Burada açıklanan solunum patojen deneyleri üzerinde çalışma Cornell Hayvan Sağlığı Tanı Merkezi iç gelişim fonları tarafından desteklenmiştir. nano PCR iş akışı ve ilgili kalite güvence sistemlerinin geliştirilmesi kısmen (FOA PA-13-244) tarafından finanse edilen ve hibe sayılı 1U18FD005144- altında Gıda ve İlaç İdaresi Veteriner Laboratuar Araştırma ve Müdahale Ağı (FDA Vet-LIRN) ile işbirliği içinde gerçekleştirildi 01. yayın ücretleri VWR ve Quanta Biosciences tarafından desteklenmiştir. Biz yazma ve protokol gözden onların yardım için Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Weihua Wang ve Katrina Walker teşekkür ederiz. Biz yazar röportajlar filme Mike Carroll teşekkür ederiz. Sonunda onların yararlı açıklamalar editörü ve üç anonim hakemleri teşekkür ederim.

Hiçbir insan denekler veya deney hayvanları bu protokolün geliştirilmesi için kullanıldı. Kontroller dizisi doğrulanmış amplikonların saflaştırma ve RNA hedefleri için in vitro transkripsiyonu ile üretildi. Klinik örnekler Cornell Hayvan Sağlığı Tanı Merkezi&#39;ne rutin tanısal testler için sunuldu. 1. Plaka Tasarımı <ol><li> her tahlil primer prob testi aracını kullanarak 60 ° C tavlama standart prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR çevrim koşullarına uygunluğunu doğrulamak için astar tasarım yazılımını kullanın (varsayılan parametreleri ile ayarını miktar prob seçin). NOT:. Kullanılan temsili RNA hedef evrensel grip Shu ve arkadaşları tarafından yayınlanan bir matris hedeflenen tahlil 7 uyarlanmıştır. aşağıdaki gibi primerler ve prob vardır: İleri primer: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, Probe: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, Primer Ters. Burada kullanılan temsili DNA testi fro uyarlanmıştırElia ve arkadaşları tarafından yayımlanan, at herpes virüs tip 1 (EHV-1) tespit metodu m. 8. aşağıdaki gibi primerler ve prob vardır: İleri primer: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, Probe: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, Primer Ters FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY. </li><li> İstenilen yapılandırmada nano PCR plakaları sipariş edin. NOT: Bu çalışma için, 18x3 gen ekspresyon biçimi kullanılmıştır (Tablo 1). üreticiye her hedef için tüm primer ve prob (veya envanteri tahlil kimlikleri) için sekansları sağlamaktadır. </li></ol> 2. Nükleik Asit Ekstraksiyon <ol><li> arzu edilen herhangi bir yöntem ile, toplam nükleik asit (DNA ve RNA) ekstrakte edin. Not: Otomatik bir manyetik boncuk esaslı çıkarma Kiti, üreticinin talimatlarına göre burada kullanılan (daha fazla ayrıntı için malzeme tabloya bakınız). </li><li> Örnekler şu şekilde hazırlayın: <ol><li> iyice% 10 çamaşır suyu ve kuru her numune kabının dışını temizleyin. eldivenli f Wipeçapraz bulaşmayı önlemek için örnekler arasında% 10 çamaşır suyu ile inger ipuçları. </li><li> Talep nazal veya tuz birkaç damla (örneğin kırmızı En kan toplama tüpü) herhangi bir steril, sızdırmaz bir şişede derin yutak çubuklar işleme öncesinde kuruma önlemek için ilave edildi. NOT: Pamuk, plastik, tahta saplı ve Dacron ve diğer sentetik bezlerden tüm kabul edilebilir, ancak kalsiyum aljinat bezlerden kaçının. </li><li> sıvının en azından 1-2 ml olacak şekilde çubuklar ve trakeal yıkama için, Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) ilave edin. tüp içinde kuvvetlice bez ve DMEM karıştırın. Daha sonra, yeni bir tüpe ortamın yaklaşık 1 ml aktarmak için bir pipet kullanın. </li><li> 825 x g&#39;de 3 dakika boyunca santrifüj ile ve ardından üreticinin talimatlarına göre, bir doku Topu ile mekanik olarak lize dokular (DMEM 1 ml 100-200 mg) eklenmiştir. yeni bir tüpe süpernatan 500 ul aktarın. </li><li> dışkı için, 1 x fosfat tamponlu sa 800 ul dışkı 400 mg kombinehattı pH 7.4 (PBS). Numune homojenize veya tamamen askıya kadar 1 dakika veya daha uzun süreyle askıya karıştırın. Bir kez homojenize edilmiş, daha sonra yeni bir tüpe 400 ul transfer 18.000 x g&#39;de 10 dakika süre ile süspansiyon santrifüj. </li><li> Bütün uncoagulated kan, örnek vorteks ve 250 ul tablet yapmak. karıştırmak için parçalayıcı reaktifle ve vorteks altı damla ekleyin. 37 ° C&#39;de 15 dakika kuluçkalayın. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak parçalama ve yıkama tamponları hazırlayın. MS2 faj veya bir iç pozitif çıkarma kontrol 9 olarak liziz tamponu için tercih edilen bir iç kontrol ekleyin. </li><li> her bir tane boruya lizis tamponu 235 ul (negatif kontrol ya da PBS) örnek 175 ul ekle. üreticinin protokol ile devam edin. Not: Arıtılmış tüm nükleik asit 90 ul burada elüt edilmiştir. </li></ol> 3. Ters transkripsiyon / ön amplifikasyon (pre-amp) NOT: kullanılan tüm reaktifler ve örnekleri tutunher zaman buz üzerine preamplifikatör reaksiyonu. preamp sonra, oda sıcaklığında, tüm reaktifler tutun. <ol><li> elüt DNA ve / veya RNA, PCR reaksiyon karışımı, nükleaz içermeyen su bir negatif kontrol olarak ve pozitif amplifikasyon kontrolü için bir araya getirilmiş standart bir araya getirin. NOT: 48 numuneye kadar kontrolleri de dahil olmak üzere bir amplifikasyon plaka üzerinde çalıştırılabilir (numuneler çekilecek olan her çıkarma plaka için en az bir negatif çıkarma kontrolü içerir). </li><li> Bir örnek haritası çıktı. harita ve örnek düzeni maç olduğunu ikinci bir kişi kontrol var. </li><li> 1.5 ml tüp içinde, preamp ana karışımı hazırlamak için aşağıdaki ekleyin. Not: 14 ul&#39;lik bir nihai hacim burada kullanılmıştır. <ol><li> her bir hedeften önceden karıştırılmış bir primer havuzu ekleme şekilde, her primerin son konsantrasyonu 900 nM&#39;dir. Not: Burada kullanılan havuz 10x konsantrasyonda hazırlanmış ve 1.4 ul reaksiyon başına ilave edildi. </li><li> 600 nM ya da 0.1x nihai konsantrasyona kadar rastgele primerler ekleyin. </li&gt; <li> Nihai hacminin yarısına (7 ul Burada) 2x RT-qPCR karışımı ekleyin. </li><li> hafifçe karıştırın ve aşağı iplik birlikte master miks bileşenleri karıştırın. </li></ol></li><li> levhanın yalnızca (sütunlar 1-6) sol tarafını kullanılarak standart bir 96-çukurlu plaka içinde preamp gerçekleştirin. </li><li> preamp ana karışımı 8.5 ul ve her DNA / RNA örnek 5.5 ul iyi ekleyin. </li><li> Tüm reaktifler (örnekleri, pozitif kontrol ve Ön amfi karışımı ile negatif kontroller) birleştirilmesinden sonra, iyice açık bir yapışkan contası ile standart 96 oyuklu plaka mühür. bisiklete binme sırasında mühür boşlukları oluşmasını önlemek için bir jilet kullanarak herhangi bir aşırı contasını çıkartın. PCR plaka eğiren kullanarak 20 saniye boyunca mühürlü plaka santrifüjleyin. tüm reaktifler plaka kuyuların dibine kombine emin olmak için kontrol edin. </li><li> aşağıdaki koşullar altında bilinen bir ısıl ilgili ön amplifikatör deneyi çalıştırın: 50 ° C&#39;de 15 dakika; 95 ° C&#39;de 1 dakika; 95 ° C, 2 dakika 60 ° C&#39;de 15 saniye 20 döngü; 99.9 &amp; #176; 10 dakika boyunca ° C; 4 ° C&#39;de tutun. Program başlamadan önce, bu koşullar. </li><li> Geleneksel PCR açmak preamp bisiklet programı seçin ve programı başlatın. PCR (değil kapak) alt kısmı ekranda okuma sıcaklığının kontrolü ile cDNA üretimi (50 ° C) için gerekli sıcaklığa ulaştığında sadece PCR 96-plaka koyun. Bundan önce, yalancı pozitif sonuç üretme riskini en aza indirmek için plaka soğuk tutmak. </li><li> preamp çalışma tamamlandıktan sonra, plaka mühürlü kaldı doğrulayın. </li><li> 4.1 adıma hemen geçin. Gece boyunca, bu plaka depolamak yerine gevşek plaka kaplama hariç adım 4.2 ila 4.5 de tarif edildiği gibi seyreltme gerçekleştirmek için, 4 ° C&#39;de depolanan bir fermuar kilidi torba içinde berrak bir yapışkan contası ve yeri, plaka kapatın. </li></ol> Preamp Plate 4. seyreltilmesi <ol><li> fro amplifikasyon plakaların uygun sayıda kaldırdondurucu (4&#39;e kadar tek seferde çalıştırmak olabilir) m. ambalaj açmayın. Plaka, oda sıcaklığında en az 15 dakika ısıtın. plaka seri numarası ve lot numarasını kaydedin. NOT: Açılmamış plakaları 24 saat kadar oda sıcaklığında kalması, ancak en iyi uygulama, önce gerekli fazla 30 dakika daha dondurucudan bu kaldırabilirsiniz. </li><li> PCR plaka eğiren kullanarak 20 sn tamamlanan preamp plaka santrifüj. amplifikasyon makine ve bilgisayarı açın ve ilişkili programı başlatın. </li><li> Bir PCR kurulum alanından tüm gereksiz öğeleri kaldırın. çift ​​eldiven ve kol kapakları koyun. </li><li> preamp plakasından mühür çıkarın ve dikkatlice çıkarın ve dış eldiven atın. Yukarı ve aşağı pipetleme sütun 96 oyuklu preamplifikatör plaka 1-6 ve karıştırma her bir kuyu için TE tamponu 56 ul ekleyerek 5: 1 ile ön-amplifikatör ürünleri seyreltilir. alttan aspire ve daha yukarı dağıtım fakat yaratmak değil, sadece pipet ilk durağı gitkabarcıklar. Kullanılmayan kuyuların ne olursa olsun 6 sütun TE tamponu ekleyin. </li><li> net bir yapıştırıcı veya folyo mühür ya plaka Reseal ve PCR plaka eğiren kullanarak 20 sn için santrifüj. kenara bu plakayı ayarlayın (gevşek kapalı) adım 6.1 tamamlanana kadar. Kalan eldiven ve kol kapakları atın. </li></ol> Amplifikasyon Plate 384-kuyu Transferi 5. Hazırlık <ol><li> kapak, fiş, daldırma sıvısı, plaka basın, etanol fışkırtma şişe ve havsız laboratuvar mendil şırınga: amplifikasyon plakasını kapsayacak ve mühür gerekli malzemeleri ayarlayın. (Kuvvet gerektirir) şırınga kapağını çıkarın ve şırınga üzerine küçük bir plastik ucu kilitleyin. Hava birikintisini temizlemek için kağıt havlu üzerine daldırma sıvısı küçük bir miktar çıkarın (bazı küçük hava kabarcıkları ucunda kalır eğer ok). Vakum mühürlü alüminyum torbasından şırınga çıkarmadan 60 dakika içinde daldırma sıvısı kullanın. bir şırınga açıldığında, daha sonra kullanılmak üzere bir başlık takın değildir. </li><li> Kontrolplaka yükleme sıvı işleyici atık depo boş ve ipuçları kutusunu açmak söyledi. Yeni bir kutu açıldığında uç kutusu kapağının ipuçları son kullanma tarihini yazın ve ipuçları dolmamış olduğundan emin olun. Sıvı işleyici ve bilgisayarı açın ve kendi kendine test gerçekleştirecektir sıvı işleyici yazılımı açın. </li><li> &quot;Kurulum ve Yükleme&quot; tıklayın. Örnek Tracker yazılımı oluşturulan CSV dosyasını seçmek için &quot;Browse&quot; düğmesine tıklayın. Dosya görünmüyorsa, &quot;Enstrüman / Düzenleme Tercihler&quot; gidin ve ardından &quot;Örnek Plaka Dosya Klasör&quot; tarafından &quot;Değiştir&quot; e tıklayın. csv dosyası kaydedilir klasörü seçin. Sonra, sonra &quot;Browse&quot; ve dosyayı seçin, &quot;Kurulum ve Yükleme&quot; seçeneğini tıklatın. </li><li> Sonraki sonraki &quot;Plaka Tutucu Pozisyonu 1&quot; &quot;Gözat&quot; ı tıklayın ve plaka ile aynı seri numarası vardır (üretici tarafından sağlanan) TPF dosyasını seçin. </li></ol> 6. Sıvı Tutucu Transferi Not: fi başlatmak etmeyinYukarıdaki tüm adımları tamamlanıncaya kadar 384-plaka lling. Buharlaşma küçük hacimli bir husustur - 384-plaka içindeki sıvı ile ortaya oturup izin vermeyin. <ol><li> Bir kez tüm yukarıdaki adımların yeni, iyi donatılmış çift eldiven koymak tamamlanmış ve kol kapsar. Daha sonra, 384 oyuklu plaka amplifikasyon ana karışımı 2.5 ul ekle. </li><li> Tablo 2&#39;de haritaya göre 384 plaka seyreltilmiş pre-amp ürünün 2.5 ul transferi ve hemen folyo conta ile sıkıca plaka kapsamaktadır. Dış eldiven ve kol kapakları atın. </li><li> Santrifüj PCR plaka spinner 20 saniye boyunca 384-plaka. </li><li> folyo mühür kaldırmak, ancak sıvı işleyici 384-plaka koymayın. </li><li> Bir kaplı amplifikasyon plakasını içeren paketi açın ve sağdaki seri numarası ile ilk yuvaya sıvı işleyici dikkatlice yerleştirin - yüzey o dokunmadan kenarlarından tutun davayıplaka f. açıklığın bir saat içinde kullanıcıya plakalar kullanılmıştır. Not: Davanın amacı dokundu olmaktan plaka korumak, bu geçiş delikleri içinde astar ve prob küçük miktarlarda rahatsız olabilir çünkü. </li><li> Her şey yerinde olduğunu bir kez sıvı işleyicisi içinde 384-plaka folyo mühür çıkarın. İleri&#39;yi tıklatın ve sonra her adım tamamlandığında tüm onay kutularını. koşmak başlatmak için Tamam&#39;a tıklayın. </li><li> Sıvı işleyici kapağını kapatın ve hemen doldurma işlemini başlatın. Sıvı işleyicisi yanında kalmak ve plaka doldurulur kez hemen bir sonraki adıma geçin. </li><li> Sıvı işleyici çalışırken, bir vaka kapağın altından koruyucu filmi çıkarın. NOT: Olgu kapağının altındaki yapışkan bir bürokrasi ve koruyucu film ile kaplıdır. Film bürokrasiyi erişmek için ilk kaldırılması gerekiyor. <ol><li> Adım 6.15 kadar yerinde üst filmi bırakın. Releas hafifçe çekerek Başbakan bürokrasiyapışkan o e. </li></ol></li><li> Sıvı işleyici yüklenen (dolu) amplifikasyon plakasını çıkarın ve yavaşça sağda seri numarası ile plaka basın yerleştirin. </li><li> (Plaka bakacak) alt sağ ve yapıştırıcı üzerinde girintili ucu ile plaka üzerine kapağını yerleştirin. </li><li> dikkatlice kapatarak plaka pres kolu aşağı çekin; Işık 20 saniye boyunca yanıp söner. Bu süre içinde plaka basın dokunmayın. Işık yeşil renkte sürekli yanar sonra, dikkatlice kolu yukarı kaldırın ve dikkatlice kenarlarda tutarak mühürlü plaka kaldırmak. </li><li> Davanın kenarlarından dikey mühürlü amplifikasyon plakasını tutarken, hemen davanın sonunda yükleme ağzının içine şırınga ucu yerleştirin, daha sonra plaka arasındaki boşluğu doldurmak için bir yumuşak sürekli hareket halinde yavaş yavaş daldırma sıvısı dağıtmak kapak. Plaka batırılır sonra köşede küçük bir hava kabarcığı bırakın. </li><li> h devam ederkenEski plaka dikey kenarlarından, sap kopana kadar yeterli basınç uygulayarak, limana fişini takmadan ve fiş saat yönünde çevirerek yükleme noktasını kapatın. Kavrama durumunda kenarları sıkıca sap kırma gücü durumda bırakmasına neden kalmaması. Bir tabak düştü ise, onu atın. </li><li> Tüy bırakmayan bir o silme iyice etanol ile püskürtülür olmuştur ile davayı temizleyin. davayı kurutmak için, silin temiz ile aşağı doğru silin. Yavaşça davayı ele; kuyular üzerinde camına baskı uygulamak değil emin olun. </li><li> Amplifikasyon makinesine sızdırmaz plaka getirin. &quot;Enstrüman&quot; sekmesi altında, &quot;Enstrüman Konsolu&quot; i seçin. sonra amplifikasyon makineyi seçin &quot;Açık Kapı&quot; butonuna tıklayın. </li><li> adaptörü doğru sol üst köşede A1 ile dizilmiş olduğunu kontrol plaka adaptörünün ilk yuvaya amplifikasyon plaka koyun. Barkodlu plaka yukarı bakacak ve doğru yönlendirmekCihazın ön. &quot;Kapağını kapatın&quot; düğmesine tıklayın. Adaptör tepsisinin kullanımına dikkat edin - 10 kullanımların bir sınırı vardır. </li><li> Ekranın alt kısmındaki Ana Sayfa sekmesinde Çalıştır menüsü altında, OpenArray seçin. &quot;Plaka kimlikleri alın.&quot; Tıklayın Boş kutular otomatik plaka hakkında bilgi ile doldurulur. çalıştırmak başlamak için, &quot;Başlat Çalıştır&quot; a tıklayın. </li><li> Sıvı işleyici yazılımını kapatın ve sıvı tutucu kapatın. ucu raf üzerinde uç kapağı yerleştirin. çöp kutusu ipuçlarını atın ve temizleyin. Temiz ve çalışma yüzeyi, pipet, atık kovası ve ipuçları kutuları da dahil olmak üzere tüm öğeleri dekontamine. </li><li> -20 ° C&#39;de berrak yapışkan mühür ve mağaza ile preamp plakasını kapatın. </li></ol> 7. Sonuç Analizi <ol><li> çalışma tamamlandıktan sonra, dosyayı kaydedin ve sonra dosyayı kapatmak için ekranın altındaki çalışma adıyla sekmesinde &quot;X&quot; üzerine tıklayın. </li><li> &quot;The Open Door tıklayın&quot;Kapıyı açmak için ekranın üst kısmındaki. Hiçbir daldırma sıvısı dışarı sızdırılmış olduğunu kontrol amplifikasyon plakasını sökün. Tıklayın&quot; kapıyı kapatmak için ekranın üst kısmındaki Kapat Door &quot;. </li><li> &quot;Aç&quot; ı tıklayın ve açmak için çalışma dosyasını seçin. Yeşil ekranın sağ üst kısmındaki düğmesine Analiz basın. (.txt Dosyası olarak) sonuçları ihracat daha sonra ekranın sol tarafında ve &quot;Başlat İhracat&quot; konulu &quot;Export&quot; düğmesine tıklayın. o açıldıktan sonra dosyayı en aza indirin. Ardından, &quot;İhracat QC Images&quot; i tıklayın. </li><li> Aşağıdaki kriterlere göre görüntü analiz programı QC görüntüleri gözden: <ol><li> Hiçbir karanlık noktalar veya lekeler olduğunu kontrol ederek, ÖNCESİ READ_CHANNEL_4.tiff ve POST-READ_CHANNEL_4.tiff kullanarak yükleme kalitesini değerlendirmek. NOT: Bu kanal tarafından algılanan bir boya Reaksiyon yüklendiğinde çözelti içine serbest primerler ve problar için imalatçı tarafından ilave edilir. Bu kanal okuma reaksiyonları doğru olduğunu göstermektedirYüklenen ve boya ile karışık primerler ve prob mevcut olduğunu. </li><li> S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff kullanarak yükleme sonrasında plaka sızıntı veya ajitasyon kontrol edin. görüntü karanlık görünüyorsa, parlaklık (Ctrl + Shift + kontrolleri açmak için C) tüm plaka görülene kadar artar. Görüntü yok gölgeler, kabarcıklar, ya da yerinden numuneler ile formasını görünüyor olmadığını kontrol edin. </li><li> STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff ve STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff kullanarak kapak (parlak noktalar) altında kapak yerleştirme ve enkaz değerlendirin. </li></ol></li><li> İsteğe bağlı: Sonuçlar makro (Company kod dosyası) içeren bir tabloyu açın. Dışa aktarılan veri dosyasında, ekranın sağ alt kısmında sekmesine tıklayın ve &quot;Taşı veya Kopyala&quot; yı seçin. &quot;Kitaba&quot; alanında, &quot;Macro.xlsm Sonuçları&quot; seçeneğini seçin. Tıklayın ve kutu &quot;kopyasını oluşturun&quot; kontrol &quot;sonuna kadar taşı&quot;. Ardından, Tamam&#39;ı tıklayın. <ol><li> Sonuçlar Makro seçeneği &quot;kitap&quot; alanında görünmüyorsa, simkat Dışa aktarılan veri dosyasının çalışma sayfasının içeriğini kopyalamak (tüm hücreleri vurgulamak için sol üst hücreye tıklayın ve Ctrl-C) ve yeni bir sekmede yapıştırın. </li></ol></li><li> Eski &quot;İhracat&quot; sekmesine silin ve ardından &quot;Export&quot; olarak yeni eklenen sekme yeniden adlandırın. </li><li> &quot;Alt-F8&quot; Click (veya makrolar Görünüm tıklayın) sonra &quot;Makro&quot; seçin ve &quot;Çalıştır&quot; a tıklayın. Ardından &quot;Alt-F8&quot; sonra &quot;Macro2&quot; seçerek ve &quot;Çalıştır&quot; tıklayarak tıklayarak Macro2 için bu tekrarlayın. </li><li> ilgili bilgileri (tarih ve seri numarası) kullanarak Sonuçları Makro dosyasını yeniden adlandırın, tablonun üzerindeki bu bilgileri koymak ve İhraç Sonuçları klasörüne aynı dosya adıyla kaydedin. Son olarak, makro oluşturulan sonuçlar tablo çıktı. </li><li> amplifikasyon makine yazılımında, ekranın sol tarafındaki Analizi / Büyütme Plot seçerek makro tabloya karşı her numune ve kontrol için eğrileri kontrol edin. Sonra, Örnek sekmesini seçin ve her bir numune üzerine tıklayınTabloda olumlu sonuçlar her biri için 2 veya 3 pozitif amplifikasyon eğrileri vardır emin olun. </li><li> amplifikasyon Makineyi kapatın. </li></ol>

<ol>
	<li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection.">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li><li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR.">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), e123 (2006).</li><li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+(RT-PCR):+trends+and+problems.">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).</li><li>McCall, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmark+for+microRNA+quantification+algorithms+using+the+OpenArray+platform.">A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform.</a> BMC bioinformatics. 17 (1), 138 (2016).</li><li>Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+traceability+of+cattle+using+an+OpenArray+genotyping+platform.">Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform.</a> Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).</li><li>Grigorenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+screening+for+blood-borne+viral,+bacterial,+and+protozoan+parasites+using+an+OpenArray+platform.">Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform.</a> J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).</li><li>Shu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).</li><li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+equine+herpesvirus+type+1+by+real+time+PCR.">Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR.</a> J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).</li><li>Dreier, J., St&#246;rmer, M., Kleesiek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bacteriophage+MS2+as+an+Internal+Control+in+Viral+Reverse+Transcription-PCR+Assays.">Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays.</a> J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).</li><li>Pusterla, N., Hussey, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equine+Herpesvirus+1+Myeloencephalopathy.">Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).</li><li>Firth, C., Lipkin, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomics+of+emerging+pathogens.">The genomics of emerging pathogens.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).</li><li>Lecuit, M., Eloit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+whole+genome+NGS+for+infectious+disease+diagnosis.">The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).</li><li>Dunne, G., Gurfield, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Veterinary+Diagnostic+Laboratory,+a+Model+for+the+One+Health+Initiative.">Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative.</a> Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).</li><li>Moutailler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+of+Ticks:+The+Rule+Rather+Than+the+Exception.">Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception.</a> PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539 (2016).</li></ol>

Marcia Slater ve Elen Ortenberg bu yazıda kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Thermo Fisher Scientific Inc. çalışanlarıdır.

Bu prosedür, altı aylık (hafta 2-3 kez) boyunca laboratuarda solunum patojenlerinin rutin test için kullanılmıştır. Biz de bir ayrı özelleştirilmiş plaka üzerinde dışkı örnekleri ve bakteriyel izolatların enterik patojen profil için aynı prosedürü kullanarak başarıya sahiptir. Plakalar elde edildikten sonra, deneyimli kadrosu bir standart iş günü içinde 2-7 adımları tamamlayın. en kritik adımlar preamp plakasının uygun sızdırmazlık, (buharlaşmayı önlemek için hızla yapılmalıdır) plakalar arasında preamplified örneklerin transferi ve amplifikasyon plakasının son kaplama vardır. büyük ölçüde bu işlem için gereken süre ve evrak miktarı azalır olarak sonuç analizi (numune ve kontroller için eğrileri kontrol) için bir rehber olarak makro-tablonun kullanımı da eleştirdi. sağlanan makro tablo bir örnektir; farklı konfigürasyonları ile plakaları için değiştirilmiş veya yeniden oluşturulmuş olması gerekir. Bu kolayca pe olabilirtemel tablo bilgisi olan birisi tarafından rformed. Nedeniyle amplifikasyon plakasına (33 nl) üzerine yüklendi numunenin çok küçük bir miktarı ile, ön amplifikasyon gerekir. Bu protokol (gösterilmemiştir) optimizasyonunda, önceden amplifikasyon ana karışımı, rastgele primerler ilavesi döngüsü sayısı, tavlama süresi ve seyreltme içeren amplifikasyon bir dizi parametre karşılaştırıldı. Her hedef, kendi optimal koşulları vardı ve burada tarif edilen bizim panelin algılama genel klasmanda en iyi sınırını vermiştir o temsil etmektedir. Bu panel patojenik hedefler ve rutin veteriner teşhis testleri karşılaşılan örnek türleri geniş bir yelpazesini kapsayan, ancak amplifikasyon prosedürlerine değişiklikler farklı panelleri için gerekli olabilir. Üretici optimize edilmiş amplifikasyon koşulları 95 ° C ve ann denatürasyon, ardından 95 ° C enzim aktivasyonu bir 10 dakika ile standart prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR protokolü dayanmaktadır60 ° C&#39;de Ealing / uzatma. primerleri ve sondaları önceden basılmış aynı zamanda üretici optimize koşulları kullanarak ve bu nedenle titrasyonu gerekmez plakalar üzerinde bulunmaktadır. (Ne olursa olsun hedef Çeşidi) tüm örnekler için ters transkripsiyon ve ön amplifikasyon adımlarını birleştirerek iş akışı verimliliğini sağlamak için gerekliydi. Tüm örnekler, ters transkribe olması da duyarlılığı maksimize etmek için faydalıdır. Ayrıca, en aza indirilmesi inhibitörleri için optimize edilmiştir preamp için bir ana karışımı kullanılması, aynı plaka üzerinde farklı numune türleri birleştirerek çok yönlülük sağlar. Hastalık Kontrol Merkezi (CDC) nanolitre ölçekli reaksiyonlar için Shu ve diğ. 7 tarafından tarif uyarlanmış grip matris deneyi için Merkezi evrensel influenza insanlar ve eşlik eden hayvanlar test örnekleri için uygun olan bir deneydir. Bu mikrolitre ölçekli rea kullanarak tüm influenza A virüsleri matris geninin evrensel tespiti için dizayn edilmiştirseksiyonlar. Bir CDC İnsan Gribi Virüsü Paneli ve CDC Domuz Gribi Panel parçası olarak tüm dünyada kullanılmaktadır. Burada uyarlanmış EHV- 1 tahlil 8 kürtaj ve nörolojik hastalığı (Pusterla ve Hussey 10 tarafından gözden) neden olabilir atların önemli bir solunum patojeni algılar. Bir türün bağımsız iç kontrol ile yüksek verimli bir platforma, bu testler adapte önemi bir OneHealth gözetim yaklaşım dahil edilebilmesidir. yüksek verimli bir test platformu bu tahlillerin her ikisine birden sahip klinik tesisleri, barınaklar ve performans etkinlikleri için acil durum hazırlık kolaylaştıracaktır. Yukarıda tarif edilen sonuçlar, analitik performansı önemli ölçüde daha fazla varyasyon gösterdi Mycoplasma cynos hariç, plaka üzerinde, tüm hedeflerin temsil etmektedir. Bu durum, ideal bir 58-60 ve olmalıdır primerlerin optimal erime sıcaklığına (Tm), muhtemel olduğunu# 176; C (ideal bir prob Tm 68-70 ° C). Bu platformun bir sınırlama hızla dizileri değiştirme yeteneği sınırlar bireysel sondalar, sipariş için daha plakaları tasarımı ve üretimi için daha uzun sürer olmasıdır. Genel olarak real-time PCR başka sınırlama roman veya beklenmeyen patojenleri algılamak için yetersizliğidir. Bu, birden fazla türde sekansları ile örtüşmek tahlilleri tasarlayarak bir ölçüde üstesinden, ancak tarafsız tüm genom sekanslama göre yöntemler, yeni maddelerin keşfedilmesi için daha uygundur. 11,12 Nano ölçekli real-time PCR için yeni bir paradigma izin veren sendromu tabanlı yüksek verimli moleküler tanı reaktif ve işçilik maliyetlerini azaltmak için yararlıdır türler tabanlı test, yerine. Bu yaklaşım büyük ölçekli panel test örneğin Dunne ve Gurfield 13 ve Moutailler ve ark., 14 tarafından tarif edilenler gibi OneHealth kontrol çabalarını kolaylaştırabilir. Erken sürüntü örneklerinin toplanması,genellikle klinik başlangıcından 3 gün içinde, solunum patojenlerin varlığı tanımlamak için en iyi şansı sağlar. Bulaşıcı hastalığın ortaya çıkması, genellikle öngörülemeyen ve reaktifler modifikasyonu için gerek kalmadan farklı türleri üzerinde yapılabilir testler hazırlık için idealdir. Bu teknolojinin gelecekte uygulamaları patotiplendirme, antimikrobiyal direnç profilleme ve ayrıca sendrom dayalı klinik tanı panellerde olması muhtemeldir. Nano ölçekli real-time PCR çoklu örnek ve patojen türleri hızlı, yüksek verimli tarama için en yararlı olan, yeni ve acil patojenleri belirlemek için tarafsız veya kısmen önyargılı sıralama temelli yaklaşımlar ile tamamlanmaktadır olacaktır.

Tek bir hastalık için test edilen örneklerin büyük sayılar için kullanılan sürece insanlar ve hayvanlar için klinik teşhis birden ajanların hızlı ve kapsamlı tespiti için talebin, patojen tespiti için tek organizma moleküler tanı yöntemleri külfetli bulunmaktadır. Veteriner bağlamda, yüksek verimli teşhis yöntemleri nedeniyle türlerin çeşitli patojenleri kapsayan ek ihtiyaca özellikle önemlidir. bakteri sayısını içerir test ihtiyaçları örnekleridir OneHealth gıda kaynaklı hastalığın tedavisi ve ortaya çıkan bir patojen gözetim yaklaşımlar, virüsler (DNA ya da RNA bazlı), parazit ve mantar. test verimliliğini artırmak amacıyla birlikte birden fazla analitlerin (çoğullama) testleri birleştirerek meydan duyarlılık olası bir kayıp ve optimizasyon ve tahliller onaylanması için büyük bir yüktür. Nanoliter ölçekli gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir alter olduğunubirçok ayrı reaksiyonlar aynı örnek 1 üzerinde aynı anda çalışmasına olanak sağlayan çoğullama uygulamasına yerli. OpenArray platformu bu ilkenin 2 bir uygulamadır; gerçek zamanlı PCR ile mikroarray teknolojisini birleştiriyor. mekansal çoğullama kavramına göre, her örnekten geçiş delikleri farklı hedeflerin çok sayıda test edilir. Bu platform, başlangıçta cyanine tabanlı çift sarmallı DNA bağlayıcı kimya 2 ile kullanılabilir ve karanlık söndürme sondalar 3 kullanılarak prob tabanlı kimya için kullanılabilir oldu. Bu platform, esas olarak, insanlarda ve hayvanlarda 4 5 genetik profil oluşturma için kullanılmıştır. Bu en son Grigorenko ve diğerleri tarafından kan yoluyla DNA ve RNA patojenleri tespit etmek için adapte edilmiştir. Şekil 6, iki aşamalı bir ters transkripsiyon / ön amplifikasyon (pre-amp) prosedürü kullanılarak. Bu, solunum sn patojen her iki tip tespit için tek aşamalı bir preamplifikatör tabanlı bir prosedür tarifretions ve standart bir iş günü tamamen gerçekleştirilebilir diğer numune türleri çeşitli. tek-aşamalı preamplifikatörün tamamlanmasından sonra, numuneler bu nano PCR platform ile birlikte otomatik bir sıvı taşıma sistemi tarafından kabul biçimi olan bir 384 gözlü plakaya aktarılır. Sistem aynı anda en fazla 4 plakaları (192 numuneleri ve kontrolleri) yüzeyi boyunca ana karışımı ve örnek çizer. Bu yükleme işlemi takiben, numuneler yükseltilir ve basılan tek bir sayfaya sığan bir tablodaki her numune / hedef kombinasyonu için 3 teknik çoğaltır ortalamasını özetleyen bir makro tablo kullanarak nasıl analiz edildiği açıklanmaktadır. Bu platformu kullanarak örneklerinden çıkarılan DNA ve / veya RNA analiz etmek için bir tek tip bir yöntem kurulmuştur. numune çok çeşitli ekstre ters transkribe ve olası hataları en aza indirmek, 96 oyuklu bir formatta önceden amplifiye edilmiştir. Test Solunum örnekleri nazal bezlerden, derin farengeal bezlerden dahil,Trans-trakeal yıkar, bronkoalveoler lavaj ve akciğer dokusu. Ayrıca, periferal kan ya da dışkıların mevcut olabilir test maddelerinin bazıları için, biz prosedürü Alınan numunelerin bu tür dahil. Bu aerodinamik iş akışı bireysel test yerine panel tabanlı patojen ve toksin geni tespiti yoluyla verimli test sağlayarak birden fazla plakalar deneyler çalışan kıyasla zaman ve kaynak tasarrufu sağlar. Burada gösterilen solunum paneli 18 deneyleri her plaka başına 48 numuneye kadar uzlaşmacı,-deliklerden üç nüsha olarak basılan vardı. Tespit at patojenler at adenovirüs 1 ve 2, at arterit virüsü, at rinit virüsü A ve B, at herpes virüsü (EHV) tip 1 ve tip 4 ve Streptococcus equi dahildir. Köpek patojenler köpek solunum koronavirüsünün (betacoronavirus), köpek distemper virüsü, Kanin adenovirüs, Kanin parainfluenza virüsü, köpek Pneumovirus, Bordetella bronchiseptica, ve Mycoplasma cynos dahildir. birEvrensel İnfluenza A tahlil ve iç kontrol (MS2 RNA faj) da dahil edildi.

<table><tbody><tr><td>Zap-OGlobin II lytic reagent</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546138</td><td>Optional reagent for preparing blood samples.</td></tr><tr><td>Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>AM1840</td><td>Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.</td></tr><tr><td>2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95134-500</td><td></td></tr><tr><td>Gene-specific primer pool</td><td>IDT</td><td>custom order</td><td>Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.</td></tr><tr><td>Random primer mix</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>Standard 96-well plate</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td>This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.</td></tr><tr><td>Amplification master mix (OpenArray master mix)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4462164</td><td></td></tr><tr><td>Clear adhesive seal</td><td>Thermo-Fisher</td><td>430611</td><td></td></tr><tr><td>Foil seal</td><td>Excel Scientific</td><td>AF-100</td><td></td></tr><tr><td>384-well plate</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4482221</td><td></td></tr><tr><td>Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4470813</td><td>Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Accessories kit</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4469576</td><td>Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.</td></tr><tr><td>AccuFill tips</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4471090</td><td></td></tr><tr><td>Liquid handler (OpenArray AccuFill System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457243</td><td>This is purchased with the amplification machine.</td></tr><tr><td>Primer design software (Primer Express)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4363991</td><td>See manufacturer&#039;s instructions for detailed primer and probe specifications.</td></tr><tr><td>Image analysis program (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Available at http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Spreadsheet program (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Available at https://products.office.com/en-us/excel</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo-Fisher/Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Tissue disruptor (TissueLyser II)</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Conventional thermal cycler (Veriti)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.</td></tr><tr><td>PCR plate spinner</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Millipore</td><td>8890-100ML</td><td>10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0</td></tr></tbody></table>

high-throughput detection of respiratory pathogens in animal specimens by nanoscale pcr

Nanoliter ölçekli real-time PCR birden deneyleri birbirine tepkileri birleştiren tipik dezavantajları olmadan tek plaka üzerinde paralel çalışmasına izin vermek için mekansal çoğullama kullanır. Biz tasarlanmış ve hızla akut solunum yolu hastalığı olan köpek ve atlarda yaygın bir hastalıktır ajanların varlığını belirlemek için bu ilkeye dayanan bir panel değerlendirdi. Bu yazıda mikrolitre ölçekli reaksiyonlar farklı prosedürler odaklanarak, örnek hazırlama, yükseltme ve hedef patojen dizilerin analizi için bir nano ölçekli teşhissel PCR akışını tarif eder. sunulan solunum panelinde, 18 deneyleri her plaka başına 48 numuneye kapasiteli, üç nüsha olarak kuruldu. Evrensel bir ekstre ve ön amplifikasyon akışı çok matrisler ve DNA ve RNA göre patojenleri karşılamak için yüksek verimli örneği hazırlanması için optimize edilmiştir. Temsilcisi veri bir RNA hedefinin (influenza A matrisi) ve bir DNA hedefe (at herpes virüsü sunulmuştur1). hızlı ve doğru patojen kapsamlı, sendrom tabanlı grup için test etme yeteneği verimlilik ve tanısal testlerin ergonomisini geliştirmek için ve akut solunum hastalığı tanı ve tedavisi için değerli bir araçtır.

Sonuçlar pozitif kontroller rutin tanı testleri için sunulan klinik numuneler bir kombinasyonu ile temsil eden bir RNA deneyi (grip matris) ve DNA deneyi (EHV-1), Şekil 1 ve 2&#39;de gösterilmiştir. Bu tipik reaksiyon boyunca yayılan floresan sinyalleri döngüsü başına ham floresans değerlerini grafik olarak gösteren Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Tüm göreli döngü eşiği (Ct) değerleri otomatik olarak büyütme makine yazılımı tarafından üretildi. Arkaplan floresan Ct değerlerini hesaplamak önce floresan okumaları içine dahil ziyade yükleme kalitesinin değerlendirilmesi için ayrı bir ölçüt olarak kullanılmıştır. Her hedef için tespit analitik sınırı (LOD) hesaplandı kontrollerin bir havuz için Ct% 95 algılama düzeyinde değerler artı 2 standart sapma genel ortalama dayalıTüm hedefler. replika en az% 95 Örnek deneyleri için pozitif en yüksek dilüsyon 50 kopya vardı; 5 kopya algılama çoğaltır% 50 başarılı oldu. Ne tahlil aşağıda bir kopya tespit edildi. RNA ve DNA testi için LODs 21.92 ve 20.05 Ct değerleri hesaplandı. Bu değerler şüpheli vs olarak pozitif (potansiyel olarak değil tekrarlanabilir) raporlama değerleri için sınır değerler olarak kabul edildi. Hedeflerin Analitik performans diğer yönleri, üç farklı günde (Şekil 2) üzerinde çalışan bir araya getirilmiş pozitif kontrol seri dilüsyonları kullanılarak değerlendirildi. temsili RNA ve DNA testlerinin ortalama verimleri 101.1 ve% 106.6,% idi; Tüm hedefler için, ortalama etkinlik 101.3% idi. Deneyleri de iyi doğrusallık (&gt; 0.98 R2) vardı. çoğaltmak içinde Varyasyon geçiş delikleri genellikle hem klinik örnekler için 0.2 standart sapmaları içinde olan bird kontroller. hedefleri arasında hiçbir çapraz reaktivite gözlemlenmedi. ek dosyada Final Sonuçları çalışma 10 klinik tanı örnekleri ve 4 denetimler için temsili nicel sonuçlarını gösterir. Klinik örnekler örneklerin türlerinin bir alt rutin burun / orofaringeal bezlerden, akciğer dokusu ve dışkı örneklerinin de dahil olmak üzere test edilmiştir. Bu sette biri (at) fekal örnek numunede inhibitörlerinin varlığını gösterir başarısız bir MS2 iç kontrol, gösterir. Bu, tipik olarak elüt numune ve / veya yeniden ekstre seyreltilmesiyle yönetilmektedir. Burada olduğu gibi, negatif amplifikasyon kontrolü tüm hedefler için negatif olmalıdır ve negatif çıkarma kontrolü sadece iç kontrol içermelidir. Klinik setinde numuneler betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica&#39;dan, köpek distemper virüsü A, Kanin parainfluenza virüsü, köpek Pneumovirus ve grip için Ct değerleri ürettiA. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> Şekil 1. amplifikasyon çizimini. Fluoresans ölçümleri RNA deneyi (A) ve DNA deneyi (B) amplifikasyon döngüsü karşı çizilmiştir. Üçgenler Ct değerleri gösteren gösterilmiştir edilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> Şekil 2. standart eğriler. Üç farklı günlerde test RNA ve DNA deneyi Standart eğriler pozitif kontroller kullanan amplifikasyon doğrusallık ve ortaya koymak amacıyla çizilmiştir. Döngü eşiği (Ct) değerleri RNA (A) ya da DNA kopya sayısı log (10) (karşı çizilmiştir <strong&gt; B) standart. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> Amplifikasyon plakası ve hedef nokta Tablo 1. şematik. Bu platform üzerinde nano ölçekli gerçek-zamanlı PCR testleri için kullanılan tabaklar mikroskop lamı boyutlu ve delik 3.072 bir toplam, geçiş delikleri 64, 48 altdizilimlerden düzenlenir Belirli tepkimelerde. Bir altdizilim üçlü olarak 18 hedeflerle, burada gösterilir. Her bir numune, sıvı tutucu yolu ile, bir alt dizisinde eklenir. Plakalar yüzey gerilimi vasıtasıyla geçiş delikleri reaktifleri korumak için, hidrofilik ve hidrofobik bileşikler ile kaplanır. Paslanmaz çelik çip &quot;photolithographically desenli ve 3.072 mikro makinede, 320 um Diamete bir doğrusal dizi oluşturmak için ıslak-kazınmış. aşağıdaki gibi r hedefler için 33 nl her &quot;2 Kısaltmalar delikleri vardır: BCOR, köpek solunum coronavirüs (betacoronavirus); Bord, Bordetella bronchiseptica CAV, köpek adenovirüs, CPIV, köpek parainfluenza virüsü, CPNv, köpek Pneumovirus; Dista / B, köpek distemper virüsü A ve B; EADV1 / 2, at adenovirüs 1/2, EAV, at arterit virüsü; EHV1 / 4, at herpes virüs tip 1/4; ERVA / B, at rinit virüsü A / B; IVM, influenza A matris; MCYNOS, Mycoplasma cynos; MS2, iç kontrol (MS2 RNA faj); dizisine, Streptococcus equi. <img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> Tablo 2. Plaka transferi haritası. 384-plaka 96-kuyu preamp plaka aktarmak için sabit 8-kanallı pipet kullanarak bir renk kodlu plaka transfer haritası gösterilir. Alternatif olarak, ayarlanabilir bir pipet kullanılabilir. Aynı prosedür, h bağımsız olarak, her zaman gerçekleştirilmektedir<html> ow birçok örnekleri plaka bulunmaktadır. <img alt="Company Dosya" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> Company dosyası. Özet tabloya biçimlendirme sonuçları için iki makro içeren bir makro etkin tablo dosyası (protokol açıklandığı gibi) sağlanır. makroları tarafından oluşturulan tipik bir sonuç tablosu (Final Sonuçları altında) dosyası yer almaktadır. İki makro örnek adları ilk sütunda (48 örneğe kadar) ve olumlu sonuçlar olanlar için her hedef için üç Ct değerleri ortalama dolduracaktır; yükseltmek vermedi hedefler bu tabloda boş göründüğüne dikkat edin. Bu kolay bir kağıt parçası üzerine basılmış ve verimli bir ham veri kontrol için bir referans olarak kullanılabilir. nihai sonuçlar sekmesinde, 10 klinik örneklerden ve 4 kontroller için temsili sonuçlar gösterilmiştir. Tahlil isimleri için kısaltmalar Tablo 1&#39;de efsanesi listelenmiştir.jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR at JoVE.com

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nano ölçekli PCR ile DNA ve RNA bazlı patojenlerin yüksek verimlilik testi bir sendromik köpek ve at solunum PCR panelini kullanarak tarif edilir.

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

high-throughput-detection-respiratory-pathogens-animal-specimens

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Görüntüleme.  Cornell University Animal Health Diagnostic Center.  Nano ölçekli PCR ile DNA ve RNA bazlı patojenlerin yüksek verimlilik testi bir sendromik köpek ve at solunum PCR panelini kullanarak tarif edilir. 

Video: High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

Mikroakışkan Chip İmalat ve İnfluenza Algılama Yöntemi

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Biyomühendislik

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly sensitive. This protocol obtains precise measurements of gene expression from single worms or from bulk samples. The protocol presented here provides a novel adaptation of existing methods for complementary DNA (cDNA) preparation coupled to a nanofluidic RT-qPCR platform. The first part of this protocol, named &#8216;Worm-to-CT&#8217;, allows cDNA production directly from nematodes without the need for prior mRNA isolation. It increases experimental throughput by allowing the preparation of cDNA from 96 worms in 3.5 h. The second part of the protocol uses existing nanofluidic technology to run high-throughput RT-qPCR on the cDNA. This paper evaluates two different nanofluidic chips: the first runs 96 samples and 96 targets, resulting in 9,216 reactions in approximately 1.5 days of benchwork. The second chip type consists of six 12 x 12 arrays, resulting in 864 reactions. Here, the Worm-to-CT method is demonstrated by quantifying mRNA levels of genes encoding heat shock proteins from single worms and from bulk samples. Provided is an extensive list of primers designed to amplify processed RNA for the majority of coding genes within the C. elegans genome.

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

In this article a high-throughput protocol for fast and reliable determination of gene expression levels in single or bulk C. elegans samples is described. This protocol does not require RNA isolation and produces cDNA directly from samples. It can be used together with high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

Nanoakışkan Teknoloji Kullanarak Tek ve Toplu C. elegans Örneklerinde Yüksek Verimli Nicel RT-PCR

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

Genetik

High-Performance Graphene-Modified Sensing Chip for SARS-CoV-2 Detection

This sensing prototype model involves the development of a reusable, twofold graphene oxide (GrO)-glazed double inter-digitated capacitive (DIDC) detecting chip for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 virus (SARS-CoV-2) specifically and rapidly. The fabricated DIDC comprises a Ti/Pt-containing glass substrate glazed with graphene oxide (GrO), which is further chemically modified with EDC-NHS to immobilize antibodies (Abs) hostile to SARS-CoV-2 based on the spike (S1) protein of the virus. The results of insightful investigations showed that GrO gave an ideal engineered surface for Ab immobilization and enhanced the capacitance to allow higher sensitivity and low sensing limits. These tunable elements helped accomplish a wide sensing range (1.0 mg/mL to 1.0 fg/mL), a minimum sensing limit of 1 fg/mL, high responsiveness and good linearity of 18.56 nF/g, and a fast reaction time of 3 s. Besides, in terms of developing financially viable point-of-care (POC) testing frameworks, the reusability of the GrO-DIDC biochip in this study is good. Significantly, the biochip is specific against blood-borne antigens and is stable for up to 10 days at 5 &#176;C. Due to its compactness, this scaled-down biosensor has the potential for POC diagnostics of COVID-19 infection. This system can also detect other severe viral diseases, although an approval step utilizing other virus examples is under development.

The present protocol describes the fabrication of low-cost biosensing prototypes based on useful nanosystems for accurately detecting viral proteins (at the Fg level). Such a tiny sensor platform allows for point-of-care applications that can be integrated with the Internet of Medical Things (IoMT) to meet telemedicine objectives.

This sensing prototype model involves the development of a reusable, twofold graphene oxide (GrO)-glazed double inter-digitated capacitive (DIDC) ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by a high rate of transmission and low mortality, the COVID-19 pandemic necessitated accurate and efficient diagnostic testing, particularly in closed populations such as residential universities. Initial availability of nucleic acid testing, like nasopharyngeal swabs, was limited due to supply chain pressure which also delayed reporting of test results. Saliva-based reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) testing has shown to be comparable in sensitivity and specificity to other testing methods, and saliva collection is less physically invasive to participants. Consequently, we developed a multiplex RT-qPCR diagnostic assay for population surveillance of Clemson University and the surrounding community. The assay utilized open-source liquid handling robots and thermocyclers instead of complex clinical automation systems to optimize workflow and system flexibility. Automation of saliva-based RT-qPCR enables rapid and accurate detection of a wide range of viral RNA concentrations for both large- and small-scale testing demands. The average turnaround for the automated system was &#60; 9 h for 95% of samples and &#60; 24 h for 99% of samples. The cost for a single test was $2.80 when all reagents were purchased in bulk quantities.

The protocol describes a SARS-CoV-2 diagnostic method that utilizes open-source automation to perform RT-qPCR molecular testing of saliva samples. This scalable approach can be applied to clinical public health surveillance as well as to increase the capacity of smaller university laboratories.

Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

İzotermal amplifikasyon kullanılarak insan solunum yolu bakteriyel enfeksiyonu teşhisi

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will provide practical guidelines for managing and treating RTIs. This study describes a method for rapidly detecting bacterial pathogens that cause respiratory tract infections via multi-channel loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP is a sensitive and specific diagnostic tool that rapidly detects bacterial nucleic acids with high accuracy and reliability. The proposed method offers a significant advantage over traditional bacterial culturing methods, which are time-consuming and often require greater sensitivity for detecting low levels of bacterial nucleic acids. This article presents representative results of K. pneumoniae infection and its multiple co-infections using LAMP to detect samples (sputum, bronchial lavage fluid, and alveolar lavage fluid) from the lower respiratory tract. In summary, the multi-channel LAMP method provides a rapid and efficient means of identifying single and multiple bacterial pathogens in clinical samples, which can help prevent the spread of bacterial pathogens and aid in the appropriate treatment of RTIs.

Yazar Spotlight: Mikroakışkan Çip Kullanarak Solunum Patojenlerinin Hızlı Tespitini Geliştirme 

Various bacterial pathogens can cause respiratory tract infections and lead to serious health issues if not detected accurately and treated promptly. Rapid and accurate detection of these pathogens via&#160;loop-mediated isothermal amplification provides effective management and control of respiratory tract infections in clinical settings.

Mikroakışkan çip bazlı döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla alt solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan bakteriyel patojenlerin hızlı tespiti

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of A. baumannii is crucial for prompt treatment, effective infection control, and curbing antibiotic resistance. However, there is no suitable method for rapid and easy on-site detection of A. baumannii. The DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) system offers a rapid, precise, and sensitive approach to A. baumannii detection by integrating the target-specific recognition capabilities of Cas12a with the isothermal amplification efficiency of Recombinase Polymerase Amplification (RPA). This protocol details the detection of A. baumannii using RPA combined with LbaCas12a endonuclease. The following steps are described in this article: extraction of DNA, selection of a specific DNA sequence, design of primer and CRISPR RNA (crRNA), construction of positive recombinant plasmid, setup of Cas12a-RPA assay, optimization of the RPA amplification system, visualization of the RPA-CRISPR/Cas12a assay using a fluorescence detection tool such as a real-time PCR instrument, and evaluation of sensitivity and specificity evaluation.

To facilitate the rapid and precise detection of Acinetobacter baumannii, we present a protocol that employs Recombinase Polymerase Amplification (RPA) in conjunction with LbaCas12a endonuclease for identifying A. baumannii infections.

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of ...

Düşük Gelirli Ülkelerde Kuduzu Kontrol Etmek için Nano Gözenek Tabanlı Genomik Bir Yaklaşım

Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic surveillance remains limited in many low- and middle-income countries (LMICs), where dog-mediated rabies and/or rabies transmitted by wildlife such as vampire bats pose major public health and economic concerns. We present here a rapid and affordable sample-to-sequence-to-interpretation workflow using nanopore technology. Protocols for sample collection and the diagnosis of rabies are briefly described, followed by details of the optimized whole genome sequencing workflow, including primer design and optimization for multiplex polymerase chain reaction (PCR), a modified, low-cost sequencing library preparation, sequencing with live and offline base calling, genetic lineage designation, and phylogenetic analysis. Implementation of the workflow is demonstrated, and critical steps are highlighted for local deployment, such as pipeline validation, primer optimization, inclusion of negative controls, and the use of publicly available data and genomic tools (GLUE, MADDOG) for classification and placement within regional and global phylogenies. The turnaround time for the workflow is 2-3 days, and the cost ranges from $25 per sample for a 96 sample run to $80 per sample for a 12 sample run. We conclude that setting up rabies virus genomic surveillance in LMICs is feasible and can support progress toward the global goal of zero dog-mediated human rabies deaths by 2030, as well as enhanced monitoring of wildlife rabies spread. Moreover, the platform can be adapted for other pathogens, helping to build a versatile genomic capacity that contributes to epidemic and pandemic preparedness.

Yazar Spotlight: Kaynak Sınırlı Ortamlarda Kuduz Kontrolünü İlerletmek için Uygun Maliyetli Bir Genomik İş Akışı 

Here, we present a rapid and cost-effective workflow for characterizing rabies virus (RABV) genomes using nanopore technology. The workflow is intended to support genomics-informed surveillance at a local level, providing information on circulating RABV lineages and their placement within regional phylogenies to guide rabies control measures.

Nanopor Teknolojisi Kullanılarak Kuduz Virüsünün Hızlı Karakterizasyonu için Tüm Genom Dizilimi

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic ...

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Mikroakışkan Chip İmalat ve İnfluenza Algılama Yöntemi

Nanoakışkan Teknoloji Kullanarak Tek ve Toplu C. elegans Örneklerinde Yüksek Verimli Nicel RT-PCR

High-Performance Graphene-Modified Sensing Chip for SARS-CoV-2 Detection

Açık Kaynak Pipetleme Robotlarını Kullanan Verimli SARS-CoV-2 Kantitatif Ters Transkriptaz PCR Tükürük Teşhis Stratejisi

Mikroakışkan çip bazlı döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla alt solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan bakteriyel patojenlerin hızlı tespiti

Mikroakışkan çip bazlı döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla alt solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan bakteriyel patojenlerin hızlı tespiti

Mikroakışkan çip bazlı döngü aracılı izotermal amplifikasyon yoluyla alt solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan bakteriyel patojenlerin hızlı tespiti

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Nanopor Teknolojisi Kullanılarak Kuduz Virüsünün Hızlı Karakterizasyonu için Tüm Genom Dizilimi