Femoral Arter Anastomoz Darlığı için Murin Modelinin Geliştirilmesi

Burada, araştırmacılara vasküler anastomoz darlığını incelemek ve simüle etmek için değerli bir hayvan modeli sunan femoral arter anastomozu için bir murin modeli sunuyoruz. Bu gelişme, bu durumun altında yatan patofizyolojiyi daha iyi anlamamız ve vasküler hastalıklara yönelik daha doğru ve etkili araştırmaları kolaylaştırmak için çok önemlidir.

Vasküler cerrahide vasküler anastomoz, kan akışını eski haline getirmek için kullanılan yaygın bir rekonstrüktif tekniktir. Bununla birlikte, anastomoz restenoz, primer olarak cerrahiye bağlı vasküler yaralanma, intimal hiperplazi ve inflamatuar yanıtların neden olduğu sık görülen bir postoperatif komplikasyondur. Fare femoral arter anastomoz modeli, anastomoz restenozu ve vasküler onarım mekanizmalarını araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mikroskobik kılavuzlukta uçtan uca femoral arter anastomozu, cerrahi sonrası vasküler yaralanma ve onarım süreçlerinin hassas simülasyonuna olanak tanıyarak restenozla ilgili patolojik mekanizmaları incelemek için güvenilir bir deneysel araç sağlar. Bu çalışma, farelerde femoral arter anastomozu için cerrahi tekniğin rafine edilmesine odaklanmaktadır. Cerrahi tekniklerdeki iyileştirmeler ve teknik detayların optimizasyonu sayesinde, modelin başarı oranında ve tekrarlanabilirliğinde belirgin bir artış elde ettik. Spesifik iyileştirmeler arasında ameliyat sırasında rafine vasküler taşıma teknikleri, dikiş materyallerinin seçimi ve anastomoz sızıntısını ve ameliyat sonrası tıkanıklığı en aza indirmek için dikiş yöntemlerinin optimizasyonu yer alır. Çalışma ayrıca intimal hiperplazi, anastomoz bölgesinde vasküler yeniden şekillenme ve uzun süreli damar açıklığının gözlenmesini vurgulamaktadır. Bu araştırma sayesinde, vasküler cerrahide deneysel çalışmalar için güvenilir teknik destek sunarak, fare femoral arter anastomozu gerçekleştirmek için kısa ve verimli bir operasyonel rehber sunuyoruz. Bu çalışma, ilgili mekanizmalara ilişkin müteakip araştırmalar ve terapötik müdahalenin değerlendirilmesi için sağlam bir temel oluşturmaktadır.

Vasküler anastomoz, revaskülarizasyon prosedürlerinde temel bir tekniktir ve kan akışının geri kazanılmasında ve doku onarımının desteklenmesinde çok önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, anastomoz bölgesinde intimal hiperplazi (İH) oluşumu sıklıkla restenoza yol açar, bu da uzun vadeli vasküler açıklığı önemli ölçüde tehlikeye atar ve klinik sonuçları ve hasta prognozunu olumsuz etkiler ^1,2. IH, düz kas hücrelerinin (SMC'ler) anormal proliferasyonu ve göçü ve ekstraselüler matriks^1'in aşırı birikimi ile karakterize intraoperatif vasküler yaralanma ile yakından ilişkilidir. Bu karmaşık ve birbiriyle ilişkili patolojik süreçler, restenoza karşı önleyici ve girişimsel stratejileri bilgilendirmek için IH'nin kesin mekanizmalarını aydınlatmaya yönelik kritik ihtiyacın altını çizmektedir.

Tekrarlanabilirlikleri ve hassas kontrolleri nedeniyle, femoral arter anastomozunun murin modelleri, vasküler onarım ve ilişkili patolojik mekanizmalar üzerine yapılan araştırmalarda yaygın olarak benimsenmiştir ^3,4,5. Farelerde uçtan uca anastomoz, cerrahi sonrası anastomoz yaralanmasının doğru simülasyonuna izin vererek, IH'nin dinamik gözlemini ve vasküler yeniden şekillenmeyi mümkün kılar. Bu modeller, cerrahi sonrası endotel hücreleri ve SMC'ler arasındaki etkileşimleri incelemek ve IH gelişiminde inflamatuar yanıtların rolünü değerlendirmek için ideal bir platform sağlar⁶. Araştırmacılar, histolojik analiz ve moleküler biyobelirteç tespitini birleştirerek, IH'nin temel itici güçlerini kapsamlı bir şekilde tanımlayabilir, altta yatan mekanizmaları ve potansiyel terapötik hedefleri hakkında kritik bilgiler sunabilir.

İH'nin gelişimi, hemodinamik değişikliklerin kritik bir katkıda bulunduğu birçok faktör tarafından yönlendirilir ^1,7,8. Anastomoz bölgesinde, düşük kayma gerilmesi bölgeleri ve anormal salınım kayma indeksi (OSI), SMC'lerin proliferasyonu ve göçü için birincil uyaranlardır ^1,7. Ayrıca, uyum uyumsuzlukları ve anastomoz etrafındaki türbülanslı kan akışı, endotel hasarını şiddetlendirerek IH ilerlemesini hızlandırır⁸. Bu bulgular, anastomoz bölgesindeki patolojik değişiklikleri azaltmak için cerrahi tekniklerin optimize edilmesinin ve uygun materyallerin seçilmesinin gerekliliğini vurgulamaktadır.

Son yıllarda, ilaç kaplı balonlar (DCB'ler) IH'yi azaltmada etkinlik göstermiştir. Paklitaksel gibi anti-proliferatif ajanlar, SMC'lerin proliferasyonunu ve göçünü etkili bir şekilde inhibe ederek restenoz insidansını önemli ölçüde azaltır⁹. Bununla birlikte, kesme gerilimindeki hızlı dalgalanmaların ve yüksek kan akış hızlarının DCB'lerin etkinliğini azaltabileceği arteriyovenöz greftler gibi yüksek akışlı sistemlerde zorluklar devam etmektedir¹. Gelecekteki çalışmalar, cerrahi sonrası restenoz için daha kişiselleştirilmiş ve etkili çözümler geliştirmek için biyomalzeme bilimindeki gelişmelerden yararlanırken, DCB'lerin çeşitli hemodinamik ortamlarda uygulanabilirliğini geliştirmeye odaklanmalıdır. Lokalize girişimlere ek olarak, diyabet, ateroskleroz ve endotel disfonksiyonu gibi sistemik faktörler IH gelişimini önemli ölçüde etkiler¹⁰. Bu nedenle, klinik stratejiler, genel vasküler sağlığı geliştirmek için bu sistemik durumların kapsamlı yönetimine öncelik vermelidir. Aynı zamanda, IH ilerlemesi için yeni biyobelirteçlerin tanımlanması ve izlenmesi erken müdahale için fırsatlar sağlayabilir. Yapay zekanın cerrahi planlamaya entegrasyonu, optimize edilmiş anastomoz konfigürasyonlarının hesaplamalı tasarımına izin veren, böylece cerrahi başarı oranlarını iyileştiren ve vasküler açıklığı uzatan umut verici başka bir yol sunmaktadır.

Cerrahi sonrası IH ve ilişkili patolojik mekanizmaların çalışmasında, femoral arter anastomoz modeli hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği ile öne çıkmaktadır¹¹. Farelerde femoral arterin uçtan uca anastomozunu oluşturmak için mikrocerrahi teknikler kullanan bu model, anastomoz bölgesindeki lokalize cerrahi travmayı doğru bir şekilde taklit eder. Bu modelin avantajları, tel kaynaklı yaralanma veya diğer alternatifler gibi modellerle karşılaştırıldığında özellikle belirginleşir. Femoral arter anastomoz modelinin önemli bir teknik avantajı, yüksek lokalize ve kontrollü vasküler yaralanmayı indükleme yeteneğidir¹². Cerrahi travma, klinik vasküler cerrahide karşılaşılan yaralanma paternlerini yakından taklit ederek anastomoz bölgesi üzerinde odaklanmış bir etkiye izin verir. Buna karşılık, tel kaynaklı yaralanma modelleri, teknikte daha basit olsa da, genellikle geniş endotelyal denudasyona neden olur ve bu da gerçek hayattaki anastomoz ameliyatlarında gözlenen lokalize travmanın tekrarlanmasını zorlaştırır¹³. Ayrıca, farklı denemelerde tel kaynaklı hasarın derinliği ve kapsamındaki değişkenlik, sonuçların tekrarlanabilirliğini potansiyel olarak azaltır. Tel yaralanma modellerindeki hasarın yaygın ve yaygın doğası, özellikle anastomoz bölgeleriyle ilişkili lokalize IH'yi araştırmak için daha az ilgili hale getirir.

Bu çalışmada, femoral arter anastomozunun murin modelini kullanarak, model başarı oranlarını artırmak ve anastomoz bölgesinin uzun süreli açıklığını sağlamak için cerrahi teknikleri sistematik olarak geliştirdik. Bu yerleşik temelden yararlanan çalışmamız, SMC'lerin göçünü ve proliferasyonunu yöneten düzenleyici yolların yanı sıra IH'nin ilerlemesinde inflamatuar mediatörlerin rolü de dahil olmak üzere IH'nin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırdı. Bu araştırma sayesinde, anastomoz sonrası restenoz mekanizmalarına yeni teorik bakış açıları kazandırmayı ve özellikle İH'yi hedefleyen terapötik stratejilerin geliştirilmesi için deneysel bir temel oluşturmayı amaçlıyoruz.

Bu çalışma onaylandı ve hayvanlar, Çin'deki Laboratuvar Hayvanlarının Yönetimi ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak ele alındı. Araştırma, Hayvan Etik Kurulu'nun onayı ile hayvan deneylerinin etik gerekliliklerine sıkı sıkıya bağlı kalmıştır (Onay No: SWMU20221109-019). Burada, bu çalışma için 20-22 g ağırlığında, her iki cinsiyetten 8 haftalık sağlıklı C57BL / 6 fareleri kullanıldı. Hayvanlar, Southwest Medical University (SWMU) Laboratuvar Hayvanları Merkezi'ne yerleştirildi.

1. Ameliyat öncesi prosedürler

1. Kurumsal olarak onaylanmış protokollere uygun olarak% 3 izofluran inhalasyonu ile fareleri uyuşturun. Anestezinin başlamasından sonra, ameliyata devam etmeden önce derin anesteziyi sağlamak için ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt eksikliği gibi reflekslerin tam kaybını doğrulayın. Anesteziyi indükledikten sonra, anestezi durumunu korumak için izofluran konsantrasyonunu% 1 -% 1.5'e düşürün ve hayvanların cerrahi prosedür boyunca derin anestezide kalmasını sağlayın.
2. Fareyi cerrahi bir platforma sırtüstü yatırın ve arka bacakları aşırı gerilmeden uzatın.
3. Tüyleri almak için uyluk bölgesine yaklaşık 1 dakika boyunca tüy dökücü bir krem uygulayın, ardından kalan kremi ve başıboş tüyleri gidermek için alanı iyice temizleyin.
4. Sonraki cerrahi adımlara hazırlanmak için cerrahi bölgeyi iyot solüsyonu 3x ile dezenfekte edin.

2. Femoral arterin vasküler anastomozu

1. Stereomikroskop altında, bir mikroneşter kullanarak uyluk ortası bölgesinde uyluk kemiğinin ekseni boyunca yaklaşık 1,5 cm uzunluğunda bir kesi yapın. Cildi kestikten sonra, femoral arter ve femoral ven açığa çıkana kadar deri altı dokuyu ayırmak için künt diseksiyon yapın. Femoral arter, femoral venin lateralinde bulunur ve sinir, arterin üstünde ve yanında konumlandırılır.
2. Femoral arterin 1 cm'lik bir bölümünü tamamen ortaya çıkarmak için dokuyu dikkatlice inceleyin. Hemostatik forseps kullanarak, sinirleri, arteri ve damarı ortaya çıkarmak için kasları ve derin fasyayı nazikçe ayırın. Bu işlem sırasında sinir en dış tabakada, atardamar ortada, toplardamar ise iç kısımda yer alır.
3. Künt diseksiyon kullanarak femoral arter ve femoral veni nazikçe ayırın. Femoral arteri tamamen ortaya çıkarmak için bağ dokusunu ayırmak için ince forseps kullanmaya dikkat edin. İşlem sırasında kazara iğne yaralanmasını önlemek için femoral arterin altına steril bir ped yerleştirin. Daha sonra, bir hematomu indüklemek için femoral arteri forseps ile hafifçe sıkıştırın.
4. . Küçük hemostatik forseps kullanarak, femoral arterin proksimal ve distal uçlarını kelepçeleyin. Femoral arteri düzgün ve simetrik bir şekilde kesmek için ince makas kullanın.
5. Femoral arterin anastomozunda enjeksiyon için 1 mL'lik bir şırıngada% 1 heparinize salin (normal salin içinde% 1 heparin) hazırlayın. Bir seferde 3-4 damla olarak salin ekleyin ve arterdeki kan pıhtılarını gidermek için birkaç kez tekrarlanan durulama yapın.
6. Sonraki dikiş sırasında damara destek sağlamak ve bir kılavuz tel müdahalesinin neden olduğu potansiyel hasarı simüle etmek için, femoral artere 1 cm uzunluğunda 6-0 cerrahi sütür yerleştirin. Dikiş işlemini kolaylaştırmak için femoral arterin uygun şekilde hizalandığından ve pürüzsüzlüğünden emin olun.
7. Anastomoz için 12-0 cerrahi sütür kullanın ve iğnenin damarın iç tarafından dış tarafına çıkmasını sağlamak için mikroskop altında iğne açısını ayarlayın.
8. Dördü proksimal ve dördü femoral arterin distal uçlarında olmak üzere sekiz delinme bölgesi oluşturun.
   1. Delinme bölgelerinin damarın ön, arka, sol ve sağ noktalarında yer aldığından ve distal ve proksimal uçlarda karşılık gelen bölgelerle birlikte olduğundan emin olun. Bu noktaları seçerken, damarın erişilebilir olduğundan emin olun, kritik anatomik yapılardan kaçının ve anastomoz sırasında iyi kan akışını koruyun.
   2. Delinme çapını, damara verilen zararı en aza indirecek kadar küçük, ancak gerekli prosedürler için yeterince büyük yapın. Delinme için tipik olarak 12-0 dikiş iğnesi kullanılır.
9. Her biri 3-4 cm uzunluğunda dört uzunlukta 12-0 dikiş kesin ve her birini ilgili delme deliğinden geçirin. Dikişlerin dolaşmasını önlemek için gevşek bir düğüm atarak başlayın.
10. Damar desteği için kullanılan 6-0 dikişi çıkarın ve düğümleri sıkıca bağlayın. Anastomoz tamamlandıktan sonra hemostatik forsepsleri serbest bırakın.
11. Açıklığı kontrol etmek için femoral arteri proksimal uçtan distal uca kavisli forseps ile nazikçe kazıyın ve kanın damardan serbestçe akmasını sağlayın. Ek olarak, anastomoz bölgesini herhangi bir belirgin sızıntı belirtisi açısından dikkatlice inceleyin.

3. Ameliyat sonrası dikiş atılması

1. Alt ekstremite derisini 6-0 cerrahi sütür kullanarak, dokunun hassas bir şekilde hizalanmasını ve güvenli bir şekilde yaklaşmasını sağlamak için kesintili bir sütür kullanarak dikin. Yarayı diktikten sonra, yarayı dezenfekte etmek ve enfeksiyon riskini daha da azaltmak için dikişli bölgeye iyot tentürü uygulayın.
2. Ameliyat sonrası steril koşulları koruyun. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Ameliyat geçiren hayvanları, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların yanına iade etmeyin.

4. Ameliyat sonrası gözlem ve örnekleme

1. Cerrahi bölgeyi herhangi bir iltihaplanma, aşırı şişme veya akıntı belirtisi açısından düzenli olarak inceleyin. Hayvanın durumunu belgeleyin ve gerektiğinde uygun bakımı sağlayın.
2. Ameliyattan 4 hafta sonra, fareleri onaylanmış etik yönergelere uygun olarak insancıl bir şekilde ötenazi yapın. Ötenazi için, aşırı dozda pentobarbital sodyum (150 mg / kg, intraperitoneal enjeksiyon) uygulayın, ağrısız ve insancıl bir son nokta sağlayın. Bilinç kaybı ve reflekslerin durması onaylandıktan sonra doku toplamaya başlayın.
   NOT: Ön çalışmalarda, örneklerin 3^{. hafta veya} daha erken toplanmasının intimal hiperplazi oluşumuna elverişli olmadığını bulduk. Tersine, 5^{. haftada örnek} toplamak aşırı intimal hiperplaziye yol açtı. Bu aşırı büyüme sadece sonraki deneylerin gözlemlenmesini engellemekle kalmadı, aynı zamanda fareler için potansiyel sağlık riskleri de oluşturdu. Yani burada 4^{. hafta seçildi} .
3. Anastomoz bölgesine odaklanan, anastomozdan her iki yönde yaklaşık 1 cm uzanan femoral arter örneklerini toplayın. İnce makas kullanarak, femoral arteri çevredeki tüm kas dokusuyla birlikte çıkarın.
4. Eksizyondan sonra, kalan kanı çıkarmak için numuneyi PBS'de durulayın, ardından daha fazla koruma ve analiz için 1-2 gün boyunca% 10 nötr formalin içinde sabitleyin.
   NOT: %10'luk nötr bir formalin, doku fiksasyonu, proteinleri etkili bir şekilde çapraz bağlama ve doku yapısının bütünlüğünü koruma için klasik bir seçimdir, bu da onu dokuların uzun süreli depolanması için özellikle uygun hale getirir. Buna karşılık, %4 paraformaldehit (PFA), hücre içi yapıların (nükleik asitler ve proteinler gibi) daha ince korunması için daha uygun olan ve immünohistokimya veya immünofloresan analizi için yaygın olarak kullanılan daha hafif bir fiksatiftir. Bu çalışmanın birincil amacı, hücre içi moleküllerin veya proteinlerin kesin lokalizasyonundan ziyade kan damarlarındaki histolojik değişiklikleri (intimal hiperplazi ve vasküler yeniden şekillenme gibi) gözlemlemektir. Bu nedenle, formalinin fiksasyon etkisi deneysel ihtiyaçları karşılamak için yeterlidir. Araştırma daha yüksek moleküler doğruluk gerektiriyorsa (RNA veya proteinlerin korunması gibi), PFA daha iyi bir seçim olabilir.

5. Femoral arterin dehidrasyonu ve gömülmesi

1. Sabitlemeden sonra, numuneleri gömme kutularına yerleştirin. Otomatik bir doku işlemcisi kullanarak doku dehidrasyonu için işlenmeden önce femoral arter örneklerini 6-8 saat akan su ile durulayın.
2. Erimiş parafini gömme kalıplarına dökün, ısıtılmış forseps kullanarak femoral arteri dikkatlice alın ve erimiş parafin içeren kalıba dikey olarak gömün. Gömme kutusunun kapağını ve alt kısmını, alt kısmı gömme kalıbının üstüne gelecek şekilde ayırın. Yerine sabitlemek için az miktarda erimiş parafin ekleyin ve parafin bloğu için temel görevi görün. Hava kabarcıklarından titizlikle kaçınılmalıdır.
3. Balmumu bloğu, yüzeyde şeffaf bir balmumu filminin oluştuğu noktaya kadar soğuduğunda, hızlı bir şekilde soğuması için bir dondurma masasına yerleştirin.
4. Gömülü balmumu bloğunu gömme kalıbından çıkarın ve doku bloğunu çevreleyen fazla parafini keskin bir bıçak kullanarak dikkatlice kesin.

6. Femoral arterin parafin bölümlerinin hazırlanması

1. Bıçağı mikrotomun üzerine monte edin ve bıçağın kesit için keskin olduğundan emin olun.
2. Parafin bloğunu tutucuya sabitleyin ve bloğu bıçağa göre kesitleme için uygun konuma ayarlayın.
3. Gömülü dokunun tamamen kesilebilmesini sağlamak için bloğu kesin. İlk bölümlerin kalınlığını 15-20 μm'ye ayarlayın.
4. Kesit kalınlığını yaklaşık 4 μm'ye ayarlayın ve kesit almaya devam edin.
5. Bölümleri bir fırça kullanarak nazikçe kaldırın ve yüzmeyi kolaylaştırmak için özel ince cımbızla ılık suyla (yaklaşık 45 °C) doldurulmuş bir slayt kutusuna aktarın.
6. Yayılma bölümlerini mikroskop slaytlarına aktarın. Fazla suyu boşaltmak için kızakları 45°'lik bir açıyla konumlandırın. Daha sonra, slaytları kuruması için tipik olarak 37 °C'de 2 saat fırına koyun, ardından 60 °C'de 1 saat pişirin.

7. Hematoksilen-Eozin boyama

1. Mutlak etanol, %95, %80 ve %70 etanol dahil olmak üzere bir dizi kademeli etanol konsantrasyonu kullanarak bölümleri nemlendirin ve her adım yaklaşık 5 dakika sürer. Daha sonra, kalan etanolü gidermek için bölümleri damıtılmış suyla durulayın.
2. Bölümleri hematoksilen ile yaklaşık 8-10 dakika boyayın ve fazla lekeyi çıkarmak için 3x'i akan su ile iyice yıkayın.
3. Lekeli bölümleri ayırt etmek için, 5-7 sn gibi kısa bir süre boyunca% 1 hidroklorik asit alkol çözeltisi uygulayın.
4. Mavi rengi yoğunlaştırmak için, bölümlere 1 dakika boyunca 1:400 amonyak çözeltisi uygulayın.
5. % 75 etanole batırdıktan sonra, bölümleri 36 saniye boyunca eozin ile boyayın. Boyamayı takiben, her adım 3-5 saniye sürecek şekilde, artan bir dizi etanol konsantrasyonu (%80, %90, %95 ve %100) ile bölümleri sırayla kurutun.
6. Son olarak, bölümleri 37 °C'de bir fırında 10 dakika pişirin, bir cam slayt üzerine birkaç damla sızdırmazlık maddesi uygulayın, numuneyi yerlerine sabitlemek için bir lamel ile örtün ve doğal olarak kurumaya bırakın.

Vasküler anastomoz cerrahisinde, damar duvarının mekanik olarak yaralanması, intimal hücreleri aktive edebilir ve proliferasyonu tetikleyebilir. Anastomozdan sonra kan akış hızı ve yönündeki değişiklikler de intimal hücrelerin çoğalmasını uyarabilir. Vasküler yeniden şekillenme süreci ve kan akışının uzun süreli kararsızlığı da intimal hücreleri kalıcı olarak uyarabilir ve sonuçta kalınlaşmaya yol açabilir.

Femoral arter an...

Vasküler anastomoz, vasküler rekonstrüksiyon cerrahisinde çok önemli bir tekniktir ve hayvan modeli postoperatif restenoz mekanizmalarının incelenmesinde anahtar rol oynamaktadır. Bu model, vasküler patolojik değişikliklerin araştırılması için, özellikle restenoz sırasında neointimada aşırı çoğalan hücrelerin kökeninin anlaşılmasında kontrollü bir yaklaşım sunmaktadır. Prolifere olan düz kas hücrelerinin (SMC'ler) kaynağı, vasküler anastomozlardan so...

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Zhejiang Üniversitesi'nden Prof. Qingbo Xu ve Yanhua Hu'ya değerli teknik yardımları için en içten teşekkürlerimizi sunarız. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakıfları (82070502 ve 32171099 numaralı hibeler), Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2025HJRC0035, 2024NSFSC0709 hibe numaraları) ve Luzhou-Güneybatı Tıp Üniversitesi Ortak Projesi (2024LZXNYDJ021, 2024LZXNYDJ014) tarafından desteklenmiştir.