This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).

declaração de ética: pacientes febre de Lassa foram recrutados para este estudo usando protocolos aprovados por comitês de assuntos humanos na Universidade de Tulane, Universidade de Harvard, o Instituto Broad, Irrua Specialist Hospital de Ensino (ISTH), Hospital Governo Kenema (KGH), Oyo Ministério da Saúde do Estado, Ibadan , Nigéria e Serra Leoa Ministério da Saúde. Todos os pacientes foram tratados com um padrão semelhante de cuidado e receberam a droga ribavirina, com ou sem eles decidiram participar do estudo. Para pacientes com febre de Lassa (LF), o tratamento com Ribavirina seguiu as diretrizes recomendadas atualmente e foi geralmente oferecido tão logo LF foi fortemente suspeito. Devido à grave surto de doença do vírus Ebola (EVD), os pacientes não poderiam ser consentido através de nossos protocolos padrão. Em vez disso utilização de amostras clínicas excesso de pacientes EVD foi avaliado e aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional na Serra Leoa e na Universidade de Harvard. o Office do Comité de Serra Leoa Ética e de análise científica, a Serra Leoa Ministério da Saúde e Saneamento, e ao Comité de Harvard sobre o Uso de Seres Humanos ter concedido uma dispensa do consentimento para sequenciar e fazer sequências virais disponíveis publicamente obtidos a partir de amostras de pacientes e de contato coletadas durante o surto de Ebola em Serra Leoa. Esses órgãos também concedeu uso de dados clínicos e epidemiológicos para amostras identificou-de coletados de todos os pacientes suspeitos EVD recebem cuidados durante a resposta ao surto. A Serra Leoa Ministério da Saúde e Saneamento aprovou também as transferências de não-infecciosas amostras, não-biológicos de Serra Leoa para Broad Institute e da Universidade de Harvard para estudos genômicos de amostras de surto. 1. DNase-tratamento do RNA da amostra (até 55 jil de extracção de ARN total, ~ 4 h) <ol><li> Defina-se a reacção de ADNase numa placa de 96 poços de PCR em gelo numa cabine de segurança biológica tal como descrito na Tabela 1 </strong&gt;, Passo 1.1 (volume total, de 70 uL / ​​poço). Nota: A mistura principal pode ser preparado. </li><li> Vortex suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Limpeza usando fase sólida reversível imobilização (SPRI) grânulos de ARN. <ol><li> grânulos de RNA aquecimento à temperatura ambiente durante 30 minutos. </li><li> Agitar suavemente garrafa esferas de RNA para voltar a suspender as partículas magnéticas que podem se instalaram. Adicionar volume de 1,8x (126 ul) de grânulos de ARN para ARN tratado com ADNase (70 mL), mistura com uma pipeta de 10 vezes e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (o volume total no poço, 196 uL). </li><li> Coloque a mistura de na estação magnético. Aguarde até que a solução para limpar (5-10 min). </li><li> Remova a solução apagada, enquanto na estação com uma pipeta e descarte. Enquanto na estação, lavar grânulos através da cobertura de sedimento com etanol a 70% e incubar durante 1 min. Remover o etanol com pipeta e descarte. Repetir para um total de duas lavagens. Nota: O uso et precisamente 70% preparado de frescohanol é crítica, como uma percentagem mais elevada resultará na lavagem ineficiente de moléculas menores em tamanho, enquanto que &lt;70% de etanol poderia causar a perda de amostra 7. </li><li> Mantenha placa na estação e deixar em aberto a secar ao ar. Nota: Certifique-se de permitir que as contas para secar completamente até contas de começar a rachar. </li><li> Adicionar 55 ul de água isenta de nuclease para a placa para eluir o ARN. Retire a placa da estação para misturar os grânulos e água pipetando cuidadosamente. Nota: Em alternativa, usar menos água (≤ 10 uL), a fim de concentrar o ARN total. </li><li> Coloque placa de volta na estação. Aguardar até que a solução limpa para transferir por pipeta para novo tubo com tampa de rosca para o armazenamento a longo prazo (-80 ° C). Coloque 5 ul de ARN na nova placa de 96 poços de PCR para a depleção (passo. 2.4). </li><li> Opcional:. Excepto e dilui-se 1 ml em 19 ul de água (01:20) para qRT-PCR de rRNA (por exemplo, 18S, 28S rRNA) (Tabela 2) e os marcadores virais 5 &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 2. depleção selectiva de ribossomal e Carrier ARN a partir de ARN viral da amostra (~ 4 h) <ol><li> Adicione hibridação 5x e 10x tampões de reacção de RNase H, e água isenta de nuclease com o transportador linear de acrilamida, tal como descrito na Tabela 1. </li><li> Defina-se a reacção de hibridação através da combinação de ARN com oligos de depleção de rRNA (Tabela 3) e o oligo (dT) em gelo numa placa de 96 poços de PCR como descrito na Tabela 1. Nota: A mistura principal pode ser preparado. 50 femtogramas (fg) de um RNA sintético único (ERCCs 8) podem ser adicionados para acompanhar tanto o processo de sequenciamento viral e potencial índice de ler a contaminação cruzada. <ol><li> Vortex suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. Incubar a 95 ° C durante 2 min, rampa lento para 45 ° C a -0,1 ° C por segundo. Pause o termociclador a 45 ° C. </li></ol></li><li> Configurar RNase H mistura de reacção em gelo como descreverd na Tabela 1, em seguida, pré-aquecer a 45 ° C durante 2 min. Nota: A mistura principal pode ser preparado. <ol><li> Adicionar a mistura de RNase H de pré-aqueceu-se a reacção de hibridação em placa, mantendo a placa no termociclador a 45 ° C. </li><li> Misture bem por pipetagem suave 6 - 8 vezes. Incubar a 45 ° C durante mais 30 min. Coloque no gelo. </li></ol></li><li> Defina-se a mistura de reacção em gelo ADNase tal como descrito na Tabela 1 Nota:. A mistura principal pode ser preparado. <ol><li> Adicionar à reacção de RNase H em placa, de vórtice suave e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Pare ADNase reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5M. Vortex suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. </li></ol></li><li> Cleanup usando esferas de RNA (ver passo 1.3), utilizando um volume de 1,8x (144 mL) esferas. Eluir em 11 mL de água livre de nuclease. Nota: Para armazenamento a frio seguro, armazenamento esgotada RNA amostras a -80 ° C O / N. </li></ol> 3. Síntese de cDNA (~ 6 h) <ol><li> Mistura rRNA / ARN empobrecido-transportador com iniciadores aleatórios sobre gelo numa placa de 96 poços de PCR como descrito na Tabela 1, de vórtice suave e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. <ol><li> Aquecer a mistura a 70 ° C durante 10 minutos num termociclador. Imediatamente após a desnaturação pelo calor, colocar o ARN em gelo durante 1-5 minutos. Não permitir que o ARN em repouso (mesmo em gelo) durante mais de 5 minutos antes da reacção da primeira cadeia. </li></ol></li><li> Defina-se da primeira cadeia mistura de reacção de síntese em gelo tal como descrito na Tabela 1. Nota: Um mestre de mistura pode ser preparada. <ol><li> Adicionar ao ARN / mistura de iniciadores aleatórios em placa, de vórtice suave e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. Incubar a 22 - 25 ° C durante 10 min. </li><li> Incubar a 55 ° C numa incubadora de ar durante 60 min. Colocar a placa em gelo para terminar a reacção. NãoE: O uso de uma incubadora de ar é recomendado para criar o aquecimento gradual da primeira cadeia de reacção durante o qual o recozimento iniciadores e a primeira cadeia começa a alongar-se. </li></ol></li><li> Defina-se da segunda cadeia mistura de reacção de síntese em gelo tal como descrito na Tabela 1. Nota: Um mestre de mistura pode ser preparada. <ol><li> Adicionar à primeira cadeia de síntese de reacção na placa, de vórtice suave e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. Incubar durante 2 horas a 16 ° C (manter a tampa a 25 ° C). Não permitir que a temperatura subisse acima de 16 ° C. </li><li> Colocar a placa sobre gelo, em seguida, inactivar reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5 M, mistura suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. </li></ol></li><li> Limpeza com contas de DNA (veja o passo 1.3 para o protocolo) usando volume de 1,8x (153 mL) de contas. Eluir em 9 ul de tampão de eluição (EB). Salve 1 ul para quantificação. Use de 1 ng de cDNA para subsequepassos NT. Se a concentração de cDNA é muito baixo para detectar, utilize 4 l de cDNA para tagmentation (veja o passo 4.1). </li><li> Para o armazenamento a frio, armazene ADNc de cadeia dupla a 4 ° CO / N ou -20 ° C para armazenamento a longo prazo. </li></ol> 4. Biblioteca de Preparação - Construção de ADN da biblioteca (~ 4 h) <ol><li> Transferência 4 uL de ADNc a uma placa de 96 poços e guardar o restante ADNc para uma segunda tentativa, se necessário. </li><li> Defina-se a reacção tagmentation em gelo tal como descrito na Tabela 1. Nota: Um mestre de mistura pode ser preparada. Para reduzir o fundo e o custo total, o volume total da reacção tagmentation é reduzida de 20 a 10 ul. Como ADNc é o factor limitante, a quantidade de ATM (ou seja, transposome) usado na reacção é também reduzida para diminuir o número de sítios de integração. <ol><li> Adicionar mistura tagmentation de ADNc na placa, de vórtice suave e completamente e centrifugar a 280 xg (à TA) durante 1 min.Incubar a 55 ° C durante 5 min, manter a 10 ° C. </li><li> Uma vez a 10 ° C, adicionar imediatamente com 2,5 mL de tampão de Neutralizar Tagment (NT) para terminar a reacção. Misturar por pipetagem cima e para baixo, em seguida, centrifugar a 280 xg (à temperatura ambiente) durante 1 min. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li></ol></li><li> Defina-se a amplificação por PCR da reacção em gelo tal como descrito na Tabela 1. <ol><li> Vortex suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Executar PCR no termociclador utilizando as condições descritas na Tabela 1. Nota: 12 ciclos de PCR são sugeridos para 1 ng de ADNc tagmented; No entanto, as amostras clínicas virais têm frequentemente quantidades indetectáveis ​​de ADNc. Para pequenas quantidades de cDNA (&lt;1 ng), utilizar até 18 ciclos de PCR para criar biblioteca suficiente para sequenciamento. </li></ol></li><li> preparação Biblioteca - limpeza e de partilha para a sequenciação <ol><li> Trazer amostra até 50 ul com EB. </li><li> Limpeza comgrânulos de DNA (veja o passo 1.3 para o protocolo), utilizando o volume de 0,6x (30 ul) grânulos. Eluir em 15 mL EB. </li><li> Determinar a concentração de biblioteca (Figura 3) através da realização de análise região (150 a 1000 pb), utilizando o software Bioanalyzer 9, excluindo dímeros de iniciadores (~ 120 pb) a partir de análise região. Nota: Em alternativa, qPCR pode ser utilizado para quantificar as bibliotecas 10. </li><li> bibliotecas piscina na concentração molar menor de 1 nM ou superior. Se biblioteca é inferior a 1 nM, adicionar um pequeno volume de biblioteca para piscina (~ 1x o volume de outras bibliotecas) para capturar informação de sequência a partir destas bibliotecas. </li><li> piscina de limpeza com contas de DNA 0,7x, conforme descrito acima (veja o passo 2). Eluir em 15 mL EB. Nota: O volume de grânulos irá depender do volume final da piscina. </li><li> Analisar piscina 9. Determinar a concentração molar através da realização de análise região (150 a 1000 pb) 9. Nota: Em alternativa, qPCR pode ser utilizado para quantificar piscina biblioteca 10 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Carga sequenciador na concentração biblioteca 22:00 para gerar 101 pb, emparelhado-end lê com dual código de barras lê 11. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig3.jpg" /> Figura 3. bibliotecas construídas a partir de vírus Ebola amostras clínicas. Image Gel de 4 de representante do vírus Ebola bibliotecas (EBOV). Regiões de biblioteca e de primers dímeros são apresentados. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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The authors have no competing financial interests.

A abordagem descrita permite robusta, universal sequenciamento, rápido e foi usado para sequenciar o vírus Ebola durante a 2,4 2.014 surto. Ao acoplar a depleção selectiva de síntese de ADNc e com a construção da biblioteca tagmentation, o tempo total de processo foi reduzida em aproximadamente 2 dias de métodos adaptador de ligação anteriores. Mais recentemente, este protocolo foi empregado por colaboradores internacionais e outros com grande sucesso 15,16 e será implantado em laboratórios na África Ocidental para apoiar estudos de investigação genómica baseada em locais e diagnósticos 17. O protocolo aqui descrito utiliza iniciadores aleatórios para preparar bibliotecas de ADNc para ARN-SEQ virais. Ao contrário de abordagens de ARN-virais SEQ anteriores, que não requer um conhecimento a priori de dados de sequências ou design elaborado e demorado de iniciadores para um vírus ou subtipo específico. O método pode ser aplicado a qualquer amostra de ARN viral. Por exemplo, ele foi usado para gerar conteúdo viral de ambos Ebolae amostras de Lassa 6. O protocolo também pode ser utilizado para transcriptómica hospedeiro, projectos de sequenciação e detecção de agentes patogénicos metagenomic 1. Uma etapa fundamental do protocolo é a digestão alvo ARNase H, um de elevado rendimento, o método de baixo custo para a remoção indesejada transportadora e ARN do hospedeiro a partir de amostras virais. O passo de depleção selectiva do protocolo utiliza muitos componentes e requer habilidade e exactidão. tempo e cuidado extra deve ser tomado durante a configuração inicial. Como a maioria das amostras de soro e plasma clínicos muitas vezes têm muito pouco material de ácido nucleico, contaminação e perda de amostra são comuns. Para evitar esses problemas, cuidados especiais devem ser tomados ao usar este protocolo. Primeiro, o ARN é altamente susceptível à degradação; portanto, todas as áreas devem estar limpas e livres de nucleases. Em segundo lugar, para identificar amostras adequadas para utilização no presente protocolo, ensaios de qRT-PCR para ambos ARN do hospedeiro e vírus deve ser utilizado para quantificação 5,6 </sup&gt;. Quando se compara a entrada com montantes de sequenciação resultados do protocolo de sequenciação, o sucesso (isto é, geração de dados suficientes para a montagem virai completo) correlacionaram-se com as amostras que continham pelo menos 100 pg de RNA total e 1.000 cópias do vírus. Em terceiro lugar, a exposição a fontes ambientais de ácidos nucleicos devem ser evitados. O protocolo descrito aqui é feito de uma cabine de segurança biológica para precauções de segurança e para limitar contaminantes ambientais. Além disso, o nosso grupo e outros têm notado que as enzimas comerciais, podem ser outra fonte de ácidos nucleicos contaminantes bacterianos em amostras de entrada baixa 6,18. O uso de um espaço de trabalho limpo (por exemplo, capô PCR, cabine de segurança biológica) e controlos negativos (por exemplo, água ou tampão) vai ajudar a aliviar e controlar a contaminação, respectivamente. Para amostras com &lt;100 pg de ARN total, apenas de poli (rA) RNA transportador, não ARNr, deve ser esgotado para assegurar resultados de sequenciação de alta qualidade, evitando a perda de material. por muitoamostras de entrada baixas, métodos de amplificação de cDNA pode ser mais adequado 19, apesar de poli (rA) transportador deve ser removido antes da síntese de ADNc. A depleção de acolhimento rRNA enriquece para conteúdo viral em bibliotecas de sequenciação e é aplicável a diferentes colecções de amostras incluindo plasma ou soro, e vários tipos de tecidos de roedores e primatas não-humanos 5,6. Em organismos não humanos, as leituras de alinhamento 28S rRNA permaneceu após esgotamento, sugerindo 28S rRNA é menos conservada entre humanos e outras espécies de 6,20. Ao utilizar este método com estirpes não-humanos, pode ser necessário para completar, com oligos de ADN complementares às sequências de rRNA 3,21 divergentes do hospedeiro específico. Como o protocolo é imparcial, viral lê podem representar apenas uma pequena fração do conteúdo total de biblioteca. Embora rRNA é a espécie mais abundante de ARN do hospedeiro e apenas uma pequena percentagem de rRNA lê (0; 1%) são encontrados após a depleção selectiva, todos os outros ARN do hospedeiro (por exemplo, ARNm) permanecerá depois de exaustão e pode ser responsável por muitos sequenciação lê a partir da amostra. Portanto &quot;oversampling&quot; (ou seja, oversequencing) bibliotecas individuais é necessária, a fim de ter uma cobertura suficiente para chamadas de montagem e de variantes virais. Para os nossos estudos, tentamos sequência de ~ 20 milhões de leituras por amostra ter profundidade suficiente para a análise de variantes genômica e associado viral, bem como conteúdo metagenomic 2,5. Para os estudos de descoberta metagenomic e organismos patogénicos, é importante notar que a contaminação de ADN do hospedeiro é removido por digestão de DNase. Por conseguinte, os vírus e outros agentes patogénicos que contêm genomas de ADN podem ser perdidas durante o processo, no entanto intermediários de RNA pode ainda ser sequenciado.

geração de sequenciamento próxima de vírus a partir de fontes clínicas pode informar transmissão e epidemiologia das infecções, bem como ajuda o apoio romance de diagnóstico, vacinas e desenvolvimento terapêutico. síntese de cDNA utilizando iniciadores aleatórios permitiu a detecção e montagem de genomas de divergente, co-infectante ou mesmo novos vírus 1,2. Tal como acontece com outros métodos imparciais, contaminantes indesejados ocupam muitos sequenciamento lê e impactar negativamente os resultados de sequenciamento. Host e poli RNA transportador (RA) são contaminantes presentes em muitas colecções de amostras virais existentes. O protocolo descreve de forma eficiente e rentável de genomas virais de ARN sequenciamento profundas com base em preconceitos RNA-seq total. O método utiliza uma depleção selectiva passo 3 ARNase H para remover ribossomal hospedeiro indesejado e ARN transportador. Depleção selectiva enriquece para conteúdo viral (Figura 1) e melhora a qualidade global dos dados de sequenciação(Figura 2) a partir de amostras clínicas. Além disso, tagmentation é aplicada ao protocolo, uma vez que reduz significativamente o tempo de construção da biblioteca. Estes métodos têm sido usados ​​para gerar rapidamente grandes conjuntos de dados do Ebola e Lassa genomas de vírus 2,4,5 e pode ser usado para estudar uma grande variedade de vírus de ARN. Por último, a abordagem não está limitado a amostras humanas; a utilidade da depleção selectiva foi demonstrada em amostras de tecidos obtidas de roedores de Lassa-infectadas e modelos de doença de primatas não humanos 5,6. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig1.jpg" /> Figura 1. Total de RNA conteúdo reflete Enriquecimento de conteúdo Vírus Lassa Usando Selective esgotamento. A partir conteúdo global (entrada RNA) e enriquecimento do vírus original Lassa (LasV) lê (teor Library) sobre esgotamento rRNA de nove isolados clínicos diferentes. Esta figura foi modificado a partir de 6 <em&gt;. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig2.jpg" /> Figura 2. Maior Qualidade Sequencing Após portador RNA Esgotamento. Qualidades de base medianos por ciclo de sequenciação de poli (rA) -contaminated bibliotecas de vírus de Lassa (vermelho) e controle (sem portadora observado na biblioteca, preto) do relatório de QC 13. Tanto ler 1 e leia 2 de final emparelhado lê são mesclados no arquivo BAM biblioteca e os índices de qualidade são mostrados em cada base. Este valor foi modificado a partir do 6. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> O detalhes do protocolo de construção RNA-seq viral de bibliotecas directamente a partir extraídoARN recolhido a partir de amostras clínicas e biológicas. Para garantir a segurança pessoal, todas as amostras de soro, plasma e tecido virais devem ser inactivado em tampões apropriados antes da extração do RNA. Em alguns kits de inactivação e de extracção, poli transportador ARN (AR) é incluído; este vai ser removida durante o passo inicial depleção selectiva de RNase H. Com base na recuperação completa, a concentração esperada de ARN transportador é de 100 ng / ul. No protocolo, 110 ng / ul de oligo dT de ARN (concentração transportador 1,1x) é usada para depleção. Se poli (rA) portadora não está presente na amostra, em seguida, oligo (dT) não deve ser adicionado antes do esgotamento. O seguinte protocolo foi concebido para 24 reacções de PCR em formato de placa (até 250 ul de volume). Uma versão anterior deste protocolo foi relatada em Matranga, et al. 6.

<table><tbody><tr><td>96-well PCR Plates</td><td>VWR</td><td>47743-953</td><td></td></tr><tr><td>Strips of Eight Caps</td><td>VWR</td><td>47745-512</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>post RNA extraction step, 2 U/&amp;micro;l, buffer included</td></tr><tr><td>PCR cycler</td><td></td><td></td><td>any PCR cyclers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP SPRI beads&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td><td>beads for RNA cleanup</td></tr><tr><td>Real Time qPCR system</td><td></td><td></td><td>any system</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>prepare fresh</td></tr><tr><td>qRT-PCR primers</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>see &lt;strong&gt;Table 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>5 M NaCl&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Linear acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Ambion&amp;nbsp;</td><td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos covering entire rRNA region</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>see &lt;strong&gt;Table 3&lt;/strong&gt;, order lab-ready at 100 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Oligo (dT)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>40 nt long, desalted</td></tr><tr><td>Hybridase Thermostable RNase H&amp;nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>H39100</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>post selective depletion step</td></tr><tr><td>SUPERase-In RNase Inhibitor</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Random Primers&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>48190-011</td><td>mostly hexamers</td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>with first-strand buffer, DTT</td></tr><tr><td>Air Incubator</td><td></td><td></td><td>any air incubator cyclers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B6117S</td><td>10x</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0205L</td><td>10 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA Polymerase I&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0209L</td><td>10 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0297L</td><td>2 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP SPRI beads</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td>beads for DNA cleanup</td></tr><tr><td>Elution Buffer&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>10 mM Tris HCl, pH 8.5</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Qubit fluorometer&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Index Kit&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2965AA</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Library Quantification Complete kit (Universal)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification</td></tr></tbody></table>

unbiased deep sequencing of rna viruses from clinical samples

Aqui destacamos um protocolo de sequenciação de RNA de última geração que permite montagens de novo e chamadas variantes intra-hospedeiras de genomas virais recolhidos a partir de fontes clínicas e biológicas. O método é imparcial e universal; que utiliza iniciadores aleatórios para a síntese de cDNA e não necessita de conhecimento prévio do conteúdo sequência viral. Antes da construção da biblioteca, digestão selectiva baseada-H de ARNase é utilizada para esgotar ARN indesejado - transportador incluindo poli (rA) e ARN ribossomal - a partir da amostra de RNA viral. depleção selectiva melhora tanto a qualidade dos dados e o número de exclusivo lê em bibliotecas RNA sequenciamento viral. Além disso, um passo à base de transposase &#39;tagmentation&#39; é utilizado no protocolo, uma vez que reduz o tempo global de construção da biblioteca. O protocolo permitiu a sequenciação rápida e profunda de mais de 600 amostras-incluindo Lassa e Ebola vírus coleções de sangue e tecido isola-e é amplamente aplicável a outros estudos de genômica microbiana.

O protocolo descrito permite a geração de sequenciamento de alta qualidade lê a partir de amostras de RNA viral baixa de entrada enquanto enriquece para conteúdo viral único. Como mostrado na Figura 1, o protocolo enriquecido conteúdo único vírus de Lassa, pelo menos, cinco vezes em todas as amostras (em comparação com os controlos não-empobrecido) com, pelo menos, um milhão de cópias de rRNA 18S (~ 100 pg de RNA total). Do mesmo modo, o sucesso de sequenciação também correlacionada com a quantidade de vírus numa dada amostra. Usando qRT-PCR como um substituto para a quantidade viral, as amostras que continham ~ 1.000 ou mais cópias de genoma virais mais frequentemente criados conjuntos completos (dados não mostrados). Além disso, a depleção de poli transportadora (Ra) reduz sequências Homopolímero de A e T, em bibliotecas, resultando em preparações mais limpas e assegurar uma melhor qualidade de sequenciação lê (Figura 2). bibliotecas finais de amostras clínicas viral baixa de entrada, muitas vezes têm um amplo comprimento de fragmentos de 150 a 1000 pb(Figura 3). Após sequenciação, para reduzir erros de identificação da amostra e crosstalk entre as bibliotecas dentro de uma piscina de 12, único índice lê com uma pontuação de 25 (Q25) a qualidade de base e assegurar a inexistência de incompatibilidades são mantidos durante o processo de desmultiplexagem. Genomas virais são montados utilizando um oleoduto bioinformática específico para vírus divergentes 2,4-6. Estas ferramentas estão disponíveis em https://github.com/broadinstitute/viral-ngs ou através de plataformas em nuvem comerciais 4. <table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Passo 1.1: reacção ADNase </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> tampão 10x DNase </td><td> 7 </td></tr><tr><td> água livre de nuclease </td><td> 6 </td></tr><tr><td> ARN virai extraído </td><td> 55 </td></tr><tr><td> ADNase (2 U / &amp; #181; l) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 70 </td></tr><tr><td> Passo 2.1: 5x tampão de hibridação </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume para 1 ml (mL) </td></tr><tr><td> 5 M de NaCl </td><td> 200 </td></tr><tr><td> M de Tris-HCl 1 M (pH 7,4) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> água livre de nuclease </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td> Passo 2.1: 10x tampão de reacção de RNase H </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume para 1 ml (mL) </td></tr><tr><td> 5 M de NaCl </td><td> 200 </td></tr><tr><td> M de Tris-HCl 1 M (pH 7,5) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 1 M de MgCl2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> água livre de nuclease </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td> Passo 2.1: Água wacrilamida linear om </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume para 1 ml de tampão (pi) </td></tr><tr><td> água livre de nuclease </td><td> 992 </td></tr><tr><td> acrilamida Linear (5 mg / ml) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Passo 2.2: reacção de hibridação para a depleção selectiva </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> Tampão de Hibridização de 5x </td><td> 2 </td></tr><tr><td> -rRNA depleção mistura de oligo (100 uM) </td><td> 1,22 </td></tr><tr><td> Oligo (d) t (550 ng / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> tratado com ADNase ARN total </td><td> Até 5 </td></tr><tr><td> Spike-in RNA (Isto é opcional) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Água (com acrilamida linear) </td><td> levar até um total de 10 </td></tr><tr><td> volu totalmim </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Passo 2.3: RNase H reacção de depleção selectiva </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> Tampão de Reacção 10x ARNase H </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Água (com acrilamida linear) </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Termoestável ARNase H (5 U / uL) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Passo 2.4: DNase pós reacção de depleção selectiva </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> Tampão de ADNase 10x </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> Água (com acrilamida linear) </td><td> 44,5 </td></tr><tr><td> inibidor de ARNase (20 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> livre de RNase DNase I (2,72 U / uL) </td><td> 2 </td></tr&gt; <tr><td> O volume total (com reacção de RNase H) </td><td> 75 </td></tr><tr><td colspan="2"> Passo 3.1: síntese de ADNc, hibridação do iniciador aleatório </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> rRNA ARN / empobrecido-transportador </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3 ug de iniciador aleatório </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Passo 3.2: A primeira cadeia de reacção de síntese de ADNc </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> 5x primeira cadeia Tampão de Reacção </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 0,1 M de DTT </td><td> 2 </td></tr><tr><td> de mistura de dNTP 10 mM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> inibidor de ARNase (20 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> transcriptase reversa (adicione passado) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> O volume total (com o ARN acima) &lt;/ Td&gt; <td> 20 </td></tr><tr><td colspan="2"> Passo 3.3: segunda cadeia reação de síntese de cDNA </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> água livre de RNase </td><td> 43 </td></tr><tr><td> 10x Tampão de reacção da segunda cadeia </td><td> 8 </td></tr><tr><td> de mistura de dNTP 10 mM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> E. coli ADN-ligase (10 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ADN de E. coli polimerase I (10 U / ul) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> E. coli RNase H (2 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> O volume total (com 1º reacção vertente) </td><td> 80 </td></tr><tr><td> Passo 4.2: reacção Tagmentation </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> Amplicon Mix Tagment (ATM) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tampão de DNA Tagment (TD) </td&gt; <td> 5 </td></tr><tr><td> O volume total (com ADNc) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Passo 4.3: Biblioteca de reacção de PCR </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> PCR Master Mix (NPM) </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> Índice 1 primário (i7) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Índice 2 de primer (i5) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> O volume total (com tagmented ADNc) </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Passo 4.3.2: As condições de PCR da biblioteca </td><td></td></tr><tr><td> 72 ° C, 3 min </td><td></td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 seg </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> -se a 18 ciclos de 10 seg a 95 ° C, 30 seg a 55 ° C, 30 seg a 72 ° C </td></tr><tr><td> 72 ° C, 5 min </td><td></td></tr><tr><td> 10 ° C, sempre </td><td></td></tr></tbody></table>Tabela 1:. Reacção set-up e buffers Passo-a-passo tabelas com conteúdo de todos os buffers e misturas de reacção. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome oligo </td><td> Sequência (5 &#39;para 3&#39;) </td></tr><tr><td> Ebola KGH FW </td><td> GTCGTTCCAACAATCGAGCG </td></tr><tr><td> Ebola KGH RV </td><td> CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT </td></tr><tr><td> Ebola kulesh FW </td><td> TCTGACATGGATTACCACAAGATC </td></tr><tr><td> Ebola kulesh RV </td><td> GGATGACTCTTTGCCGAACAATC </td></tr><tr><td> Lassa SL FW </td><td> GTA AGC CCA GCD GYA AAB CC </td></tr><tr><td> Lassa SL RV </td><td> AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A </td></tr><tr><td> 18S rRNA FW </td><td> TCCTTTAACGAGGATCCATTGG </td></tr><tr><td> 18S rRNA RV </td><td> CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT </td></tr></tbody></tcapaz&gt; Tabela 2: qRT-PCR Primers Sequências de iniciadores utilizados para medir host (18S rRNA) e viral conteúdo (Ebola e Lassa).. &#39;KGH&#39; é Hospital Kenema Governo da Serra Leoa, onde os iniciadores de Ebola foram testados 2. &#39;Kulesh&#39; é o investigador que projetou o conjunto de primers 14. Tabela 3: RNA ribossomal (rRNA) Exaustão Oligos 195 50-nucleotide longas sequências complementares para rRNA humano para a etapa depleção selectiva 6.. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a>

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Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Sequenciamento profundo imparcial de Vírus RNA de amostras clínicas

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

unbiased-deep-sequencing-of-rna-viruses-from-clinical-samples

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

16.8K visualizações.  Broad Institute of MIT and Harvard. This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Imunologia e Infecção

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Bioengenharia

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenciamento de mRNA de sangue total usando sequenciamento de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Genética

Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for several different viruses. These approaches utilize an overlapping amplicon-based approach which can be used to target a specific virus or group of genetically related viruses. In addition to confirmation of the virus presence, sequencing can be used for genomic epidemiology studies, to track viruses and unravel origins, reservoirs and modes of transmission. For such applications, it is crucial to understand possible effects of the error rate associated with the platform used. Routine application in clinical and public health settings require that this is documented with every important change in the protocol. Previously, a protocol for whole genome Usutu virus sequencing on the nanopore sequencing platform was validated (R9.4 flowcell) by direct comparison to Illumina sequencing. Here, we describe the method used to determine the required read coverage, using the comparison between the R10 flow cell and Illumina sequencing as an example.

We previously validated a protocol for amplicon-based whole genome Usutu virus (USUV) sequencing on a nanopore sequencing platform. Here, we describe the methods used in more detail and determine the error rate of the nanopore R10 flow cell.

Validando o sequenciamento de nanoporos de genoma inteiro, usando o vírus Usutu como exemplo

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for ...

Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples

Wastewater-based epidemiology has emerged as a promising and efficacious surveillance system for SARS-CoV-2 and other infectious diseases in many nations. The process typically involves wastewater concentration, nucleic acid extraction, amplification of selected genomic segments, and detection and quantification of the amplified genomic segment. This methodology can similarly be leveraged to detect and quantify infectious agents, such as SARS-CoV-2, in air samples. Initially, SARS-CoV-2 was presumed to spread primarily through close personal contact with droplets generated by an infected individual while speaking, sneezing, coughing, singing, or breathing. However, a growing number of studies have reported the presence of SARS-CoV-2 RNA in the air of healthcare facilities, establishing airborne transmission as a viable route for the virus. This study presents a composite of established protocols to facilitate environmental detection, quantification, and sequencing of viruses from both wastewater and air samples.

This protocol aims to quantify SARS-CoV-2 RNA in wastewater and air samples to be used for wastewater-based epidemiology studies and to assess the exposure risk to SARS-CoV-2 in indoor and outdoor aerosols. This protocol also describes a tiled amplicon long-template sequencing approach for SARS-CoV-2 whole genome characterization.

Quantificação e caracterização do genoma completo do RNA do SARS-CoV-2 em amostras de águas residuais e ar

Wastewater-based epidemiology has emerged as a promising and efficacious surveillance system for SARS-CoV-2 and other infectious diseases in many nations. ...

Ambiente

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

Combinando a análise de DNA em uma extração do Virion bruto com a análise do RNA das folhas infectadas para descobrir novos vírus de genomas

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries implemented strategies based on direct human testing, face covering, and surface disinfection. Under the assumption that the main route of transmission includes aerosols and respiratory droplets, efforts to detect SARS-CoV-2 in fomites have focused on locations suspected of high prevalence (e.g., hospital wards, cruise ships, and mass transportation systems). To investigate the presence of SARS-CoV-2 on surfaces in the urban environment that are rarely cleaned and&#160;seldomly disinfected, 350 citizens were enlisted from the greater San Diego County. In total, these citizen scientists collected 4,080 samples. An online platform was developed to monitor sampling kit delivery and pickup, as well as to collect sample data. The sampling kits were mostly built from supplies available in pandemic-stressed stores. Samples were processed using reagents that were easy to access despite the recurrent supply shortage. The methods used were highly sensitive and resistant to inhibitors that are commonly present in environmental samples. The proposed experimental design and processing methods were successful at engaging numerous citizen scientists who effectively gathered samples from diverse surface areas. The workflow and methods described here are relevant to survey the urban environment for other viruses, which are of public health concern and pose a threat for&#160;future pandemics.

A citizen science project was designed to recruit San Diego residents to collect environmental samples for SARS-CoV-2. A multilingual web-based platform was created for data submission using a user-friendly mobile device interface. A laboratory information management system facilitated the collection of thousands of geographically diverse samples with real-time outcome tracking.

Limpando o Ambiente Urbano - Um Pipeline para Amostragem e Detecção de SARS-CoV-2 de Reservatórios Ambientais

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Biologia

Uma abordagem genômica baseada em nanoporos para controlar a raiva em países de baixa renda

Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic surveillance remains limited in many low- and middle-income countries (LMICs), where dog-mediated rabies and/or rabies transmitted by wildlife such as vampire bats pose major public health and economic concerns. We present here a rapid and affordable sample-to-sequence-to-interpretation workflow using nanopore technology. Protocols for sample collection and the diagnosis of rabies are briefly described, followed by details of the optimized whole genome sequencing workflow, including primer design and optimization for multiplex polymerase chain reaction (PCR), a modified, low-cost sequencing library preparation, sequencing with live and offline base calling, genetic lineage designation, and phylogenetic analysis. Implementation of the workflow is demonstrated, and critical steps are highlighted for local deployment, such as pipeline validation, primer optimization, inclusion of negative controls, and the use of publicly available data and genomic tools (GLUE, MADDOG) for classification and placement within regional and global phylogenies. The turnaround time for the workflow is 2-3 days, and the cost ranges from $25 per sample for a 96 sample run to $80 per sample for a 12 sample run. We conclude that setting up rabies virus genomic surveillance in LMICs is feasible and can support progress toward the global goal of zero dog-mediated human rabies deaths by 2030, as well as enhanced monitoring of wildlife rabies spread. Moreover, the platform can be adapted for other pathogens, helping to build a versatile genomic capacity that contributes to epidemic and pandemic preparedness.

Autor em destaque: um fluxo de trabalho genômico econômico para o avanço do controle da raiva em ambientes com recursos limitados 

Here, we present a rapid and cost-effective workflow for characterizing rabies virus (RABV) genomes using nanopore technology. The workflow is intended to support genomics-informed surveillance at a local level, providing information on circulating RABV lineages and their placement within regional phylogenies to guide rabies control measures.

Sequenciamento do Genoma Completo para Caracterização Rápida do Vírus Rábico Utilizando Tecnologia de Nanoporos

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic ...