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요약

분열 효모인 Schizosaccharomyces pombe 는 미토콘드리아를 연구하기 위한 매력적인 모델로 부상하고 있습니다. 여기에서는 S. pombe에서 미토콘드리아 호흡 복합체의 풍부함과 조립을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이를 통해 미토콘드리아 호흡 사슬에서 보존된 유전자의 새로운 기능을 특성화할 수 있습니다.

초록

미토콘드리아 호흡 사슬은 세포 에너지 대사에 매우 중요하며 산화적 인산화의 핵심 역할을 합니다. 미토콘드리아 호흡 사슬은 5개의 효소 복합체와 이들이 상호 작용하는 상부 복합체로 구성됩니다. 이러한 단백질의 발현 및 복합체 조립을 분석하는 것은 미토콘드리아 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 이는 미토콘드리아 생물학 연구를 위해 신진 효모에 보상 시스템을 제공하는 우수한 모델 유기체 핵분열 효모 Schizosaccharomyces pombe (S. pombe)에서 생화학적 및 유전적 방법을 결합하여 연구할 수 있습니다. 여기에서는 S. pombe 미토콘드리아의 분리와 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 블루 네이티브-페이지(BN-PAGE)에 의한 미토콘드리아 호흡 단백질의 발현 수준 및 복합체 조립을 분석하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 간단히 말해서, 야생형 및 유전자 돌연변이의 미토콘드리아를 정제한 다음 그 복합체를 용해하고 SDS-PAGE/BN-PAGE 및 면역 블로팅을 수행합니다. 이 방법을 사용하면 미토콘드리아 호흡 사슬에서 유전자의 새로운 기능을 특성화할 수 있습니다.

서문

미토콘드리아는 에너지를 위한 세포 호흡, 영양 대사, 세포 사멸 등 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다1. 미토콘드리아의 기능 부전은 뇌, 근육 및 발달 질환과 관련이 있습니다 2,3. 따라서 미토콘드리아에 대한 연구는 인간의 노화와 건강을 개선하는 데 필수적입니다.

신진 효모 Saccharomyces cerevisiae(S. cerevisiae)는 호흡에 결함이 있는 효모 돌연변이가 여전히 발효를 통해 생존을 위한 에너지를 생산할 수 있기 때문에 미토콘드리아4의 유전자 기능을 연구하는 데 오랫동안 사용되어 왔습니다. 그러나 이 바이러스는 몸집이 작은 양성이며 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 없이 증식할 수 있습니다. 결과적으로, 미토콘드리아 유전자 발현에 결함이 있는 유전자 돌연변이는 종종 mtDNA를 잃게 되며, 이는 추가 연구를 복잡하게 만듭니다. 이와는 대조적으로, S. cerevisiae와 진화적으로 거리가 먼 핵분열 효모 Schizosaccharomyces pombe (S. pombe)는 생존을 위해 mtDNA가 필요한 쁘띠 음성 효모입니다. 더욱이, S. pombe의 mtDNA와 미토콘드리아 mRNA의 조직은 고등 진핵생물의 조직과 유사하다5. S. cerevisiae에는 6개의 필수 유전자가 있는 것에 비해 S. pombe에는 많은(96개의) 필수 유전자가 미토콘드리아 유전자 발현에 필요합니다6. 따라서 S. pombe는 미토콘드리아에서 유전자의 새로운 기능을 연구하기 위한 매력적인 모델로 부상하고 있습니다. 그러나 S. cerevisiae의 미토콘드리아를 연구한 논문의 수는 S. pombe의 미토콘드리아보다 약 100배 더 많으며, S. pombe의 미토콘드리아를 연구하는 보고된 방법과 프로토콜도 부족하다7.

미토콘드리아 호흡 사슬은 세포 에너지 생산에 매우 중요하며 미토콘드리아8의 핵심 역할을 합니다. NADH-유비퀴논 산화환원효소(복합체 I), 숙시네이트 탈수소효소(복합체 II), 유비퀴논-사이토크롬 c 산화환원효소 또는 사이토크롬 bc1 복합체(복합체 III), 사이토크롬 c 산화효소(복합체 IV) 및 ATP 합성효소(복합체 V)와 같은 호흡기 사슬 복합체 I-V와 전자, 유비퀴논(CoQ) 및 사이토크롬 c(Cyt c)9를 운반하는 두 개의 중간 기질로 구성됩니다. 그들은 또한 상호 작용하여 고차원 초복합체를 형성하는데, 그 조립 메커니즘은 대체로 불분명합니다10,11. 그러나 S. pombe에는 외부 NADH 탈수소 효소 Nde1 및 내부 Ndi112 , 13 , 14 로 대체 될 수있는 복합체 I이 없습니다. S. pombe의 미토콘드리아 게놈은 복합체 III(Cob1)의 소단위, 복합체 IV의 3개 소단위(Cox1, Cox2, Cox3) 및 복합체 V의 3개 소단위(Atp6, Atp8, Atp9)를 암호화합니다15,16. 우리는 최근에 이러한 단백질의 발현 및 복합체 조립이 S. pombe에서 RNA helicase Mss116 (Δmss116)16 및 조립 인자 Shy1 (Δsh1)15의 결실에 의해 영향을 받는다고 보고했습니다. 이러한 방법을 사용하여 미토콘드리아 호흡 사슬에서 더 많은 유전자의 새로운 기능을 발견하는 것을 용이하게 하기 위해 여기에서는 S. pombe에서 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 복합체 조립에 대한 발현 수준의 SDS-PAGE(SDS-PAGE) 분석 및 파란색 native-PAGE(BN-PAGE) 분석을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

S. pombe에서 미토콘드리아를 분리하는 근거는 S. cerevisiae17에 확립된 방법을 기반으로 합니다. 스페로플라스트는 먼저 효모 세포벽을 소화하여 준비됩니다. 그들은 기계적으로 균질화되고 미토콘드리아는 차동 원심분리18에 의해 분획됩니다. 그 후, 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질은 SDS-PAGE 및 BN-PAGE에 따라 가용화되고 면역 블로트됩니다. BN-PAGE 기술은 원래 호흡 사슬 복합체 19,20,21과 같은 미토콘드리아 막 단백질의 분리를 위해 개발되었습니다. 온전한 복합체가 보존된 막 단백질은 약한 비이온성 세제에 의해 가용화되고 음이온 염료 Coomassie G-250에 의해 충전됩니다. 따라서, 단백질 복합체는 gradient native-PAGE gel22에서 질량에 따라 분리됩니다. 이 방법은 S. cerevisiae(23) 및 포유류 세포(24,25)에서 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체를 연구하는 데 널리 사용되었습니다. 그러나 S. pombe 미토콘드리아에는 광범위하게 적용되지 않았습니다.

총체적으로, 여기에서는 미토콘드리아를 S. pombe 세포에서 분리하고 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질에 SDS-PAGE 및 BN-PAGE를 투여한 후 면역 블로팅을 수행하는 방법을 제시합니다. 실험 순서도는 그림 1에 나와 있습니다. 고품질 미토콘드리아와 항체를 통해 S. pombe 에 기술된 이 방법은 다른 유기체에도 적용하여 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및/또는 복합체 조립에서 기능을 가진 더 많은 유전자를 식별할 수 있습니다.

프로토콜

1. S. pombe spheroplasts의 준비

  1. OD600 = 0.05에서 OD600 = 1.0까지 특정 균주(WT 또는 Δshy1)에 대한 보충제(YES) 매체(표 1)가 포함된 효모 추출물에서 1L의 S. pombe 세포를 성장시킵니다.
    참고: OD600을 가진 S. pombe 세포는 용해 효소에 의해 소화되어 스페로플라스트를 형성하기 어렵기 때문에 2.0 이상으로 성장하지 마십시오. 야생형(WT) 균주와 유전자 돌연변이 균주 모두 유사한 결과를 얻기 위해 병렬로 성장할 수 있습니다.
  2. 4°C에서 3,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 펠릿화된 세포를 500mL의 ddH2O 및 펠릿 세포에 4°C에서 3,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 재현탁합니다. 세포 1x 세척.
  3. 셀 펠릿의 습윤 중량을 측정합니다(1,000 OD600 셀의 경우 약 2g). 8mL의 1x S 완충액에 세포를 재현탁합니다(표 2, 4mL의 S 완충액/g 세포). 10mM에 디티오트레이톨(DTT)을 첨가하고 1mM에 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 새로 첨가합니다.
  4. 세포 현탁액에 용해 효소를 첨가하여 S. pombe의 세포벽을 소화합니다. 30°C의 셰이커에서 사용한 용해 효소에 따라 시간 동안 회전합니다.
    참고: 세포벽의 적절한 소화는 고품질 미토콘드리아를 분리하기 위한 중요한 단계입니다.
    1. 용해 효소의 경우 세포의 젖은 무게 g 당 100mg의 분말을 첨가하고 약 2 시간 동안 배양합니다. Lyticase의 경우 습식 중량 g 당 10mg의 분말을 추가하고 약 1 시간 동안 배양합니다. Zymolyase-20T/100T의 경우 습식 중량 g당 5mg/1mg의 분말을 추가하고 약 1시간 동안 배양합니다. Lallzyme MMX의 경우 습식 중량 g 당 분말 1g을 추가하고 약 0.5 시간 동안 배양합니다. Vinotaste 효소의 경우 습식 중량 g 당 분말 1g을 추가하고 약 2 시간 동안 배양합니다.
  5. 현미경으로 스페로플라스트의 형성을 관찰합니다(40x 대물렌즈). S 완충액에 20μL의 세포 현탁액을 넣고 1mL의 ddH2O에 추가하면 대부분의 세포가 파괴된 것을 확인할 수 있습니다(그림 2C).
    참고: 정상적인 S. pombe 세포는 막대 모양을 가지고 있습니다(그림 2A). S 완충액에 있는 스페로플라스트의 80% 이상은 효율적인 분해 후 둥글게 되어야 합니다(그림 2B).
  6. 펠렛 스페로플라스트는 4°C에서 1,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 분해합니다. 8mL의 얼음처럼 차가운 1x S 버퍼에 스페로플라스트를 재현탁시키고 2x 세척합니다. 절단 팁이 있는 피펫을 사용하여 스페로플라스트를 부드럽게 재현합니다.

2. S. pombe spheroplasts의 기계적 균질화

  1. 8 mL의 얼음처럼 차가운 1x 균질화 완충액(표 3; 4 mL의 균질화 완충액/g 세포)에 1x 프로테아제 억제제를 사용하여 spheroplast를 재현탁합니다. 세포를 미리 냉각된 유리 균질화기(유봉과 시험관이 있는 Dounce 조직 분쇄기)로 이동합니다.
  2. 꼭 맞는 유봉으로 위아래로 약 15번 스트로크하여 세포를 기계적으로 균질화합니다. 미토콘드리아 단백질이 분해되는 것을 방지하려면 뇌졸중 시 기포를 피하고 항상 균질화 완충액과 균질기를 얼음 위에서 배양하십시오.
    알림: 시험관에 단단히 고정되고 느슨한 유봉에는 두 가지 유형이 있습니다. 느슨한 유봉을 사용하는 경우 최대 25번의 스트로크가 필요할 수 있습니다. 너무 많은 스트로크는 미토콘드리아 막을 손상시킬 수 있고 너무 적은 스트로크는 미토콘드리아 수율을 감소시키기 때문에 스트로크 수를 최적화해야 합니다.
  3. 현미경(40x 대물렌즈)으로 스페로플라스트의 끊어진 세포막을 확인합니다.
    참고: 대부분의 스페로플라스트는 굴절 모양을 잃고 균질화 완충액에서 유령 세포가 됩니다. 미토콘드리아는 여전히 손상되지 않았습니다.

3. 원심분리에 의한 S. pombe 미토콘드리아의 분리

  1. 균질화된 현탁액을 원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리를 통해 깨지지 않은 세포와 파편을 펠릿화합니다.
  2. 생성된 상층액을 4°C에서 3,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 펠렛 핵을 만듭니다. 펠릿이 형성되지 않을 때까지 이 단계를 1x 반복합니다.
  3. 상층액을 새로운 원심분리 튜브와 펠릿 미토콘드리아 및 기타 오염된 소기관으로 15분 동안 원심분리하여 4°C에서 12,000 x g 로 옮깁니다.
  4. 상층액을 디캔트하고 펠렛을 얼음처럼 차가운 1x Sorbitol-EDTA-MOPS(SEM) 완충액 1mL에 재현탁합니다(표 4). 12,000 x g , 4°C에서 15분간 원심분리기를 하여 미토콘드리아를 세척합니다.
  5. 펠릿을 1mL의 얼음처럼 차가운 1x SEM 완충액에 재현탁시키고 향후 실험을 위해 미토콘드리아를 분취합니다.
    참고: 이 펠릿에는 미토콘드리아가 조잡하게 함유되어 있습니다. 나중에 SDS-PAGE 및 BN-PAGE 실험을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 미처리 미토콘드리아는 다른 실험 목적을 위해 자당 밀도 구배 초 원심 분리로 정제 할 수도 있습니다.

4. 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 SDS-PAGE 그리고 면역 블로팅

  1. 미토콘드리아 현탁액을 약 25배 희석하여 BCA 단백질 정량화 키트를 사용하여 미토콘드리아 분취액의 총 단백질 농도를 측정합니다.
  2. SDS-PAGE 로딩 버퍼를 40μL의 미토콘드리아 총 단백질에 추가합니다. 적절한 온도에서 표시된 시간 동안 배양하여 단백질을 변성시킵니다.
    1. S. pombe Cox1, Cox3, Cob1 및 Atp6를 검출하려면 45°C에서 3분 동안 미토콘드리아 단백질을 변성시킵니다. S. pombe Cox2 및 Hsp60을 검출하려면 90°C에서 5분 동안 미토콘드리아 단백질을 변성시킵니다.
  3. 약 20μg(약 4μL)의 미토콘드리아 단백질을 12% SDS-PAGE 겔에 로드합니다. 6,15단계에서 설명한 대로 적절한 항체를 사용하여 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 면역 블로팅을 수행합니다.
    참고: S. pombe Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 및 Atp6 단백질은 mtDNA에 의해 암호화되며, 이는 S. pombe에서도 공통 항원결정기로 태그하는 것과 같이 편집하기 어렵습니다. 따라서 이러한 단백질을 검출하기 위해서는 특정 항체가 필요합니다. 분리된 미토콘드리아의 순도와 무결성을 확인하기 위해 이러한 호흡 사슬 단백질을 세포질 단백질과 핵 단백질을 포함해야 하는 상층액에서 동시에 테스트할 수 있습니다. 반대로, 액틴(actin) 및 히스톤 H3(histone H3)와 같은 대표적인 세포질 및 핵 단백질은 미토콘드리아 샘플에서 테스트할 수 있습니다.

5. BN-PAGE를 위한 미토콘드리아 시료 준비

  1. 3.5단계에서 이전 부분 표본의 미토콘드리아를 4°C에서 12,000 x g 에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. BN-PAGE 분석을 위해 2mg의 미토콘드리아 단백질(약 400μL의 미토콘드리아 분취량)을 사용합니다.
  2. 200μL의 3x BN-PAGE 겔 버퍼(1.5M 6-아미노카프로이스산, 150mM Bis-Tris, pH 7.0, HCl로 조정)에 미토콘드리아를 재현탁시킵니다. 2μL의 100x PMSF와 1μL의 1M MgCl2를 추가합니다. 현탁액을 4°C에서 12,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
  3. 160μL의 5%(w/v) 디지토닌(DG) 또는 64μL의 5%(w/v) n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside(DDM)에 미토콘드리아 펠릿을 재현탁합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 10분마다 부드럽게 섞어줍니다.
    1. S. pombe에 대한 첫 번째 시험의 경우, 미토콘드리아 단백질 mg당 4mg의 DG 세제를 첨가하여 미토콘드리아 막을 용해시켜 호흡 사슬 슈퍼콤플렉스를 유지합니다. 미토콘드리아 단백질 mg당 1.6mg DDM 세제를 첨가하여 개별 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체를 분리합니다. BN-PAGE에서 서로 다른 단백질 복합체의 초기 결과에 따라 2배를 늘리거나 줄여 DG 및 DDM 처리의 농도를 조정합니다.
  4. 현탁액을 4°C에서 20,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 옮기고 BCA 정량화 키트로 가용화된 단백질 농도를 측정합니다.
  5. 약 160 μL의 DG 처리된 상등액에 80 μL(1/2 세제 용량)의 3x BN-PAGE 샘플 버퍼(표 5)를 첨가하거나 약 64 μL의 DDM 처리된 상등액에 3x BN-PAGE 샘플 버퍼의 32 μL(1/2 세제 부피)를 추가합니다.
    참고: SDS-PAGE와 달리 BN-PAGE의 단백질 샘플은 끓여서 변성시킬 수 없습니다.

6. 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 BN-PAGE 및 면역 블로팅

  1. 프리캐스트 네이티브 Bis-Tris 겔(3%-12% 구배)을 조립합니다. 또는 그래디언트 믹서에서 3% 및 12% BN-PAGE 겔(표 6)을 혼합하여 수제 기본 Bis-Tris 겔(3%-12% 구배)을 준비합니다.
  2. DG 또는 DDM 처리된 단백질 샘플과 네이티브 PAGE에 대한 고분자량 단백질 마커를 로드합니다.
    1. 총 100μg의 가용화된 미토콘드리아 단백질은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 BN-PAGE 분석에 필요합니다. 약 12μL의 DG 처리된 단백질 샘플 또는 5μL의 DDM 처리된 단백질 샘플을 BN-PAGE 겔에 로드합니다. 미토콘드리아 기질 단백질 Mcp60 (Hsp60)과 같은 로딩 제어의 강도가 최종 노출15 후 모든 샘플에서 동일한지 확인하기 위해 로딩 볼륨을 조정하십시오.
  3. 80%(w/v) Coomassie G-250이 있는 음극 버퍼를 사용하여 약 30분 동안 80V/6mA의 정전압/전류에서 젤을 실행합니다. 그 후, 청색 음극 완충액을 Coomassie G-250이 없는 음극 완충액으로 교체하고 Coomassie G-250 청색 염료 전면이 겔 바닥에 도달할 때까지 약 3시간 동안 10mA의 정전류로 계속 작동합니다.
    1. 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체가 분해되거나 분해되는 것을 방지하려면 4°C에서 미리 냉각된 완충액으로 겔을 실행합니다. 프리캐스트 젤의 경우 프리캐스트 러닝 버퍼를 사용합니다. 수제 젤의 경우 1x BN-PAGE 양극 실행 버퍼(50mM Bis-Tris, pH 7.0, HCl로 조정) 및 1x BN-PAGE 음극 실행 버퍼(15mM Bis-Tris, pH 7.0, HCl로 조정, 50mM Tricine)를 사용합니다.
  4. 단백질 마커가 로드된 젤 레인을 자릅니다. Coomassie R-250 버퍼로 마커를 15분 동안 염색합니다. 마커가 보일 때까지 stain을 제거합니다.
    참고: native PAGE에 대한 고분자량 단백질 마커는 사전 염색되지 않았습니다. Coomassie R-250으로 염색한 후 볼 수 있습니다.
  5. 젤의 다른 부분을 1x BN-PAGE 전송 버퍼(표 7)에 담그고 30분 동안 균형을 맞춥니다. 동일한 크기의 0.45μm PVDF 블롯 멤브레인을 100% 메탄올로 헹구고 BN-PAGE 전달 버퍼에 담궈 10분 동안 밸런싱합니다. 겔의 단백질을 2시간 동안 300mA의 정전류로 0.45μm PVDF 블롯 멤브레인으로 전달합니다.
    참고: 니트로셀룰로오스(NC) 멤브레인은 Coomassie G-250 염료를 매우 단단히 결합하기 때문에 권장되지 않습니다.
  6. PVDF 멤브레인을 100% 메탄올로 헹구어 Coomassie G-250 파란색 염료를 씻어냅니다. 5%(w/v) 탈지유를 함유한 1x TBS(50mM Tris, pH 8.0, HCl로 조정, 150mM NaCl) 기반 차단 버퍼에 PVDF 멤브레인을 25°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  7. S. pombe 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체에 대한 표시된 1차 항체와 함께 PVDF 멤브레인을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    참고: 복합체 III을 검출하기 위한 Cob1 항체의 농도는 1:1,000입니다. complex IV를 검출하기 위한 Cox1 항체의 농도는 1:2,000입니다. 복합체 V를 검출하기 위한 Atp6 항체의 농도는 1:200입니다.
  8. PVDF 멤브레인을 1x TBST 버퍼로 세척합니다(표 8). PVDF 멤브레인을 25°C에서 1시간 동안 1:10,000의 농도로 2차 항체와 함께 배양합니다.
  9. PVDF 멤브레인을 1x TBST 버퍼로 세척합니다. PVDF 멤브레인을 노출시키고 스캔합니다. BN-PAGE 겔의 노출된 이미지를 네이티브 단백질 마커의 이미지와 정렬하여 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 및 상부 복합체의 분자량을 추정합니다.

결과

우리는 이전에 이 프로토콜을 사용하여 mtDNA로 인코딩된 호흡 사슬 단백질의 발현과 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 조립에 대한 인간 SURF1의 S. pombe 상동체인 shy1의 결실의 영향을 조사했습니다. 우리는 Δshy1 균주에서 Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 및 Atp6의 정상 상태 수준이 현저히 감소했음을 발견했으며(그림 3), 이는 Shy1이 mtDNA에...

토론

본 연구에서는 S. pombe 미토콘드리아를 분리하고 SDS-PAGE 및 BN-PAGE를 수행하여 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및 복합체 조립을 분석하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

Co-IP(Co-Immunoprecipitation)는 단백질 복합체의 조립을 감지하는 데 일반적으로 사용되었습니다. 그러나 co-IP가 미토콘드리아 막 단백질의 조립을 감지하는 것은 어렵?...

공개

우리는 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

Ying Huang 박사님과 Ying Luo 박사님의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China)의 보조금(32270048은 J. S.에게, 31900403은 G. F.에게)의 지원을 받았다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
6-Aminocaproice acidSangonA430196
Acrylamide/Bis (37.5: 1) 40% BiolabGS1374
Ammonium persulfateSangonA100486
Anti-Atp6 antibodyBioworldin-houseIB: 1:200
Anti-Cob1 antibodyBioworldin-houseIB: 1:1000
Anti-Cox1 antibodyBioworldin-houseIB: 1:2000
Anti-Cox2 antibodyBioworldin-houseIB: 1:1000
Anti-Cox3 antibodyBioworldin-houseIB: 1:200
Anti-Hsp60 antibodyBioworldin-houseIB: 1:3000
BCA Protein Quantification KitLEAGENEPT0001
Bis-TrisYEASEN60105ES25
Coomassie Brilliant Blue G-250SERVA17524.01
Coomassie Brilliant Blue R-250SangonA100472
DigitoninSigmaD141
D-SorbitolSangonA100691
EDTASolarbioE8030
Gradient mixerMillet scientificMGM-50
HEPESSolarbioH8090
High molecular weight protein marker for native PAGEReal TimesRTD6142
IgG-Alexa Fluor Plus 800 (anti-rabbit secondary antibody)Thermo FisherA32735IB: 1:10000
Immobilon-FL 0.45 μm PVDF membraneMilliporeIPFL00005
Kimble Kontes Dounce tissue grinderThermo FisherK8853000015
KOHSangonA610441
Lallzyme MMXLallemandN.A.
Lysing enzymeSigmaL3768
LyticaseSigmaL4025
MgCl2SangonA601336
MOPSSangonA421333
Native Bis-Tris Gels (precast)SolarbioPG41510-N
PMSFSangonA610425
Precast Gel Running buffer for Native-PAGESolarbioPG00020-N
Protease inhibitor cocktail for yeast extractsBeyotimeP1020
SucroseSangonA610498 
TEMEDSigmaT9281
TricineSigmaT0377
Tween-20SolarbioT8220
VinotasteNovozymesN.A.
ZymolyaseMP Biomedicals320921

참고문헌

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