Анализ экспрессии и сборки комплексов белков митохондриальной дыхательной цепи в делящихся дрожжах Schizosaccharomyces pombe

Дрожжи для деления Schizosaccharomyces pombe становятся привлекательной моделью для изучения митохондрий. В данной статье мы описываем протокол анализа численности и сборки митохондриальных дыхательных комплексов у S. pombe. Это позволяет охарактеризовать новые функции консервативных генов в митохондриальной дыхательной цепи.

Митохондриальная дыхательная цепь имеет решающее значение для клеточного энергетического метаболизма, выступая в качестве ядра окислительного фосфорилирования. Митохондриальная дыхательная цепь состоит из пяти ферментных комплексов и взаимодействующих с ними суперкомплексов. Анализ экспрессии и сборки комплексов этих белков жизненно важен для понимания функции митохондрий. Это можно изучить, объединив биохимические и генетические методы в превосходном модельном организме деления дрожжей Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), который обеспечивает компенсаторную систему почковающихся дрожжей для исследований митохондриальной биологии. Здесь мы представляем подробный протокол выделения митохондрий S. pombe и анализа уровней экспрессии и сборки комплексов митохондриальных дыхательных белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле SDS (SDS-PAGE) и blue native-PAGE (BN-PAGE). Вкратце, митохондрии дикого типа и генных мутантов очищаются, а затем их комплексы растворяются и подвергаются SDS-PAGE/BN-PAGE и иммуноблоттингу. Этот метод позволяет охарактеризовать новую функцию гена в митохондриальной дыхательной цепи.

Митохондрии играют важную роль в различных биологических процессах, таких как энергетическое дыхание клеток, метаболизм питательных веществ^{и гибель} клеток. Нарушение работы митохондрий связано с заболеваниями головного мозга, мышц и развития ^2,3. Таким образом, исследования митохондрий жизненно важны для улучшения старения и здоровья человека.

Почковающиеся дрожжи Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) долгое время использовались для изучения функций генов в митохондриях4, поскольку дрожжевые мутанты с дефектами дыхания все еще могут производить энергию для выживания путем брожения. Тем не менее, он миниатюрен и может размножаться без митохондриальной ДНК (мтДНК). Следовательно, генные мутанты с дефектами в экспрессии митохондриальных генов часто теряют свою мтДНК, что затрудняет дальнейшее изучение. Напротив, дрожжи деления Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), которые эволюционно далеки от S. cerevisiae, являются миниатюрными дрожжами, которым для выживания требуется мтДНК. Более того, организация мтДНК и митохондриальной мРНК S. pombe сходна с таковыми у высших эукариот⁵. Многие (96) основных генов у S. pombe, по сравнению с шестью основными генами у S. cerevisiae, необходимы^{для экспрессии} митохондриальных генов. Таким образом, S. pombe становится привлекательной моделью для изучения новых функций генов в митохондриях. Тем не менее, количество публикаций, изучающих митохондрии у S. cerevisiae, примерно в 100 раз больше, чем у S. pombe, и представленные методы и протоколы изучения митохондрий у S. pombe также немногочисленны⁷.

Митохондриальная дыхательная цепь имеет решающее значение для производства клеточной энергии и служит ядром митохондрий8. Он включает в себя комплексы дыхательных цепей I-V, такие как НАДН-убихиноноксидоредуктаза (комплекс I), сукцинатдегидрогеназа (комплекс II), убихинон-цитохром с оксидоредуктаза или комплекс цитохрома bc1 (комплекс III), цитохром с оксидаза (комплекс IV) и АТФ-синтаза (комплекс V), вместе с двумя промежуточными субстратами, несущими электрон, убихинон (CoQ) и цитохром с (Cyt c)⁹. Они также взаимодействуют и образуют сверхкомплексы более высокого порядка, механизмы сборки которых остаются в значительной степени неясными^10,11. Однако у S. pombe отсутствует комплекс I, который может быть замещен внешними NADH-дегидрогеназами Nde1 и внутренними Ndi1 12,13,14. Митохондриальный геном S. pombe кодирует субъединицу комплекса III (Cob1), три субъединицы комплекса IV (Cox1, Cox2, Cox3) и три субъединицы комплекса V (Atp6, Atp8, Atp9)^15,16. Недавно мы сообщили, что на экспрессию и сборку комплексов этих белков влияет делеция геликазы РНК Mss116 (Δmss116)¹⁶ и фактора сборки Shy1 (Δshy1⁾¹⁵ у S. pombe, соответственно. Чтобы облегчить обнаружение новых функций генов в митохондриальной дыхательной цепи с помощью этих методов, здесь мы приводим подробный протокол для анализа уровней экспрессии электрофореза в полиакриламидном геле SDS (SDS-PAGE) и анализа сборки комплексов белков митохондриальной дыхательной цепи у S. pombe.

Обоснование выделения митохондрий из S. pombe основано на методах, установленных для S. cerevisiae¹⁷. Сферопласты сначала получают путем переваривания клеточных стенок дрожжей. Они механически гомогенизируются, а митохондрии фракционируются путем дифференциального центрифугирования18. Впоследствии белки митохондриальной дыхательной цепи растворяют и иммуноблотируют после SDS-PAGE и BN-PAGE. Метод BN-PAGE был первоначально разработан для разделения белков митохондриальных мембран, таких как комплексы дыхательных цепей 19,20,21. Мембранные белки с сохраненными интактными комплексами растворяются мягкими неионогенными детергентами и заряжаются анионным красителем Coomassie G-250. Таким образом, белковые комплексы разделяются по их массе в градиентном нативном геле²². Этот метод широко использовался для изучения комплексов митохондриальных дыхательных цепей у S. cerevisiae²³ и клеток млекопитающих^24,25; однако он не был широко применен к митохондриям S. pombe.

В совокупности мы представляем метод, в котором митохондрии выделяются из клеток S. pombe , а белки митохондриальной дыхательной цепи подвергаются SDS-PAGE и BN-PAGE с последующим иммуноблоттингом. Экспериментальная блок-схема показана на рисунке 1. Обладая высококачественными митохондриями и антителами, этот метод, описанный у S. pombe , также может быть применен к другим организмам для идентификации большего количества генов, выполняющих функции экспрессии и/или сборки комплексов белков митохондриальной дыхательной цепи.

1. Получение сферопластов S. pombe

1. Вырастите 1 л клеток S. pombe в среде дрожжевого экстракта с добавками (YES) (Таблица 1) для конкретного штамма (WT или Δshy1) от OD₆₀₀ = 0,05 до OD₆₀₀ = 1,0.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не выращивайте клетки S. pombe с OD₆₀₀ более 2,0, так как они с трудом перевариваются литическими ферментами с образованием сферопластов. Как дикий тип (WT), так и генно-мутантные штаммы могут быть выращены параллельно для получения сопоставимых результатов.
2. Соберите клетки центрифугированием в течение 5 мин при 3 000 x g при 4 °C. Ресуспендировать гранулированные клетки в 500 мл_ddH2O и гранулированные клетки центрифугированием в течение 5 мин при 3000 x g при 4 °C. Промыть ячейки 1х.
3. Измерьте вес клеточной гранулы во влажном состоянии (около 2 г для 1 000 OD₆₀₀ клеток). Ресуспендируйте клетки в 8 мл 1x S буфера (табл. 2; 4 мл S буфера/г клеток). Добавьте дитиотреитол (DTT) в 10 мМ и фенилметилсульфонилфторид (PMSF) в 1 мМ в свежем виде.
4. Добавьте в клеточную суспензию литические ферменты для переваривания клеточной стенки S. pombe. Вращайте в шейкере при температуре 30 °C в течение времени, зависящего от используемого литического фермента.
   Примечание: Правильное переваривание клеточной стенки является важным этапом для выделения высококачественных митохондрий.
   1. Для лизирующего фермента добавьте 100 мг порошка на г влажной массы клеток и инкубируйте около 2 ч. Для Литиказы добавьте 10 мг порошка на г влажного веса и выдерживайте около 1 часа. Для Zymolyase-20T/100T добавьте 5 мг/1 мг порошка на г сырого веса и инкубируйте около 1 часа. Для Lallzyme MMX добавьте 1 г порошка на г влажного веса и выдерживайте около 0,5 ч. Для фермента Vinotaste добавьте 1 г порошка на г влажного веса и выдерживайте около 2 часов.
5. Наблюдайте за образованием сферопластов с помощью микроскопии (объектив 40x). Возьмите 20 мкл клеточной суспензии в S-буфере и добавьте к 1 мл ddH₂O, чтобы убедиться, что большинство клеток разрушено (рис. 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальные клетки S. pombe имеют форму палочек (Рисунок 2А). Более 80% сферопластов в S-буфере после эффективного разложения должны стать круглыми (рисунок 2B).
6. Гранулы сферопласты центрифугируют в течение 10 мин при 1 000 x g при 4 °C. Суспендируйте сферопласты в 8 мл ледяного буфера 1x S и промойте 2x. Аккуратно суспендируйте сферопласты с помощью пипеток с отрезанными наконечниками.

2. Механическая гомогенизация сферопластов S. pombe

1. Ресуспендируйте сферопласты в 8 мл ледяного 1x гомогенизационного буфера (Таблица 3; 4 мл гомогенизационного буфера/г клеток) с 1x ингибиторами протеазы. Перенесите клетки в предварительно охлажденный гомогенизатор стекла (тканевый измельчитель Dounce с пестиком и пробиркой).
2. Механически гомогенизируйте клетки, сделав примерно 15 движений вверх и вниз плотно прилегающим пестом. Чтобы предотвратить деградацию митохондриальных белков, избегайте образования пузырьков во время инсультов и всегда инкубируйте гомогенизационный буфер и гомогенизатор на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует два типа пестиков с плотным и неплотным прилеганием к пробирке. Если используется рассыпной пестик, может понадобиться до 25 ударов. Количество ударов должно быть оптимизировано, потому что слишком большое количество ударов может повредить митохондриальные мембраны, а слишком малое количество ударов снижает выход митохондрий.
3. Проверьте поврежденную клеточную мембрану в сферопластах с помощью микроскопа (объектив 40x).
   Примечание: Большинство сферопластов теряют преломляющую форму и становятся призрачными клетками в гомогенизационном буфере. Митохондрии все еще неповреждены.

3. Выделение митохондрий S. pombe методом центрифугирования

1. Перенесите гомогенизированную суспензию в центрифужные пробирки и гранулы неразрушенных клеток и мусора путем центрифугирования в течение 5 мин при 1000 x g при 4 °C.
2. Полученный надосадочный продукт центрифугировать в течение 5 мин при 3 000 x g при 4 °C и гранулировать ядра. Повторите этот шаг 1 раз до тех пор, пока не перестанут образовываться гранулы.
3. Перенесите надосадочную жидкость в новые центрифужные пробирки и гранулы митохондрий и других загрязненных органелл путем центрифугирования в течение 15 мин при 12 000 x g при 4 °C.
4. Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендированную гранулу в 1 мл ледяного 1x Sorbitol-EDTA-MOPS (SEM) буфер (Таблица 4). Центрифугируйте в течение 15 минут при 12 000 x g при 4 °C, чтобы промыть митохондрии.
5. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл ледяного 1x SEM буфера и алипируйте митохондрии для будущих экспериментов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта гранула содержит сырые митохондрии. Его можно хранить при температуре -80 °C для последующих экспериментов SDS-PAGE и BN-PAGE. Сырые митохондрии также могут быть очищены с помощью ультрацентрифугирования с градиентом плотности сахарозы для других экспериментальных целей.

4. SDS-PAGE и иммуноблоттинг белков митохондриальной дыхательной цепи

1. Измерьте общую концентрацию белка в митохондриальной аликвоте с помощью набора для количественного определения белка BCA, разбавляя митохондриальную суспензию примерно в 25 раз.
2. Добавьте загрузочный буфер SDS-PAGE в 40 мкл митохондриальных общих белков. Денатурируйте белки путем инкубации в течение указанного времени при правильной температуре.
   1. Чтобы обнаружить S. pombe Cox1, Cox3, Cob1 и Atp6, денатурируйте митохондриальные белки при 45 °C в течение 3 минут. Чтобы обнаружить S. pombe Cox2 и Hsp60, денатурируйте митохондриальные белки при 90 °C в течение 5 минут.
3. Загрузите около 20 мкг (примерно 4 мкл) митохондриальных белков в 12% гель SDS-PAGE. Проведите иммуноблоттинг белков митохондриальной дыхательной цепи соответствующими антителами, как описано в шаге 6,¹⁵.
   Примечание: Белки S. pombe Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 и Atp6 кодируются мтДНК, которую трудно редактировать, как маркировку общим эпитопом даже у S. pombe. Таким образом, для обнаружения этих белков требуются специфические антитела. Чтобы проверить чистоту и целостность выделенных митохондрий, эти белки дыхательной цепи могут быть одновременно протестированы в надосадочной жидкости, которая должна содержать цитоплазматические и ядерные белки. И наоборот, репрезентативные цитоплазматические и ядерные белки, такие как актин и гистон H3, могут быть протестированы в образце митохондрий.

5. Подготовка митохондриального образца для BN-PAGE

1. Гранулированные митохондрии из предыдущих аликвот на стадии 3.5 методом центрифугирования в течение 15 мин при 12 000 х г при 4 °С. Используйте 2 мг митохондриальных белков (около 400 мкл митохондриальных аликвот) для анализа BN-PAGE.
2. Ресуспендируйте митохондрии в 200 мкл 3x BN-PAGE гелевого буфера (1,5 М 6-аминокапройсовой кислоты; 150 мМ Bis-Tris, pH 7,0, скорректированный с помощью HCl). Добавьте 2 мкл 100x PMSF и 1 мкл 1 M MgCl₂. Центрифугируйте суспензию в течение 15 мин при 12 000 x g при 4 °C.
3. Ресуспендируйте митохондриальную гранулу в 160 мкл 5% (w/v) дигитонина (DG) или 64 мкл 5% (w/v) n-додецил-β-D-мальтопиранозида (DDM). Выдерживать на льду в течение 30 минут, осторожно перемешивая каждые 10 минут.
   1. Для первых испытаний на S. pombe добавляли 4 мг детергента DG на мг митохондриальных белков для солюбилизации митохондриальных мембран для поддержания суперкомплексов дыхательной цепи. Добавьте 1,6 мг детергента DDM на мг митохондриальных белков, чтобы разделить отдельные комплексы митохондриальных дыхательных цепей. Регулируйте концентрацию ДГ и ДДМ путем увеличения или уменьшения в 2 раза в зависимости от исходных результатов различных белковых комплексов в BN-PAGE.
4. Центрифугировать суспензию в течение 5 мин при 20 000 x g при 4 °C. Перенесите надосадочную жидкость и измерьте концентрацию растворенного белка с помощью набора для количественного определения BCA.
5. Добавьте 80 мкл (1/2 объема моющего средства) 3x BN-PAGE буфера для проб (Таблица 5) примерно к 160 мкл надосадочной жидкости, обработанной DG, или добавьте 32 мкл (1/2 объема моющего средства) 3x BN-PAGE буфера для проб примерно до 64 мкл надосадочной жидкости, обработанной DDM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от SDS-PAGE, образцы белка для BN-PAGE не могут быть денатурированы путем кипячения.

6. BN-PAGE и иммуноблоттинг комплексов митохондриальной дыхательной цепи

1. Соберите сборный нативный гель Bis-Tris (градиент 3%-12%). В качестве альтернативы приготовьте нативный гель Bis-Tris ручной работы (градиент 3%-12%), смешав 3% и 12% геля BN-PAGE (Таблица 6) в градиентном миксере.
2. Загрузите образцы белка, обработанного DG или DDM, и высокомолекулярный белковый маркер для нативного PAGE.
   1. В общей сложности 100 мкг растворенных митохондриальных белков требуется для анализа BN-PAGE комплексов митохондриальных дыхательных цепей. Загрузите примерно 12 мкл образца белка, обработанного DG, или 5 мкл образца белка, обработанного DDM, в гель BN-PAGE. Отрегулируйте объем загрузки, чтобы убедиться, что интенсивность контроля нагрузки, такой как белок митохондриального матрикса Mcp60 (Hsp60), одинакова среди всех образцов после^{окончательного воздействия.}
3. Запустите гель при постоянном напряжении/токе 80 В/6 мА в течение примерно 30 минут, используя катодный буфер с 0,02% (по массе) Coomassie G-250. Затем замените синий катодный буфер на катодный буфер без Coomassie G-250 и продолжайте работать с постоянным током 10 мА в течение примерно 3 часов, пока фронт синего красителя Coomassie G-250 не достигнет гелевого дна.
   1. Чтобы предотвратить деградацию или разборку комплексов митохондриальной дыхательной цепи, запустите гель с предварительно охлажденными буферами при температуре 4 °C. Для сборного геля используйте сборный рабочий буфер. Для изготовления геля ручной работы используйте 1x анодный рабочий буфер BN-PAGE (50 мМ Bis-Tris, pH 7,0, отрегулированный с помощью HCl) и 1x катодный рабочий буфер BN-PAGE (15 мМ Bis-Tris, pH 7,0, отрегулированный HCl; 50 мМ трицин).
4. Разрежьте гелевую дорожку, загруженную белковым маркером. Закрасьте маркер буфером Coomassie R-250 на 15 минут. Удаляйте пятна, пока маркер не станет виден.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высокомолекулярный белковый маркер для нативного PAGE не окрашивается заранее. Он будет виден после окрашивания Coomassie R-250.
5. Погрузите другую часть геля в буфер для переноса 1x BN-PAGE (Таблица 7) для балансировки на 30 минут. Промойте мембрану из PVDF того же размера 0,45 мкм со 100% метанолом и погрузите ее в буфер BN-PAGE для балансировки на 10 минут. Перенесите белки в геле на мембрану из PVDF размером 0,45 мкм под постоянным током 300 мА в течение 2 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана из нитроцеллюлозы (НЦ) не рекомендуется, так как мембрана НЦ очень плотно связывает краситель Coomassie G-250.
6. Промойте мембрану PVDF со 100% метанолом, чтобы смыть синий краситель Coomassie G-250. Инкубируйте мембрану PVDF в блокирующем буфере на основе 1x TBS (50 мМ Tris, pH 8,0, скорректированный с HCl; 150 мМ NaCl) буфере, содержащем 5% (w/v) обезжиренного молока, в течение 1 ч при 25 °C.
7. Инкубировать мембрану PVDF с указанными первичными антителами против комплексов митохондриальной дыхательной цепи S. pombe в течение ночи при 4 °C.
   Примечание: Концентрация антител Cob1 для обнаружения комплекса III составляет 1:1000. Концентрация антитела Cox1 для выявления комплекса IV составляет 1:2000. Концентрация антитела Atp6 для выявления комплекса V составляет 1:200.
8. Промойте мембрану из ПВДФ 1x буфером TBST (Таблица 8). Инкубируют мембрану PVDF с вторичным антителом в концентрации 1:10000 в течение 1 ч при 25 °С.
9. Промойте мембрану из ПВДФ 1x буфером TBST. Обнажите и отсканируйте мембрану из ПВДФ. Совместите экспонированное изображение геля BN-PAGE с изображением маркера нативного белка, чтобы оценить молекулярную массу комплексов и суперкомплексов митохондриальной дыхательной цепи.

Ранее мы использовали этот протокол для изучения влияния делеции shy1, гомолога S. pombe SURF1 человека, на экспрессию белков дыхательной цепи, кодируемых мтДНК, и сборку комплексов митохондриальных дыхательных цепей. Мы обнаружили, что равновесные уровни Cob1, Co...

В этом исследовании мы представляем подробный протокол выделения митохондрий S. pombe и выполнения SDS-PAGE и BN-PAGE для анализа экспрессии и сборки комплексов белков митохондриальной дыхательной цепи.

Ко-иммунопреципитация (ко-IP) обычно используется для ?...

У нас нет конфликта интересов.

Мы благодарим доктора Ин Хуана и доктора Ин Ло за их поддержку. Эта работа была поддержана грантами (32270048 J. S. и 31900403 G. F.) от Национального фонда естественных наук Китая.