Análise da Expressão e Montagem de Complexos das Proteínas da Cadeia Respiratória Mitocondrial na Levedura de Fissão Schizosaccharomyces pombe

A levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe está emergindo como um modelo atraente para o estudo de mitocôndrias. Aqui, descrevemos um protocolo para analisar a abundância e montagem dos complexos respiratórios mitocondriais em S. pombe. Isso permite a caracterização das novas funções dos genes conservados na cadeia respiratória mitocondrial.

A cadeia respiratória mitocondrial é crucial para o metabolismo energético celular, servindo como o núcleo da fosforilação oxidativa. A cadeia respiratória mitocondrial compreende cinco complexos enzimáticos e seus supercomplexos que interagem. A análise da expressão e montagem de complexos dessas proteínas é vital para a compreensão da função mitocondrial. Isso pode ser estudado combinando métodos bioquímicos e genéticos em uma excelente levedura de fissão de organismo modelo Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), que fornece um sistema compensatório à levedura em brotamento para estudos de biologia mitocondrial. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento das mitocôndrias de S. pombe e análise dos níveis de expressão e montagem de complexos das proteínas respiratórias mitocondriais por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e nativo-PAGE AZUL (BN-PAGE). Resumidamente, as mitocôndrias do tipo selvagem e mutantes do gene são purificadas e, em seguida, seus complexos são solubilizados e submetidos a SDS-PAGE / BN-PAGE e immunoblotting. Este método permite a caracterização da nova função de um gene na cadeia respiratória mitocondrial.

As mitocôndrias desempenham papéis importantes em diversos processos biológicos, como respiração celular para energia, metabolismo nutricional e morte celular¹. O mau funcionamento das mitocôndrias está relacionado a doenças cerebrais, musculares e de desenvolvimento ^2,3. Portanto, estudos sobre mitocôndrias são vitais para melhorar o envelhecimento e a saúde humana.

A levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) tem sido usada há muito tempo para estudar as funções dos genes nas mitocôndrias⁴ porque os mutantes de levedura defeituosos na respiração ainda podem produzir energia para a sobrevivência por fermentação. No entanto, é petite-positivo e pode proliferar sem DNA mitocondrial (mtDNA). Consequentemente, os mutantes genéticos defeituosos na expressão gênica mitocondrial geralmente perdem seu mtDNA, o que complica um estudo mais aprofundado. Em contraste, a levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), que está evolutivamente distante de S. cerevisiae, é uma levedura pequeno-negativa que requer mtDNA para sobreviver. Além disso, a organização do mtDNA e do mRNA mitocondrial de S. pombe é semelhante à dos eucariotos superiores⁵. Muitos (96) genes essenciais em S. pombe, em comparação com apenas seis genes essenciais em S. cerevisiae, são necessários para a expressão gênica mitocondrial⁶. Assim, S. pombe está emergindo como um modelo atraente para estudar novas funções de genes nas mitocôndrias. No entanto, o número de publicações que estudam mitocôndrias em S. cerevisiae é cerca de 100 vezes maior do que em S. pombe, e os métodos e protocolos relatados que estudam mitocôndrias em S. pombe também são escassos⁷.

A cadeia respiratória mitocondrial é crucial para a produção de energia celular e serve como um núcleo das mitocôndrias⁸. Compreende os complexos da cadeia respiratória I-V, como NADH-ubiquinona oxidorredutase (Complexo I), succinato desidrogenase (Complexo II), ubiquinona-citocromo c oxidorredutase ou complexo citocromo bc1 (Complexo III), citocromo c oxidase (Complexo IV) e ATP sintase (Complexo V), juntamente com dois substratos intermediários que transportam elétrons, ubiquinona (CoQ) e citocromo c (Cyt c)⁹. Eles também interagem e formam supercomplexos de ordem superior, cujos mecanismos de montagem permanecem pouco claros^10,11. No entanto, S. pombe carece do complexo I, que pode ser substituído por NADH desidrogenases externas Nde1 e Ndi1 interno 12,13,14. O genoma mitocondrial em S. pombe codifica uma subunidade do complexo III (Cob1), três subunidades do complexo IV (Cox1, Cox2, Cox3) e três subunidades do complexo V (Atp6, Atp8, Atp9) ^{15 , 16} . Recentemente, relatamos que a expressão e a montagem de complexos dessas proteínas são afetadas pela deleção de RNA helicase Mss116 (Δmss116)¹⁶ e fator de montagem Shy1 (Δshy1)¹⁵ em S. pombe, respectivamente. Para facilitar a descoberta de mais novas funções de genes na cadeia respiratória mitocondrial usando esses métodos, aqui fornecemos um protocolo detalhado para análise de eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) dos níveis de expressão e análise de PAGE nativo azul (BN-PAGE) da montagem de complexos das proteínas da cadeia respiratória mitocondrial em S. pombe.

A lógica por trás do isolamento das mitocôndrias de S. pombe é baseada nos métodos estabelecidos em S. cerevisiae¹⁷. Os esferoplastos são primeiro preparados pela digestão das paredes celulares da levedura. Eles são homogeneizados mecanicamente e as mitocôndrias são fracionadas por centrifugação diferencial¹⁸. Posteriormente, as proteínas da cadeia respiratória mitocondrial são solubilizadas e imunoblotadas seguindo SDS-PAGE e BN-PAGE. A técnica BN-PAGE foi originalmente desenvolvida para a separação de proteínas da membrana mitocondrial, como complexos de cadeias respiratórias 19,20,21. As proteínas de membrana com complexos intactos preservados são solubilizadas por detergentes não iônicos suaves e carregadas pelo corante aniônico Coomassie G-250. Assim, os complexos proteicos são separados de acordo com sua massa em um gel nativo de gradiente²². Este método tem sido amplamente utilizado para estudar complexos da cadeia respiratória mitocondrial em S. cerevisiae²³ e células de mamíferos^24,25; no entanto, não foi amplamente aplicado às mitocôndrias de S. pombe.

Coletivamente, apresentamos aqui um método no qual as mitocôndrias são isoladas de células de S. pombe , e as proteínas da cadeia respiratória mitocondrial são submetidas a SDS-PAGE e BN-PAGE seguidas de immunoblotting. O fluxograma experimental é ilustrado na Figura 1. Com mitocôndrias e anticorpos de alta qualidade, este método descrito em S. pombe também pode ser aplicado a outros organismos para identificar mais genes com funções na expressão e/ou complexa a montagem de proteínas da cadeia respiratória mitocondrial.

1. Preparação de esferoplastos de S. pombe

1. Cultive 1 L de células de S. pombe no meio de Extrato de Levedura com Suplementos (YES) (Tabela 1) para uma cepa específica (WT ou Δshy1) de OD₆₀₀ = 0,05 a OD₆₀₀ = 1,0.
   NOTA: Não cultive as células de S. pombe com OD₆₀₀ superior a 2,0, pois são difíceis de digerir por enzimas líticas para formar esferoplastos. Tanto as cepas de tipo selvagem (WT) quanto as de genes mutantes podem ser cultivadas em paralelo para obter resultados comparáveis.
2. Colha células por centrifugação por 5 min a 3.000 x g a 4 °C. Ressuspenda as células peletizadas em 500 mL de ddH₂O e as células granuladas por centrifugação por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C. Lave as células 1x.
3. Meça o peso úmido do pellet celular (cerca de 2 g para 1.000 células OD₆₀₀ ). Ressuspenda as células em 8 mL de tampão 1x S (Tabela 2; 4 mL de tampão S / g células). Adicione ditiotreitol (DTT) a 10 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) a 1 mM recentemente.
4. Adicione enzimas líticas à suspensão celular para digerir a parede celular de S. pombe. Girar num agitador a 30 °C durante o tempo, dependendo da enzima lítica utilizada.
   NOTA: A digestão adequada da parede celular é uma etapa crucial para isolar mitocôndrias de alta qualidade.
   1. Para a enzima de lisagem, adicionar 100 mg de pó por g de peso húmido das células e incubar durante cerca de 2 h. Para a Lyticase, adicione 10 mg de pó por g de peso húmido e incube durante cerca de 1 h. Para a Zymolyase-20T / 100T, adicione 5 mg / 1 mg de pó por g de peso úmido e incube por cerca de 1 h. Para o Lallzyme MMX, adicione 1 g de pó por g de peso úmido e incube por cerca de 0,5 h. Para a enzima Vinotaste, adicione 1 g de pó por g de peso úmido e incube por cerca de 2 h.
5. Observe a formação de esferoplastos por microscopia (objetiva de 40x). Pegue 20 μL de suspensão celular em tampão S e adicione a 1 mL de ddH₂O, veja que a maioria das células está quebrada ( Figura 2C ).
   NOTA: As células normais de S. pombe têm formas de bastonetes (Figura 2A). Mais de 80% dos esferoplastos no tampão S, após digestão eficiente, devem se tornar redondos (Figura 2B).
6. Esferoplastos de pellets por centrifugação por 10 min a 1.000 x g a 4 °C. Ressuspenda os esferoplastos em 8 mL de tampão S 1x gelado e lave 2x. Ressuspenda os esferoplastos suavemente usando pipetas com pontas cortadas.

2. Homogeneização mecânica de esferoplastos de S. pombe

1. Ressuspenda os esferoplastos em 8 mL de tampão de homogeneização 1x gelado (Tabela 3; 4 mL de tampão de homogeneização/g células) com inibidores de protease 1x. Transfira as células para um homogeneizador de vidro pré-resfriado (moedor de lenços Dounce com um pilão e um tubo de ensaio).
2. Homogeneizar as células mecanicamente fazendo aproximadamente 15 golpes para cima e para baixo com o pilão bem ajustado. Para evitar a degradação das proteínas mitocondriais, evite bolhas durante os derrames e sempre incube o tampão de homogeneização e o homogeneizador no gelo.
   NOTA: Existem dois tipos de pilões com encaixe apertado e solto no tubo de ensaio. Se um pilão solto for usado, podem ser necessários até 25 golpes. O número de derrames deve ser otimizado porque muitos derrames podem danificar as membranas mitocondriais e poucos derrames reduzem o rendimento mitocondrial.
3. Verifique a membrana celular quebrada em esferoplastos com um microscópio (objetiva de 40x).
   NOTA: A maioria dos esferoplastos perde a forma refrativa e se torna células fantasmas em um tampão de homogeneização. As mitocôndrias ainda estão intactas.

3. Isolamento das mitocôndrias de S. pombe por centrifugação

1. Transferir a suspensão homogeneizada para tubos de centrífuga e células intactas e detritos por centrifugação durante 5 min a 1.000 x g a 4 °C.
2. Centrifugue o sobrenadante resultante por 5 min a 3.000 x g a 4 ° C e núcleos de pellets. Repita esta etapa 1x até que não haja formação de pellets.
3. Transferir o sobrenadante para novos tubos de centrifugação e sedimentar mitocôndrias e outras organelas contaminadas por centrifugação durante 15 min a 12.000 x g a 4 °C.
4. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 mL de tampão gelado 1x Sorbitol-EDTA-MOPS (SEM) (Tabela 4). Centrifugue por 15 min a 12.000 x g a 4 ° C para lavar as mitocôndrias.
5. Ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão SEM 1x gelado e alíquota das mitocôndrias para experimentos futuros.
   NOTA: Este pellet contém mitocôndrias brutas. Ele pode ser armazenado a -80 °C para experimentos SDS-PAGE e BN-PAGE posteriormente. As mitocôndrias brutas também podem ser purificadas por ultracentrifugação com gradiente de densidade de sacarose para outros fins experimentais.

4. SDS-PAGE e immunoblotting de proteínas da cadeia respiratória mitocondrial

1. Meça a concentração total de proteínas de uma alíquota mitocondrial usando um kit de quantificação de proteínas BCA, diluindo a suspensão mitocondrial cerca de 25 vezes.
2. Adicione o tampão de carregamento SDS-PAGE em 40 μL de proteínas totais mitocondriais. Desnature as proteínas incubando pelo tempo indicado na temperatura adequada.
   1. Para detectar S. pombe Cox1, Cox3, Cob1 e Atp6, desnature as proteínas mitocondriais a 45 ° C por 3 min. Para detectar S. pombe Cox2 e Hsp60, desnature as proteínas mitocondriais a 90 ° C por 5 min.
3. Carregue cerca de 20 μg (aproximadamente 4 μL) de proteínas mitocondriais no gel SDS-PAGE a 12%. Realize o immunoblotting das proteínas da cadeia respiratória mitocondrial com anticorpos apropriados, conforme descrito na etapa 6¹⁵.
   NOTA: As proteínas S. pombe Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 e Atp6 são codificadas pelo mtDNA, o que é difícil de editar como a marcação com um epítopo comum, mesmo em S. pombe. Assim, anticorpos específicos são necessários para detectar essas proteínas. Para verificar a pureza e integridade das mitocôndrias isoladas, essas proteínas da cadeia respiratória podem ser testadas simultaneamente no sobrenadante, que deve conter proteínas citoplasmáticas e nucleares. Por outro lado, as proteínas citoplasmáticas e nucleares representativas, como actina e histona H3, podem ser testadas na amostra de mitocôndrias.

5. Preparação de amostras mitocondriais para BN-PAGE

1. Mitocôndrias de pellets de alíquotas anteriores na etapa 3.5 por centrifugação por 15 min a 12.000 x g a 4 ° C. Use 2 mg de proteínas mitocondriais (cerca de 400 μL de alíquotas mitocondriais) para análise BN-PAGE.
2. Ressuspenda as mitocôndrias em 200 μL de tampão gel 3x BN-PAGE (ácido 6-aminocapróice 1,5 M; Bis-Tris 150 mM, pH 7,0, ajustado com HCl). Adicione 2 μL de PMSF 100x e 1 μL de MgCl_{1 M 2}. Centrifugue a suspensão por 15 min a 12.000 x g a 4 °C.
3. Ressuspenda o pellet mitocondrial em 160 μL de digitonina (DG) a 5% (p / v) ou 64 μL de n-Dodecil-β-D-maltopiranosídeo (DDM) a 5% (p / v). Incube no gelo por 30 min com mistura suave a cada 10 min.
   1. Para os primeiros ensaios em S. pombe, adicione 4 mg de detergente DG por mg de proteínas mitocondriais para solubilizar as membranas mitocondriais para manter os supercomplexos da cadeia respiratória. Adicione 1,6 mg de detergente DDM por mg de proteínas mitocondriais para separar os complexos individuais da cadeia respiratória mitocondrial. Ajuste a concentração do tratamento com DG e DDM aumentando ou diminuindo 2 vezes de acordo com os resultados iniciais de diferentes complexos proteicos em BN-PAGE.
4. Centrifugue a suspensão durante 5 min a 20.000 x g a 4 °C. Transferir o sobrenadante e medir a concentração de proteínas solubilizadas com o kit de quantificação de BCA.
5. Adicione 80 μL (1/2 volume de detergente) de 3x tampão de amostra BN-PAGE (Tabela 5) a cerca de 160 μL de sobrenadante tratado com DG ou adicione 32 μL (1/2 volume de detergente) de 3x tampão de amostra BN-PAGE a cerca de 64 μL de sobrenadante tratado com DDM.
   NOTA: Ao contrário do SDS-PAGE, as amostras de proteína para BN-PAGE não podem ser desnaturadas por fervura.

6. BN-PAGE e immunoblotting de complexos da cadeia respiratória mitocondrial

1. Monte o gel nativo Bis-Tris pré-moldado (gradiente de 3% a 12%). Como alternativa, prepare o gel Bis-Tris nativo feito à mão (gradiente de 3% a 12%) misturando gel BN-PAGE de 3% e 12% (Tabela 6) em um misturador de gradiente.
2. Carregue amostras de proteína tratadas com DG ou DDM e o marcador de proteína de alto peso molecular para PAGE nativo.
   1. Um total de 100 μg de proteínas mitocondriais solubilizadas são necessárias para a análise BN-PAGE de complexos da cadeia respiratória mitocondrial. Carregue aproximadamente 12 μL de amostra de proteína tratada com DG ou 5 μL de amostra de proteína tratada com DDM no gel BN-PAGE. Ajuste o volume de carga para certificar-se de que as intensidades do controle de carga, como a proteína da matriz mitocondrial Mcp60 (Hsp60), sejam iguais entre todas as amostras após a exposição final¹⁵.
3. Execute o gel em uma tensão / corrente constante de 80 V / 6 mA por cerca de 30 min usando tampão catódico com 0,02% (p / v) Coomassie G-250. Posteriormente, substitua o tampão catódico azul por tampão catódico sem Coomassie G-250 e continue funcionando a uma corrente constante de 10 mA por cerca de 3 h até que a frente do corante azul Coomassie G-250 atinja o fundo do gel.
   1. Para evitar a degradação ou desmontagem dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial, execute o gel com tampões pré-resfriados a 4 ° C. Para o gel pré-moldado, use o buffer de execução pré-moldado. Para o gel artesanal, use o tampão de corrida de ânodo 1x BN-PAGE (50 mM Bis-Tris, pH 7,0, ajustado com HCl) e 1x tampão de corrida do cátodo BN-PAGE (15 mM Bis-Tris, pH 7,0, ajustado com HCl; 50 mM Tricina).
4. Corte a faixa de gel carregada com marcador de proteína. Pinte o marcador com tampão Coomassie R-250 por 15 min. Destain até que o marcador fique visível.
   NOTA: O marcador de proteína de alto peso molecular para PAGE nativo não é pré-corado. Será visível após a coloração com Coomassie R-250.
5. Mergulhe a outra parte do gel no tampão de transferência 1x BN-PAGE (Tabela 7) para balanceamento de 30 min. Enxágue a membrana de PVDF de 0,45 μm do mesmo tamanho com 100% de metanol e mergulhe-a no tampão de transferência BN-PAGE para balanceamento por 10 min. Transfira proteínas no gel para uma membrana de PVDF de 0,45 μm sob uma corrente constante de 300 mA por 2 h.
   NOTA: A membrana de nitrocelulose (NC) não é recomendada, pois a membrana NC liga o corante Coomassie G-250 com muita força.
6. Enxágue a membrana de PVDF com 100% de metanol para lavar o corante azul Coomassie G-250. Incubar a membrana de PVDF no tampão de bloqueio à base de 1x TBS (50 mM Tris, pH 8,0, ajustado com HCl; 150 mM NaCl) contendo 5% (p / v) de leite desnatado por 1 h a 25 ° C.
7. Incubar a membrana de PVDF com os anticorpos primários indicados contra os complexos da cadeia respiratória mitocondrial de S. pombe durante a noite a 4 °C.
   NOTA: A concentração de anticorpo Cob1 para detectar o complexo III é de 1: 1.000. A concentração de anticorpo Cox1 para detecção do complexo IV é de 1: 2.000. A concentração de anticorpo Atp6 para detectar o complexo V é de 1: 200.
8. Lave a membrana de PVDF com 1x tampão TBST (Tabela 8). Incubar a membrana de PVDF com o anticorpo secundário a uma concentração de 1:10.000 durante 1 h a 25 °C.
9. Lave a membrana de PVDF com 1x tampão TBST. Exponha e escaneie a membrana de PVDF. Alinhe a imagem exposta do gel BN-PAGE com a imagem do marcador de proteína nativa para estimar os pesos moleculares dos complexos e supercomplexos da cadeia respiratória mitocondrial.

Anteriormente, usamos este protocolo para investigar os efeitos da deleção de shy1, o homólogo de S. pombe de SURF1 humano, na expressão de proteínas da cadeia respiratória codificadas em mtDNA e na montagem de complexos da cadeia respiratória mitocondrial. Descobrimos que os níveis de estado estacionário de Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 e Atp6 foram significativamente reduzidos na cepa Δshy1 (Figura 3), indicando que S...

Neste estudo, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento de mitocôndrias de S. pombe e realização de SDS-PAGE e BN-PAGE para analisar a expressão e montagem de complexos de proteínas da cadeia respiratória mitocondrial.

A co-imunoprecipitação (co-IP) tem sido comumente usada para detectar a montagem de complexos proteicos; no entanto, é um desafio para o co-IP detectar a montagem de proteínas da membrana mitocondrial. Em vez disso, ...

Não temos conflitos de interesse.

Agradecemos ao Dr. Ying Huang e ao Dr. Ying Luo por seu apoio. Este trabalho foi apoiado por doações (32270048 para J. S. e 31900403 para G. F.) da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China.