agents, such as SARS-CoV-2, in air samples. Initially, SARS-CoV-2 was presumed to spread primarily through close personal contact with droplets generated by an infected individual while speaking, sneezing, coughing, singing, or breathing. However, a growing number of studies have reported the presence of SARS-CoV-2 RNA in the air of healthcare facilities, establishing airborne transmission as a viable route for the virus. This study presents a composite of established protocols to facilitate environmental detection, quantification, and sequencing of viruses from both wastewater and air samples.

This protocol aims to quantify SARS-CoV-2 RNA in wastewater and air samples to be used for wastewater-based epidemiology studies and to assess the exposure risk to SARS-CoV-2 in indoor and outdoor aerosols. This protocol also describes a tiled amplicon long-template sequencing approach for SARS-CoV-2 whole genome characterization.

Cuantificación y caracterización del genoma completo del ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire

Wastewater-based epidemiology has emerged as a promising and efficacious surveillance system for SARS-CoV-2 and other infectious diseases in many nations. ...

Medio ambiente

Análisis de la dinámica del ARNt mediante AQRNA-seq

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

Autor destacado: El papel de AQRNA-seq en el mapeo de ARN pequeños y el desentrañamiento de los mecanismos de traducción de proteínas

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

La secuenciación profunda imparcial de virus de ARN de muestras clínicas

Resumen

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Capítulos en este video

El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos

De alto rendimiento, extracción automática de ADN y RNA de muestras clínicas utilizando la tecnología TruTip en común Robots Manejo de líquidos

Secuenciación de ARNm de sangre entera utilizando secuenciación de nanoporos

Validación de la secuenciación de nanoporos del genoma completo, utilizando el virus Usutu como ejemplo

Cuantificación y caracterización del genoma completo del ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire

AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños

AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños

AQRNA-seq para cuantificar ARNs pequeños

La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala