Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe'deki mitokondriyal solunum zinciri proteinlerinin ekspresyon ve kompleks montajının analizi

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe , mitokondriyi incelemek için çekici bir model olarak ortaya çıkıyor. Burada, S. pombe'deki mitokondriyal solunum komplekslerinin bolluğunu ve montajını analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu, korunmuş genlerin mitokondriyal solunum zincirindeki yeni işlevlerinin karakterizasyonunu sağlar.

Mitokondriyal solunum zinciri, hücresel enerji metabolizması için çok önemlidir ve oksidatif fosforilasyonun çekirdeği olarak hizmet eder. Mitokondriyal solunum zinciri, beş enzim kompleksini ve bunların etkileşen süper komplekslerini içerir. Bu proteinlerin ekspresyon ve kompleks montajının analizi, mitokondriyal fonksiyonu anlamak için hayati önem taşır. Bu, mitokondriyal biyoloji çalışmaları için tomurcuklanan mayaya telafi edici bir sistem sağlayan mükemmel bir model organizma fisyon mayası olan Schizosaccharomyces pombe'de (S. pombe) biyokimyasal ve genetik yöntemlerin birleştirilmesiyle incelenebilir. Burada, S. pombe mitokondrisinin izolasyonu ve mitokondriyal solunum proteinlerinin SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve mavi doğal PAGE (BN-PAGE) ile ekspresyon seviyelerinin ve komplekslerinin analizi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Kısaca, vahşi tip ve gen mutantlarından mitokondri saflaştırılır ve daha sonra kompleksleri çözündürülür ve SDS-PAGE/BN-PAGE ve immünoblotlamaya tabi tutulur. Bu yöntem, bir genin mitokondriyal solunum zincirindeki yeni işlevinin karakterizasyonunu sağlar.

Mitokondri, enerji için hücresel solunum, beslenme metabolizması ve hücre ölümü gibi çeşitli biyolojik süreçlerde önemli roller oynar¹. Mitokondrinin arızalanması beyin, kas ve gelişimsel hastalıklarla ilgilidir ^2,3. Bu nedenle, mitokondri ile ilgili çalışmalar, insan yaşlanmasını ve sağlığını iyileştirmek için hayati önem taşımaktadır.

Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), mitokondri^4'teki genlerin işlevlerini incelemek için uzun süredir kullanılmaktadır, çünkü solunumda kusurlu maya mutantları fermantasyon yoluyla hayatta kalmak için hala enerji üretebilir. Bununla birlikte, minyon pozitiftir ve mitokondriyal DNA (mtDNA) olmadan çoğalabilir. Sonuç olarak, mitokondriyal gen ekspresyonunda kusurlu gen mutantları genellikle mtDNA'larını kaybeder ve bu da daha fazla çalışmayı zorlaştırır. Buna karşılık, evrimsel olarak S. cerevisiae'den uzak olan fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), hayatta kalmak için mtDNA'ya ihtiyaç duyan minyon-negatif bir mayadır. Ayrıca, S. pombe'nin mtDNA ve mitokondriyal mRNA'sının organizasyonu, daha yüksek ökaryotlarınkine benzer⁵. Mitokondriyal gen ekspresyonu için S. cerevisiae'deki sadece altı temel gene kıyasla, S. pombe'deki birçok (96) temel gen gereklidir⁶. Bu nedenle, S. pombe, mitokondrideki genlerin yeni işlevlerini incelemek için çekici bir model olarak ortaya çıkmaktadır. Bununla birlikte, S. cerevisiae'de mitokondriyi inceleyen yayınların sayısı S. pombe'dekinden yaklaşık 100 kat daha fazladır ve S. pombe'de mitokondriyi inceleyen rapor edilen yöntemler ve protokoller de azdır⁷.

Mitokondriyal solunum zinciri, hücresel enerji üretimi için çok önemlidir ve mitokondri^8'in çekirdeği olarak görev yapar. NADH-ubikinon oksidoredüktaz (Kompleks I), süksinat dehidrojenaz (Kompleks II), ubikinon-sitokrom c oksidoredüktaz veya sitokrom bc1 kompleksi (Kompleks III), sitokrom c oksidaz (Kompleks IV) ve ATP sentaz (Kompleks V) gibi solunum zinciri kompleksleri I-V, elektron, ubikinon (CoQ) ve sitokrom c (Cyt c) taşıyan iki ara substrat ile birlikte ^oluşur9. Ayrıca, montaj mekanizmaları büyük ölçüde belirsiz kalan daha yüksek dereceli süper kompleksler oluştururlar^{ve oluştururlar 10,11}. Bununla birlikte, S. pombe, harici NADH dehidrojenazları Nde1 ve dahili Ndi1 12,13,14 ile değiştirilebilen kompleks I'den yoksundur. S. pombe'deki mitokondriyal genom, kompleks III'ün bir alt birimini (Cob1), kompleks IV'ün üç alt birimini (Cox1, Cox2, Cox3) ve kompleks V'nin üç alt birimini (Atp6, Atp8, Atp9) ^kodlar15,16. Yakın zamanda, bu proteinlerin ekspresyon ve kompleks montajının, S. pombe'de sırasıyla RNA helikaz Mss116 (Δmss116)¹⁶ ve montaj faktörü Shy1 (Δshy1)^15'in silinmesinden etkilendiğini bildirdik. Bu yöntemleri kullanarak mitokondriyal solunum zincirinde daha fazla genin yeni işlevlerinin keşfedilmesini kolaylaştırmak için, burada ekspresyon seviyelerinin SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) analizi ve S. pombe'deki mitokondriyal solunum zinciri proteinlerinin kompleks montajının mavi yerel PAGE (BN-PAGE) analizi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Mitokondrinin S. pombe'den izole edilmesinin ardındaki mantık, S. cerevisiae^17'de belirlenen yöntemlere dayanmaktadır. Sferoplastlar ilk olarak maya hücre duvarlarının sindirilmesiyle hazırlanır. Mekanik olarak homojenize edilirler ve mitokondri, diferansiyel santrifüjleme¹⁸ ile fraksiyonlanır. Daha sonra, mitokondriyal solunum zinciri proteinleri, SDS-PAGE ve BN-PAGE'yi takiben çözündürülür ve immünoblotlanır. BN-PAGE tekniği başlangıçta solunum zinciri kompleksleri ^19,20,21 gibi mitokondriyal zar proteinlerinin ayrılması için geliştirilmiştir. Korunmuş bozulmamış komplekslere sahip zar proteinleri, hafif iyonik olmayan deterjanlar tarafından çözündürülür ve anyonik boya Coomassie G-250 ile yüklenir. Böylece, protein kompleksleri, gradyan bir doğal PAGE jeli²² içinde kütlelerine göre ayrılır. Bu yöntem, S. cerevisiae²³ ve memeli hücrelerinde^24,25 mitokondriyal solunum zinciri komplekslerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır; bununla birlikte, S. pombe mitokondrisine yaygın olarak uygulanmamıştır.

Toplu olarak, burada mitokondrinin S. pombe hücrelerinden izole edildiği ve mitokondriyal solunum zinciri proteinlerinin SDS-PAGE ve BN-PAGE'ye tabi tutulduğu ve ardından immünoblotlamanın yapıldığı bir yöntem sunuyoruz. Deneysel akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Yüksek kaliteli mitokondri ve antikorlarla, S. pombe'de açıklanan bu yöntem, mitokondriyal solunum zinciri proteinlerinin ekspresyonu ve/veya komplekslerinin birleştirilmesinde işlevlere sahip daha fazla geni tanımlamak için diğer organizmalara da uygulanabilir.

1. S. pombe sferoplast ürünlerinin hazırlanması

1. OD 600 = 0.05'ten OD_{600 =} 1.0'a kadar belirli bir suş (WT veya Δshy1) için Takviyeler (YES) ortamı (Tablo 1) ile Maya Ekstraktında 1 L S. pombe hücresi büyütün.
   NOT: OD_600'lü S. pombe hücrelerini 2.0'dan fazla büyütmeyin, çünkü sferoplast oluşturmak için litik enzimler tarafından sindirilmesi zordur. Hem vahşi tip (WT) hem de gen mutant suşları, karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için paralel olarak büyütülebilir.
2. Hücreleri 4 ° C'de 3.000 x g'da 5 dakika santrifüjleme ile hasat edin. Peletlenmiş hücreleri 500 mL ddH₂O içinde ve pelet hücrelerini 4 ° C'de 3.000 x g'da 5 dakika santrifüjleme ile yeniden süspanse edin. Hücreleri 1x yıkayın.
3. Hücre peletinin ıslak ağırlığını ölçün (1.000 OD₆₀₀ hücre için yaklaşık 2 g). 8 mL 1x S tamponundaki hücreleri yeniden süspanse edin (Tablo 2; 4 mL S tamponu / g hücreleri). Taze olarak 10 mM'ye ditiyotreitol (DTT) ve 1 mM'ye fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ekleyin.
4. S. pombe'nin hücre duvarını sindirmek için hücre süspansiyonuna litik enzimler ekleyin. Kullanılan litik enzime bağlı olarak süre boyunca 30 ° C'de bir çalkalayıcıda döndürün.
   NOT: Hücre duvarının uygun şekilde sindirilmesi, yüksek kaliteli mitokondriyi izole etmek için çok önemli bir adımdır.
   1. Parçalama enzimi için, hücrelerin ıslak ağırlığının g'ı başına 100 mg toz ekleyin ve yaklaşık 2 saat inkübe edin. Lyticase için, her g ıslak ağırlık için 10 mg toz ekleyin ve yaklaşık 1 saat inkübe edin. Zymolyase-20T / 100T için, g ıslak ağırlık başına 5 mg / 1 mg toz ekleyin ve yaklaşık 1 saat inkübe edin. Lallzyme MMX için, her g ıslak ağırlık için 1 g toz ekleyin ve yaklaşık 0,5 saat inkübe edin. Vinotaste enzimi için, her g yaş ağırlık için 1 g toz ekleyin ve yaklaşık 2 saat inkübe edin.
5. Mikroskopi ile sferoplast oluşumunu gözlemleyin (40x objektif). S tamponunda 20 μL hücre süspansiyonu alın ve 1 mL ddH₂O'ya ekleyin, çoğu hücrenin kırıldığını görün (Şekil 2C).
   NOT: Normal S. pombe hücreleri çubuk şekillerine sahiptir (Şekil 2A). S tamponundaki sferoplastların %80'inden fazlası, verimli sindirimden sonra yuvarlak hale gelmelidir (Şekil 2B).
6. 4 ° C'de 1.000 x g'da 10 dakika santrifüjleme ile pelet sferoplastları. Sferoplastileri 8 mL buz gibi soğuk 1x S tamponunda yeniden süspanse edin ve 2 kez yıkayın. Kesik uçlu pipetler kullanarak sferoplastları nazikçe yeniden süspanse edin.

2. S. pombe sferoplastlarının mekanik homojenizasyonu

1. Spferoplastileri 1x proteaz inhibitörleri ile 8 mL buz gibi soğuk 1x homojenizasyon tamponunda (Tablo 3; 4 mL homojenizasyon tamponu / g hücreleri) yeniden süspanse edin. Hücreleri önceden soğutulmuş bir cam homojenizatöre aktarın (Bir havaneli ve bir test tüpü ile doku öğütücü).
2. Sıkıca oturan havaneli ile yukarı ve aşağı yaklaşık 15 vuruş yaparak hücreleri mekanik olarak homojenize edin. Mitokondriyal proteinlerin bozulmasını önlemek için, vuruşlar sırasında kabarcıklardan kaçının ve homojenizasyon tamponunu ve homojenizatörü her zaman buz üzerinde inkübe edin.
   NOT: Test tüpüne sıkı ve gevşek oturan iki tip havan tokmağı vardır. Gevşek bir havaneli kullanılıyorsa, 25 vuruşa kadar gerekebilir. Vuruş sayısı optimize edilmelidir, çünkü çok fazla vuruş mitokondriyal zarlara zarar verebilir ve çok az vuruş mitokondriyal verimi azaltır.
3. Sferoplastlardaki kırık hücre zarını mikroskopla kontrol edin (40x objektif).
   NOT: Çoğu sferoplast kırılma şeklini kaybeder ve bir homojenizasyon tamponunda hayalet hücreler haline gelir. Mitokondri hala sağlam.

3. Santrifüjleme ile S. pombe mitokondri izolasyonu

1. Homojenize süspansiyonu santrifüj tüplerine aktarın ve kırılmamış hücreleri ve kalıntıları 4 ° C'de 1.000 x g'de 5 dakika santrifüjleme ile peletleyin.
2. Elde edilen süpernatanı 4 ° C'de 3.000 x g'de 5 dakika santrifüjleyin ve pelet çekirdeklerini sıkılaştırın. Pelet oluşumu kalmayana kadar bu adımı 1 kez tekrarlayın.
3. Süpernatanı yeni santrifüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de 12.000 x g'da 15 dakika santrifüjleme yoluyla mitokondri ve diğer kontamine organellere aktarın.
4. Süpernatanı boşaltın ve peleti 1 mL buz gibi soğuk 1x Sorbitol-EDTA-MOPS (SEM) tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 4). Mitokondriyi yıkamak için 4 ° C'de 12.000 x g'de 15 dakika santrifüjleyin.
5. Peletleri 1 mL buz gibi soğuk 1x SEM tamponunda yeniden süspanse edin ve gelecekteki deneyler için mitokondriyi ayırın.
   NOT: Bu pelet ham mitokondri içerir. Daha sonra SDS-PAGE ve BN-PAGE deneyleri için -80 °C'de saklanabilir. Ham mitokondri, diğer deneysel amaçlar için sükroz yoğunluk gradyanı ultra santrifüjleme ile de saflaştırılabilir.

4. SDS-PAGE ve mitokondriyal solunum zinciri proteinlerinin immünoblotlanması

1. Mitokondri süspansiyonunu yaklaşık 25 kat seyrelterek bir BCA protein niceleme kiti kullanarak bir mitokondriyal alikotun toplam protein konsantrasyonunu ölçün.
2. 40 μL mitokondriyal toplam proteine SDS-PAGE yükleme tamponu ekleyin. Belirtilen süre boyunca uygun sıcaklıkta inkübe ederek proteinleri denatüre edin.
   1. S. pombe Cox1, Cox3, Cob1 ve Atp6'yı tespit etmek için mitokondriyal proteinleri 45 °C'de 3 dakika boyunca denatüre edin. S. pombe Cox2 ve Hsp60'ı tespit etmek için mitokondriyal proteinleri 90 °C'de 5 dakika boyunca denatüre edin.
3. % 12 SDS-PAGE jeline yaklaşık 20 μg (yaklaşık 4 μL) mitokondriyal protein yükleyin. Mitokondriyal solunum zinciri proteinlerinin immünoblotunu adım 6 15'te tarif edildiği gibi uygun antikorlarla^{gerçekleştirin}.
   NOT: S. pombe Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 ve Atp6 proteinleri, S. pombe'de bile ortak bir epitop ile etiketleme gibi düzenlenmesi zor olan mtDNA tarafından kodlanmıştır. Bu nedenle, bu proteinleri tespit etmek için spesifik antikorlar gereklidir. İzole edilmiş mitokondrinin saflığını ve bütünlüğünü doğrulamak için, bu solunum zinciri proteinleri, sitoplazmik ve nükleer proteinler içermesi gereken süpernatantta aynı anda test edilebilir. Tersine, aktin ve histon H3 gibi temsili sitoplazmik ve nükleer proteinler mitokondri örneğinde test edilebilir.

5. BN-PAGE için mitokondriyal numune hazırlama

1. 4 ° C'de 12.000 x g'da 15 dakika santrifüjleme ile adım 3.5'teki önceki alikotlardan pelet mitokondri. BN-PAGE analizi için 2 mg mitokondriyal protein (yaklaşık 400 μL mitokondriyal alikot) kullanın.
2. Mitokondriyi 200 μL 3x BN-PAGE jel tamponunda (1.5 M 6-Aminokaprobuz asidi; 150 mM Bis-Tris, pH 7.0, HCl ile ayarlanır) yeniden süspanse edin. 2 μL 100x PMSF ve 1 μL 1 M MgCl₂ ekleyin. Süspansiyonu 4 ° C'de 12.000 x g'de 15 dakika santrifüjleyin.
3. Mitokondri peletini 160 μL% 5 (a / h) digitonin (DG) veya% 64 μL% 5 (a / h) n-Dodesil-β-D-maltopiranosid (DDM) içinde yeniden süspanse edin. Her 10 dakikada bir hafifçe karıştırarak 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
   1. S. pombe'deki ilk denemeler için, solunum zinciri süper komplekslerini korumak için mitokondriyal zarları çözündürmek için mg mitokondriyal protein başına 4 mg DG deterjan ekleyin. Tek tek mitokondriyal solunum zinciri komplekslerini ayırmak için mg mitokondriyal protein başına 1.6 mg DDM deterjan ekleyin. BN-PAGE'deki farklı protein komplekslerinin ilk sonuçlarına göre DG ve DDM tedavisinin konsantrasyonunu 2 kat artırarak veya azaltarak ayarlayın.
4. Süspansiyonu 4 ° C'de 20.000 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aktarın ve BCA kantifikasyon kiti ile çözünmüş protein konsantrasyonunu ölçün.
5. Yaklaşık 160 μL DG ile muamele edilmiş süpernatana 80 μL (1/2 deterjan hacmi) 3x BN-PAGE numune tamponu (Tablo 5) ekleyin veya yaklaşık 64 μL DDM ile muamele edilmiş süpernata 32 μL (1/2 deterjan hacmi) 3x BN-PAGE numune tamponu ekleyin.
   NOT: SDS-PAGE'den farklı olarak, BN-PAGE için protein örnekleri kaynatma yoluyla denatüre edilemez.

6. BN-PAGE ve mitokondriyal solunum zinciri komplekslerinin immünoblotlanması

1. Prekast yerli Bis-Tris jeli (%3-%12 gradyan) birleştirin. Alternatif olarak, %3 ve %12 BN-PAGE jeli (Tablo 3) bir gradyan karıştırıcıda karıştırarak el yapımı doğal Bis-Tris jeli (%12-%6 gradyan) hazırlayın.
2. DG veya DDM ile muamele edilmiş protein örneklerini ve doğal PAGE için yüksek moleküler ağırlıklı protein markörünü yükleyin.
   1. Mitokondriyal solunum zinciri komplekslerinin BN-PAGE analizi için toplam 100 μg çözünmüş mitokondriyal protein gereklidir. BN-PAGE jeline yaklaşık 12 μL DG ile muamele edilmiş protein numunesi veya 5 μL DDM ile muamele edilmiş protein numunesi yükleyin. Mitokondriyal matris proteini Mcp60 (Hsp60) gibi yükleme kontrolünün yoğunluklarının, son maruziyetten¹⁵ sonra tüm numuneler arasında eşit olduğundan emin olmak için yükleme hacmini ayarlayın.
3. Jeli% 0.02 (a / h) Coomassie G-250 ile katot tamponu kullanarak yaklaşık 30 dakika boyunca 80 V / 6 mA sabit voltaj / akımda çalıştırın. Daha sonra, mavi katot tamponunu Coomassie G-250 içermeyen katot tamponu ile değiştirin ve Coomassie G-250 mavi boya önü jel tabanına ulaşana kadar yaklaşık 3 saat boyunca 10 mA'lık sabit bir akımda çalışmaya devam edin.
   1. Mitokondriyal solunum zinciri komplekslerinin bozulmasını veya sökülmesini önlemek için jeli önceden soğutulmuş tamponlarla 4 °C'de çalıştırın. Prekast jel için, prekast çalışma tamponunu kullanın. El yapımı jel için 1x BN-PAGE anot çalıştırma tamponu (50 mM Bis-Tris, pH 7.0, HCl ile ayarlanmış) ve 1x BN-PAGE katot çalıştırma tamponu (15 mM Bis-Tris, pH 7.0, HCl ile ayarlanmış; 50 mM Trisin) kullanın.
4. Protein işaretleyici ile yüklü jel şeridini kesin. İşaretleyiciyi Coomassie R-250 tamponu ile 15 dakika boyayın. İşaretleyici görünene kadar lekeyi çıkarın.
   NOT: Doğal PAGE için yüksek moleküler ağırlıklı protein markörü önceden boyanmamıştır. Coomassie R-250 ile boyandıktan sonra görünür olacaktır.
5. 30 dakika dengelemek için jelin diğer kısmını 1x BN-PAGE transfer tamponuna (Tablo 7) daldırın. Aynı boyuttaki 0,45 μm PVDF leke membranını %100 metanol ile durulayın ve 10 dakika boyunca dengelemek için BN-PAGE transfer tamponuna daldırın. Jeldeki proteinleri 2 saat boyunca 300 mA'lık sabit bir akım altında 0.45 μm'lik bir PVDF leke zarına aktarın.
   NOT: NC membran Coomassie G-250 boyasını çok sıkı bağladığı için nitroselüloz (NC) membran önerilmez.
6. Coomassie G-250 mavi boyayı yıkamak için PVDF membranını %100 metanol ile durulayın. PVDF membranını, 25 ° C'de 1 saat boyunca% 5 (a / h) yağsız süt içeren 1x TBS (50 mM Tris, pH 8.0, HCl ile ayarlanmış; 150 mM NaCl) bazlı bloke edici tamponda inkübe edin.
7. PVDF membranını S. pombe mitokondriyal solunum zinciri komplekslerine karşı belirtilen birincil antikorlarla gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Kompleks III'ü tespit etmek için Cob1 antikorunun konsantrasyonu 1: 1.000'dir. Kompleks IV'ü tespit etmek için Cox1 antikorunun konsantrasyonu 1: 2.000'dir. Kompleks V'yi tespit etmek için Atp6 antikorunun konsantrasyonu 1: 200'dür.
8. PVDF membranını 1x TBST tamponu ile yıkayın (Tablo 8). PVDF membranını ikincil antikor ile 25 ° C'de 1 saat boyunca 1: 10.000 konsantrasyonda inkübe edin.
9. PVDF membranını 1x TBST tamponu ile yıkayın. PVDF membranını açığa çıkarın ve tarayın. Mitokondriyal solunum zinciri komplekslerinin ve süper komplekslerinin moleküler ağırlıklarını tahmin etmek için BN-PAGE jelinin açıkta kalan görüntüsünü doğal protein markörünün görüntüsüyle hizalayın.

Bu protokolü daha önce, insan SURF1'in S. pombe homologu olan shy1'in silinmesinin, mtDNA kodlu solunum zinciri proteinlerinin ekspresyonu ve mitokondriyal solunum zinciri komplekslerinin montajı üzerindeki etkilerini araştırmak için kullanmıştık. Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 ve Atp6'nın kararlı durum seviyelerinin Δshy1 suşunda önemli ölçüde azaldığını bulduk (Şekil 3), bu da mtDNA tarafından kodlanan so...

Bu çalışmada, S. pombe mitokondrisini izole etmek ve mitokondriyal solunum zinciri proteinlerinin ekspresyonunu ve kompleks montajını analiz etmek için SDS-PAGE ve BN-PAGE gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Ko-immünopresipitasyon (co-IP), protein komplekslerinin montajını tespit etmek için yaygın olarak kullanılmıştır; bununla birlikte, co-IP'nin mitokondriyal zar proteinlerinin montajını tespit etmesi zordur...

Hiçbir çıkar çatışmamız yok.

Dr. Ying Huang ve Dr. Ying Luo'ya destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan hibelerle (32270048 J. S.'ye ve 31900403 G. F.'ye) ile desteklenmiştir.