Analyse der Expression und der Assemblierung der Komplexe der mitochondrialen Atmungskettenproteine in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Die Spalthefe Schizosaccharomyces pombe entwickelt sich zu einem attraktiven Modell für die Untersuchung von Mitochondrien. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Häufigkeit und des Aufbaus der mitochondrialen Atmungskomplexe in S. pombe. Dies ermöglicht die Charakterisierung der neuen Funktionen konservierter Gene in der mitochondrialen Atmungskette.

Die mitochondriale Atmungskette ist entscheidend für den zellulären Energiestoffwechsel und dient als Kern der oxidativen Phosphorylierung. Die mitochondriale Atmungskette besteht aus fünf Enzymkomplexen und ihren interagierenden Superkomplexen. Die Analyse der Expression und des Zusammenbaus der Komplexe dieser Proteine ist für das Verständnis der mitochondrialen Funktion von entscheidender Bedeutung. Dies kann durch die Kombination biochemischer und genetischer Methoden in einem hervorragenden Modellorganismus, der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), untersucht werden, die ein Kompensationssystem für knospende Hefe für Studien der mitochondrialen Biologie darstellt. In dieser Arbeit präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von S. pombe-Mitochondrien und die Analyse der Expressionsniveaus und Komplexassemblierung der mitochondrialen respiratorischen Proteine mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und blauer nativer PAGE (BN-PAGE). Kurz gesagt, Mitochondrien aus den Wildtyp- und Genmutanten werden gereinigt, und dann werden ihre Komplexe solubilisiert und SDS-PAGE/BN-PAGE und Immunblotting unterzogen. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung der neuen Funktion eines Gens in der mitochondrialen Atmungskette.

Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen, wie z. B. der Zellatmung zur Energiegewinnung, dem Nahrungsstoffwechsel und dem Zelltod¹. Die Fehlfunktion der Mitochondrien hängt mit Gehirn-, Muskel- und Entwicklungserkrankungen zusammen ^2,3. Daher sind Studien an Mitochondrien von entscheidender Bedeutung, um das Altern und die Gesundheit des Menschen zu verbessern.

Die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) wird seit langem verwendet, um die Funktionen von Genen in Mitochondrien^{zu untersuchen 4} , da Hefemutanten, die bei der Atmung defekt sind, durch Fermentation immer noch Energie für das Überleben produzieren können. Es ist jedoch petit-positiv und kann sich ohne mitochondriale DNA (mtDNA) vermehren. Infolgedessen verlieren die Genmutanten, die bei der mitochondrialen Genexpression defekt sind, häufig ihre mtDNA, was weitere Untersuchungen erschwert. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), die evolutionär von S. cerevisiae entfernt ist, um eine zierlich-negative Hefe, die mtDNA zum Überleben benötigt. Darüber hinaus ist die Organisation der mtDNA und der mitochondrialen mRNA von S. pombe ähnlich wie bei höheren Eukaryoten⁵. Viele (96) essentielle Gene in S. pombe, verglichen mit nur sechs essentiellen Genen in S. cerevisiae, sind für die mitochondriale Genexpression erforderlich⁶. Damit entwickelt sich S. pombe zu einem attraktiven Modell, um neue Funktionen von Genen in Mitochondrien zu untersuchen. Die Anzahl der Publikationen, die Mitochondrien bei S. cerevisiae untersuchen, ist jedoch etwa 100-mal höher als die bei S. pombe, und die berichteten Methoden und Protokolle zur Untersuchung der Mitochondrien bei S. pombe sind ebenfalls rar⁷.

Die mitochondriale Atmungskette ist entscheidend für die zelluläre Energieproduktion und dient als Kern der Mitochondrien⁸. Es umfasst Atmungskettenkomplexe I-V, wie NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (Komplex I), Succinatdehydrogenase (Komplex II), Ubichinon-Cytochrom-c-Oxidoreduktase oder Cytochrom-bc1-Komplex (Komplex III), Cytochrom-c-Oxidase (Komplex IV) und ATP-Synthase (Komplex V), zusammen mit zwei elektronentragenden Zwischensubstraten, Ubichinon (CoQ) und Cytochrom c (Cyt c)⁹ . Sie interagieren auch und bilden Superkomplexe höherer Ordnung, deren Aufbaumechanismen weitgehend unklar sind^10,11. S. pombe fehlt jedoch der Komplex I, der durch externe NADH-Dehydrogenasen Nde1 und interne Ndi1 ersetzt werden^{kann 12,13,14}. Das mitochondriale Genom in S. pombe kodiert für eine Untereinheit des Komplexes III (Cob1), drei Untereinheiten des Komplexes IV (Cox1, Cox2, Cox3) und drei Untereinheiten des Komplexes V (Atp6, Atp8, Atp9)^15,16. Wir haben kürzlich berichtet, dass die Expression und die Assemblierung der Komplexe dieser Proteine durch die Deletion der RNA-Helikase Mss116 (Δmss116)¹⁶ bzw. des Assemblierungsfaktors Shy1 (Δshy1)¹⁵ in S. pombe beeinflusst werden. Um die Entdeckung weiterer neuer Funktionen von Genen in der mitochondrialen Atmungskette mit diesen Methoden zu erleichtern, stellen wir hier ein detailliertes Protokoll für die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Analyse der Expressionsniveaus und die Blue Native-PAGE (BN-PAGE) Analyse der komplexen Assemblierung der mitochondrialen Atmungskettenproteine in S. pombe zur Verfügung.

Die Begründung für die Isolierung von Mitochondrien aus S. pombe basiert auf den in S. cerevisiae¹⁷ etablierten Methoden. Die Sphäroplasten werden zunächst durch Verdauung von Hefezellwänden hergestellt. Sie werden mechanisch homogenisiert, und die Mitochondrien werden durch Differenzialzentrifugation^{fraktioniert 18}. Anschließend werden die Proteine der mitochondrialen Atmungskette nach SDS-PAGE und BN-PAGE solubilisiert und immunblottiert. Die BN-PAGE-Technik wurde ursprünglich für die Trennung von mitochondrialen Membranproteinen wie Atmungskettenkomplexen^entwickelt 19,20,21. Die Membranproteine mit konservierten intakten Komplexen werden durch milde nichtionische Detergenzien solubilisiert und mit dem anionischen Farbstoff Coomassie G-250 aufgeladen. So werden Proteinkomplexe nach ihrer Masse in einem Gradienten-native-PAGE-Gel²² getrennt. Diese Methode wurde häufig zur Untersuchung mitochondrialer Atmungskettenkomplexe in S. cerevisiae²³ und Säugetierzellen^24,25 eingesetzt; es wurde jedoch nicht ausgiebig auf S. pombe-Mitochondrien angewendet.

Zusammenfassend stellen wir hier eine Methode vor, bei der Mitochondrien aus S. pombe-Zellen isoliert werden und die mitochondrialen Proteine der Atmungskette SDS-PAGE und BN-PAGE unterzogen werden, gefolgt von Immunblotting. Das experimentelle Flussdiagramm ist in Abbildung 1 dargestellt. Mit hochwertigen Mitochondrien und Antikörpern kann diese in S. pombe beschriebene Methode auch auf andere Organismen angewendet werden, um mehr Gene mit Funktionen in der Expression und/oder Komplexassemblierung von mitochondrialen Atmungskettenproteinen zu identifizieren.

1. Vorbereitung von S. pombe sphäroplasten

1. Züchten Sie 1 l S. pombe-Zellen im Hefeextrakt mit Nahrungsergänzungsmitteln (YES) (Tabelle 1) für einen bestimmten Stamm (WT oder Δshy1) von OD₆₀₀ = 0,05 bis OD₆₀₀ = 1,0.
   HINWEIS: Züchten Sie die S. pombe-Zellen nicht mit OD₆₀₀ mehr als 2,0, da sie von lytischen Enzymen schwer zu verdauen sind, um Sphäroplasten zu bilden. Sowohl Wildtyp- (WT) als auch Genmutantenstämme können parallel gezüchtet werden, um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen.
2. Ernte der Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3.000 x g bei 4 °C. Resuspendieren Sie pelletierte Zellen in 500 mL ddH₂O und Pelletzellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3.000 x g bei 4 °C. Waschen Sie die Zellen 1x.
3. Messen Sie das Nassgewicht des Zellpellets (ca. 2 g für 1.000 OD₆₀₀ Zellen). Resuspendieren Sie Zellen in 8 mL 1x S-Puffer (Tabelle 2; 4 mL S-Puffer/g Zellen). Dithiothreitol (DTT) auf 10 mM und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) auf 1 mM frisch zugeben.
4. Fügen Sie der Zellsuspension lytische Enzyme hinzu, um die Zellwand von S. pombe zu verdauen. In einem Shaker bei 30 °C für die Zeit drehen, die vom verwendeten lytischen Enzym abhängt.
   HINWEIS: Die richtige Verdauung der Zellwand ist ein entscheidender Schritt für die Isolierung hochwertiger Mitochondrien.
   1. Für das lysierende Enzym werden 100 mg Pulver pro g Nassgewicht der Zellen zugegeben und ca. 2 h inkubiert. Für das Lyticase 10 mg Pulver pro g Nassgewicht hinzufügen und ca. 1 h inkubieren. Für die Zymolyase-20T/100T 5 mg/1 mg Pulver pro g Nassgewicht zugeben und ca. 1 h inkubieren. Für den Lallzyme MMX 1 g Pulver pro g Nassgewicht zugeben und ca. 0,5 h inkubieren. Für das Vinotaste-Enzym 1 g Pulver pro g Nassgewicht hinzufügen und ca. 2 h inkubieren.
5. Beobachten Sie die Bildung von Sphäroplasten durch Mikroskopie (40x Objektiv). Nehmen Sie 20 μl Zellsuspension in S-Puffer und fügen Sie sie zu 1 ml ddH₂O hinzu, sehen Sie, dass die meisten Zellen zerbrochen sind (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Die normalen S. pombe-Zellen haben Stäbchenformen (Abbildung 2A). Mehr als 80 % der Sphäroplasten im S-Puffer sollten nach einem effizienten Aufschluss rund werden (Abbildung 2B).
6. Pellet-Sphäroplasten durch Zentrifugation für 10 min bei 1.000 x g bei 4 °C. Sphäroplasten in 8 mL eiskaltem 1x S Puffer resuspendieren und 2x waschen. Resuspendieren Sie die Sphäroplasten vorsichtig mit Pipetten mit abgeschnittenen Spitzen.

2. Mechanische Homogenisierung von S. pombe Sphäroplasten

1. Resuspendieren Sie Sphäroplasten in 8 mL eiskaltem 1x Homogenisierungspuffer (Tabelle 3; 4 mL Homogenisierungspuffer/g Zellen) mit 1x Proteaseinhibitoren. Übertragen Sie die Zellen in einen vorgekühlten Glashomogenisator (Dounce Gewebeschleifer mit einem Stößel und einem Reagenzglas).
2. Homogenisieren Sie die Zellen mechanisch, indem Sie mit dem eng anliegenden Stößel etwa 15 Striche auf und ab machen. Um den Abbau mitochondrialer Proteine zu verhindern, vermeiden Sie Blasen während der Hübe und inkubieren Sie den Homogenisierungspuffer und den Homogenisator immer auf Eis.
   HINWEIS: Es gibt zwei Arten von Stößeln, die fest und locker in das Reagenzglas passen. Wenn ein loser Stößel verwendet wird, können bis zu 25 Hübe erforderlich sein. Die Anzahl der Hübe sollte optimiert werden, da zu viele Hübe die Mitochondrienmembranen schädigen könnten und zu wenige Hübe die mitochondriale Ausbeute verringern.
3. Kontrollieren Sie die gebrochene Zellmembran bei Sphäroplasten mit einem Mikroskop (40x Objektiv).
   HINWEIS: Die meisten Sphäroplasten verlieren ihre refraktive Form und werden in einem Homogenisierungspuffer zu Geisterzellen. Die Mitochondrien sind noch intakt.

3. Isolierung von S. pombe-Mitochondrien durch Zentrifugation

1. Die homogenisierte Suspension in Zentrifugenröhrchen überführen und unbeschädigte Zellen und Rückstände durch Zentrifugation für 5 min bei 1.000 x g bei 4 °C granulieren.
2. Der resultierende Überstand wird 5 min lang bei 3.000 x g bei 4 °C zentrifugiert und die Kerne werden zerkleinert. Wiederholen Sie diesen Schritt 1x, bis sich keine Pelletbildung mehr bildet.
3. Der Überstand wird durch Zentrifugation für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C auf neue Zentrifugenröhrchen und Pellet-Mitochondrien und andere kontaminierte Organellen übertragen.
4. Überstand dekantieren und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml eiskaltem 1x Sorbitol-EDTA-MOPS (REM)-Puffer (Tabelle 4). 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugieren, um die Mitochondrien zu waschen.
5. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL eiskaltem 1x REM-Puffer und aliquotieren Sie die Mitochondrien für zukünftige Experimente.
   HINWEIS: Dieses Pellet enthält rohe Mitochondrien. Er kann bei -80 °C für spätere SDS-PAGE- und BN-PAGE-Experimente gelagert werden. Die rohen Mitochondrien können auch durch Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation für andere experimentelle Zwecke gereinigt werden.

4. SDS-PAGE und Immunblotting von Proteinen der mitochondrialen Atmungskette

1. Messen Sie die Gesamtproteinkonzentration eines mitochondrialen Aliquots mit einem BCA-Proteinquantifizierungskit, indem Sie die Mitochondriensuspension etwa um das 25-fache verdünnen.
2. Geben Sie SDS-PAGE-Ladepuffer in 40 μl mitochondriale Gesamtproteine. Denaturieren Sie Proteine, indem Sie für die angegebene Zeit bei der richtigen Temperatur inkubieren.
   1. Zum Nachweis von S. pombe Cox1, Cox3, Cob1 und Atp6 denaturieren mitochondriale Proteine bei 45 °C für 3 min. Zum Nachweis von S. pombe Cox2 und Hsp60 denaturieren mitochondriale Proteine bei 90 °C für 5 min.
3. Laden Sie etwa 20 μg (ca. 4 μl) mitochondriale Proteine in das 12% SDS-PAGE-Gel. Führen Sie ein Immunblotting von Proteinen der mitochondrialen Atmungskette mit geeigneten Antikörpern durch, wie in Schritt 6¹⁵ beschrieben.
   HINWEIS: S. pombe Cob1-, Cox1-, Cox2-, Cox3- und Atp6-Proteine werden von mtDNA kodiert, die selbst in S. pombe schwer zu editieren ist, wie die Markierung mit einem gemeinsamen Epitop. Daher sind spezifische Antikörper erforderlich, um diese Proteine nachzuweisen. Um die Reinheit und Integrität der isolierten Mitochondrien zu überprüfen, können diese Proteine der Atmungskette gleichzeitig im Überstand getestet werden, der zytoplasmatische und nukleäre Proteine enthalten sollte. Umgekehrt können die repräsentativen zytoplasmatischen und nukleären Proteine wie Aktin und Histon H3 in der Mitochondrienprobe getestet werden.

5. Vorbereitung der mitochondrialen Probe für BN-PAGE

1. Pellet-Mitochondrien aus früheren Aliquoten in Schritt 3.5 durch Zentrifugation für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C. Verwenden Sie 2 mg mitochondriale Proteine (ca. 400 μl mitochondriale Aliquote) für die BN-PAGE-Analyse.
2. Resuspendieren Sie die Mitochondrien in 200 μl 3x BN-PAGE Gelpuffer (1,5 M 6-Aminocaproicesäure; 150 mM Bis-Tris, pH 7,0, eingestellt mit HCl). Fügen Sie 2 μL 100x PMSF und 1 μL 1 M MgCl₂ hinzu. Die Suspension wird 15 min lang bei 12.000 x g bei 4 °C zentrifugiert.
3. Resuspendieren Sie das Mitochondrien-Pellet in 160 μl 5 % (w/v) Digitonin (DG) oder 64 μl 5 % (w/v) n-Dodecyl-β-D-Maltopyranosid (DDM). 30 min auf Eis inkubieren und alle 10 min vorsichtig mischen.
   1. Für die ersten Versuche an S. pombe fügen Sie 4 mg DG Detergens pro mg mitochondrialer Proteine hinzu, um die mitochondrialen Membranen zu lösen und die Superkomplexe der Atmungskette aufrechtzuerhalten. Fügen Sie 1,6 mg DDM-Detergens pro mg mitochondrialer Proteine hinzu, um die einzelnen mitochondrialen Atmungskettenkomplexe zu trennen. Passen Sie die Konzentration der DG- und DDM-Behandlung an, indem Sie sie entsprechend den anfänglichen Ergebnissen verschiedener Proteinkomplexe in BN-PAGE um das 2-fache erhöhen oder verringern.
4. Die Suspension wird 5 min lang bei 20.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Übertragen Sie den Überstand und messen Sie die Konzentration des löslichen Proteins mit dem BCA-Quantifizierungskit.
5. 80 μl (1/2 Detergenzvolumen) 3x BN-PAGE Probenpuffer (Tabelle 5) auf etwa 160 μl DG-behandelten Überstand geben oder 32 μl (1/2 Detergens Volumen) 3x BN-PAGE Probenpuffer auf etwa 64 μl DDM-behandelten Überstand geben.
   HINWEIS: Im Gegensatz zu SDS-PAGE können die Proteinproben für BN-PAGE nicht durch Kochen denaturiert werden.

6. BN-PAGE und Immunblotting von Komplexen der mitochondrialen Atmungskette

1. Montieren Sie das vorgefertigte native Bis-Tris-Gel (3 % bis 12 % Steigung). Alternativ können Sie das handgemachte native Bis-Tris-Gel (3%-12% Gradient) zubereiten, indem Sie 3% und 12% BN-PAGE-Gel (Tabelle 6) in einem Gradientenmischer mischen.
2. Laden Sie DG- oder DDM-behandelte Proteinproben und den Proteinmarker mit hohem Molekulargewicht für die native PAGE.
   1. Insgesamt werden 100 μg solubilisierte mitochondriale Proteine für die BN-PAGE-Analyse von mitochondrialen Atmungskettenkomplexen benötigt. Laden Sie ca. 12 μl der DG-behandelten Proteinprobe oder 5 μl der DDM-behandelten Proteinprobe in das BN-PAGE-Gel. Passen Sie das Ladevolumen an, um sicherzustellen, dass die Intensitäten der Beladungskontrolle, wie z. B. des mitochondrialen Matrixproteins Mcp60 (Hsp60), bei allen Proben nach der abschließenden Exposition^{gleich sind 15}.
3. Lassen Sie das Gel bei einer konstanten Spannung/einem konstanten Strom von 80 V/6 mA für ca. 30 min unter Verwendung eines Kathodenpuffers mit 0,02 % (w/v) Coomassie G-250 laufen. Ersetzen Sie anschließend den blauen Kathodenpuffer durch einen Kathodenpuffer ohne Coomassie G-250 und laufen Sie mit einem konstanten Strom von 10 mA für ca. 3 h weiter, bis die blaue Farbstofffront von Coomassie G-250 den Gelboden erreicht.
   1. Um zu verhindern, dass mitochondriale Atmungskettenkomplexe abgebaut oder demontiert werden, lassen Sie das Gel mit vorgekühlten Puffern bei 4 °C laufen. Verwenden Sie für das Fertigteilgel den vorgefertigten Laufpuffer. Für das handgemachte Gel verwenden Sie den 1x BN-PAGE Anodenlaufpuffer (50 mM Bis-Tris, pH 7,0, justiert mit HCl) und 1x BN-PAGE Kathodenlaufpuffer (15 mM Bis-Tris, pH 7,0, justiert mit HCl; 50 mM Tricin).
4. Schneiden Sie die mit Proteinmarkern beladene Gelbahn ab. Den Marker 15 min lang mit Coomassie R-250 Puffer färben. Den Fleck entfernen, bis der Marker sichtbar ist.
   HINWEIS: Der Proteinmarker mit hohem Molekulargewicht für natives PAGE ist nicht vorgefärbt. Es wird nach der Färbung mit Coomassie R-250 sichtbar sein.
5. Tauchen Sie den anderen Teil des Gels in den 1x BN-PAGE Transferpuffer (Tabelle 7) zum Ausbalancieren 30 min. Spülen Sie die gleich große 0,45 μm PVDF-Blot-Membran mit 100 % Methanol und tauchen Sie sie zum Ausbalancieren für 10 min in den BN-PAGE-Transferpuffer. Die Proteine im Gel werden 2 h lang unter einem konstanten Strom von 300 mA auf eine 0,45 μm PVDF-Blot-Membran übertragen.
   HINWEIS: Die Nitrocellulose (NC)-Membran wird nicht empfohlen, da die NC-Membran den Farbstoff Coomassie G-250 sehr fest bindet.
6. Spülen Sie die PVDF-Membran mit 100 % Methanol aus, um den blauen Farbstoff Coomassie G-250 auszuwaschen. Inkubieren Sie die PVDF-Membran in einem 1x TBS (50 mM Tris, pH 8,0, angepasst mit HCl; 150 mM NaCl) Blockierungspuffer mit 5 % (w/v) Magermilch für 1 h bei 25 °C.
7. Die PVDF-Membran wird über Nacht bei 4 °C mit den angegebenen Primärantikörpern gegen S. pombe mitochondriale Atmungskettenkomplexe inkubiert.
   HINWEIS: Die Konzentration des Cob1-Antikörpers zum Nachweis von Komplex III beträgt 1:1.000. Die Konzentration des Cox1-Antikörpers zum Nachweis einer komplexen IV beträgt 1: 2.000. Die Konzentration des Atp6-Antikörpers zum Nachweis des Komplexes V beträgt 1: 200.
8. Waschen Sie die PVDF-Membran mit 1x TBST-Puffer (Tabelle 8). Inkubieren Sie die PVDF-Membran mit dem Sekundärantikörper in einer Konzentration von 1:10.000 für 1 h bei 25 °C.
9. Waschen Sie die PVDF-Membran mit 1x TBST-Puffer. Belichten und scannen Sie die PVDF-Membran. Richten Sie das belichtete Bild des BN-PAGE-Gels mit dem Bild des nativen Proteinmarkers aus, um die Molekulargewichte der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe und -superkomplexe zu schätzen.

Wir haben dieses Protokoll bereits verwendet, um die Auswirkungen der Deletion von shy1, dem S. pombe-Homolog von humanem SURF1, auf die Expression von mtDNA-kodierten Atmungskettenproteinen und den Aufbau von mitochondrialen Atmungskettenkomplexen zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass die Steady-State-Spiegel von Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 und Atp6 im Δshy1-Stamm signifikant reduziert waren (Abbildung 3), was darauf hindeu...

In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von S. pombe-Mitochondrien und die Durchführung von SDS-PAGE und BN-PAGE vor, um die Expression und den Aufbau von Komplexen von mitochondrialen Atmungskettenproteinen zu analysieren.

Die Co-Immunpräzipitation (co-IP) wird häufig verwendet, um den Assemblierung von Proteinkomplexen nachzuweisen. Für co-IP ist es jedoch eine Herausforderung, die Assemblierung von mitochond...

Wir haben keine Interessenkonflikte.

Wir danken Dr. Ying Huang und Dr. Ying Luo für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse (32270048 an J. S. und 31900403 an G. F.) der National Natural Science Foundation of China unterstützt.