Desenvolvimento de um modelo murino para estenose anastomótica da artéria femoral

Aqui apresentamos um modelo murino para anastomose da artéria femoral, oferecendo aos pesquisadores um modelo animal valioso para estudar e simular a estenose da anastomose vascular. Esse desenvolvimento é crucial para avançar nossa compreensão da fisiopatologia subjacente a essa condição e facilitar pesquisas mais precisas e eficazes sobre doenças vasculares.

Na cirurgia vascular, a anastomose vascular é uma técnica reconstrutiva comum usada para restaurar o fluxo sanguíneo. No entanto, a reestenose anastomótica é uma complicação pós-operatória frequente, causada principalmente por lesão vascular induzida por cirurgia, hiperplasia intimal e respostas inflamatórias. O modelo de anastomose da artéria femoral de camundongos é amplamente utilizado para investigar os mecanismos de reestenose anastomótica e reparo vascular. A anastomose término-terminal da artéria femoral guiada microscopicamente permite a simulação precisa da lesão vascular e dos processos de reparo após a cirurgia, fornecendo uma ferramenta experimental confiável para estudar os mecanismos patológicos relacionados à reestenose. Este estudo tem como objetivo refinar a técnica cirúrgica para anastomose da artéria femoral em camundongos. Por meio de refinamentos nas técnicas cirúrgicas e otimização de detalhes técnicos, conseguimos um aumento acentuado na taxa de sucesso e reprodutibilidade do modelo. Melhorias específicas incluem técnicas refinadas de manuseio vascular durante a cirurgia, a seleção de materiais de sutura e a otimização dos métodos de sutura para minimizar o vazamento da anastomose e a oclusão pós-operatória. O estudo também enfatiza a observação de hiperplasia intimal, remodelamento vascular no local da anastomose e perviedade do vaso a longo prazo. Por meio desta pesquisa, fornecemos um guia operacional conciso e eficiente para a realização de anastomose da artéria femoral de camundongos, oferecendo suporte técnico confiável para estudos experimentais em cirurgia vascular. Este trabalho estabelece uma base sólida para investigações subsequentes sobre mecanismos relacionados e avaliações de intervenção terapêutica.

A anastomose vascular é uma técnica fundamental nos procedimentos de revascularização, desempenhando um papel fundamental na restauração do fluxo sanguíneo e na promoção do reparo tecidual. No entanto, a ocorrência de hiperplasia intimal (HI) no local da anastomose muitas vezes leva à reestenose, o que compromete significativamente a permeabilidade vascular em longo prazo e impacta negativamente os resultados clínicos e o prognóstico do paciente ^1,2. A HI está intimamente associada à lesão vascular intraoperatória, caracterizada por proliferação e migração anormais de células musculares lisas (SMCs) e deposição excessiva de matriz extracelular¹. Esses processos patológicos complexos e inter-relacionados sublinham a necessidade crítica de elucidar os mecanismos precisos da HI para informar estratégias preventivas e intervencionistas contra a reestenose.

Devido à sua reprodutibilidade e controle preciso, os modelos murinos de anastomose da artéria femoral têm sido amplamente adotados na pesquisa sobre reparo vascular e mecanismos patológicos associados ^3,4,5. A anastomose término-terminal em camundongos permite a simulação precisa da lesão anastomótica pós-cirúrgica, permitindo a observação dinâmica da IH e do remodelamento vascular. Esses modelos fornecem uma plataforma ideal para estudar as interações entre células endoteliais e SMCs pós-cirurgia e avaliar o papel das respostas inflamatórias no desenvolvimento da HI⁶. Ao combinar análise histológica e detecção de biomarcadores moleculares, os pesquisadores podem identificar de forma abrangente os principais impulsionadores da IH, oferecendo insights críticos sobre seus mecanismos subjacentes e potenciais alvos terapêuticos.

O desenvolvimento da HI é impulsionado por múltiplos fatores, sendo as alterações hemodinâmicas um contribuinte crítico ^1,7,8. No local da anastomose, regiões de baixa tensão de cisalhamento e índice de cisalhamento oscilatório anormal (OSI) são estímulos primários para a proliferação e migração de SMCs ^1,7. Além disso, as incompatibilidades de complacência e o fluxo sanguíneo turbulento ao redor da anastomose exacerbam a lesão endotelial, acelerando a progressão da HI⁸. Esses achados reforçam a necessidade de otimizar as técnicas cirúrgicas e selecionar materiais apropriados para mitigar as alterações patológicas no local da anastomose.

Nos últimos anos, os balões farmacológicos (DCBs) têm demonstrado eficácia na redução da HI. Agentes antiproliferativos, como o paclitaxel, inibem efetivamente a proliferação e migração de SMCs, reduzindo significativamente a incidência de reestenose⁹. No entanto, os desafios persistem em sistemas de alto fluxo, como enxertos arteriovenosos, onde flutuações rápidas na tensão de cisalhamento e altas taxas de fluxo sanguíneo podem diminuir a eficácia dos DCBs¹. Estudos futuros devem se concentrar em melhorar a aplicabilidade dos DCBs em ambientes hemodinâmicos variados, aproveitando os avanços na ciência dos biomateriais para desenvolver soluções mais personalizadas e eficazes para a reestenose pós-cirúrgica. Além das intervenções localizadas, fatores sistêmicos como diabetes, aterosclerose e disfunção endotelial influenciam significativamente o desenvolvimento da^HI10. Portanto, as estratégias clínicas devem priorizar o manejo abrangente dessas condições sistêmicas para melhorar a saúde vascular geral. Ao mesmo tempo, a identificação e o monitoramento de novos biomarcadores para a progressão da HI podem oferecer oportunidades para intervenção precoce. A integração da inteligência artificial no planejamento cirúrgico oferece outro caminho promissor, permitindo o design computacional de configurações anastomóticas otimizadas, melhorando assim as taxas de sucesso cirúrgico e prolongando a permeabilidade vascular.

No estudo da HI pós-cirúrgica e dos mecanismos patológicos associados, o modelo de anastomose da artéria femoral destaca-se por sua precisão e reprodutibilidade11. Este modelo, empregando técnicas microcirúrgicas para criar anastomose término-terminal da artéria femoral em camundongos, imita com precisão o trauma cirúrgico localizado no local da anastomose. As vantagens deste modelo tornam-se particularmente evidentes quando comparadas a modelos como lesão induzida por fio ou outras alternativas. Uma grande vantagem técnica do modelo de anastomose da artéria femoral é sua capacidade de induzir lesão vascular altamente localizada e controlada¹². O trauma cirúrgico permite um impacto focado na região da anastomose, imitando de perto os padrões de lesão encontrados na cirurgia vascular clínica. Em contraste, os modelos de lesão induzida por fio, embora mais simples na técnica, geralmente resultam em extenso desnudamento endotelial, dificultando a replicação do trauma localizado observado em cirurgias de anastomose da vida real¹³. Além disso, a variabilidade na profundidade e extensão dos danos induzidos por fios em diferentes ensaios diminui potencialmente a reprodutibilidade dos resultados. A natureza extensa e difusa do dano nos modelos de lesão por fio o torna menos relevante para investigar a HI localizada que está especificamente associada às regiões da anastomose.

Neste estudo, utilizando um modelo murino de anastomose da artéria femoral, refinamos sistematicamente as técnicas cirúrgicas para aumentar as taxas de sucesso do modelo e garantir a perviedade a longo prazo do local da anastomose. Aproveitando essa base estabelecida, nosso estudo investigou os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à HI, incluindo vias regulatórias que governam a migração e proliferação de SMCs, bem como o papel dos mediadores inflamatórios na progressão da HI. Por meio desta pesquisa, pretendemos contribuir com novos insights teóricos sobre os mecanismos da reestenose pós-anastomose e estabelecer uma base experimental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas especificamente à IH.

Este estudo foi aprovado e os animais foram manejados de acordo com as Diretrizes para o Manejo e Uso de Animais de Laboratório na China. A pesquisa seguiu rigorosamente os requisitos éticos dos experimentos com animais, com aprovação do Comitê de Ética Animal (Número de Aprovação: SWMU20221109-019). Aqui, camundongos C57BL/6 saudáveis de 8 semanas de idade de ambos os sexos, pesando entre 20-22 g, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram alojados no Centro de Animais de Laboratório da Southwest Medical University (SWMU).

1. Procedimentos pré-operatórios

1. Anestesiar camundongos com inalação de isoflurano a 3% de acordo com protocolos aprovados institucionalmente. Após o início da anestesia, verifique a perda completa dos reflexos, como a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, para garantir uma anestesia profunda antes de prosseguir com a cirurgia. Após a indução anestésica, reduzir a concentração de isoflurano para 1%-1,5% para manter o estado anestésico, garantindo que os animais permaneçam em anestesia profunda durante todo o procedimento cirúrgico.
2. Posicione o camundongo em decúbito dorsal em uma plataforma cirúrgica, estendendo os membros posteriores sem esticar demais.
3. Aplique um creme depilatório na área da coxa por aproximadamente 1 min para remover os pelos e, em seguida, limpe bem a área para remover qualquer creme residual e pelos soltos.
4. Desinfete o local da cirurgia com solução de iodo 3x para se preparar para as etapas cirúrgicas subsequentes.

2. Anastomose vascular da artéria femoral

1. Sob um estereomicroscópio, faça uma incisão de aproximadamente 1,5 cm de comprimento ao longo do eixo do fêmur na região do meio da coxa usando um microbisturi. Após a incisão da pele, faça uma dissecção romba para separar o tecido subcutâneo até que a artéria femoral e a veia femoral estejam expostas. A artéria femoral está localizada lateralmente à veia femoral e o nervo está posicionado superior e lateralmente à artéria.
2. Disseque cuidadosamente o tecido para expor totalmente uma seção de 1 cm da artéria femoral. Usando uma pinça hemostática, separe suavemente os músculos e a fáscia profunda para expor os nervos, a artéria e a veia. Durante esse processo, o nervo está localizado na camada mais externa, a artéria está no meio e a veia está no interior.
3. Separe suavemente a artéria femoral e a veia femoral usando dissecção romba. Tenha cuidado ao usar pinças finas para separar o tecido conjuntivo para expor totalmente a artéria femoral. Coloque uma almofada estéril sob a artéria femoral para evitar ferimentos acidentais com agulha durante o procedimento. Em seguida, aperte suavemente a artéria femoral com uma pinça para induzir um hematoma.
4. . Usando uma pequena pinça hemostática, prenda as extremidades proximal e distal da artéria femoral. Use uma tesoura fina para atravessar a artéria femoral de forma organizada e simétrica.
5. Retire solução salina heparinizada a 1% (heparina a 1% em solução salina normal) em uma seringa de 1 mL para injeção na anastomose da artéria femoral. Adicione solução salina em 3-4 gotas de cada vez, com vários enxágues repetidos para remover quaisquer coágulos sanguíneos da artéria.
6. Para fornecer suporte ao vaso durante a sutura subsequente e simular o dano potencial causado por uma intervenção de fio-guia, insira uma sutura cirúrgica 6-0 de 1 cm de comprimento na artéria femoral. Garanta o alinhamento adequado e a suavidade da artéria femoral para facilitar o processo de sutura.
7. Use uma sutura cirúrgica 12-0 para anastomose e ajuste o ângulo da agulha sob o microscópio para garantir que a agulha saia do lado interno para o lado externo do vaso.
8. Crie oito locais de punção, quatro nas extremidades proximal e quatro nas extremidades distais da artéria femoral.
   1. Certifique-se de que os locais de punção estejam localizados nos pontos anterior, posterior, esquerdo e direito do vaso, com locais correspondentes nas extremidades distal e proximal. Ao selecionar esses pontos, certifique-se de que o vaso esteja acessível, evite estruturas anatômicas críticas e mantenha um bom fluxo sanguíneo durante a anastomose.
   2. Faça o diâmetro da punção pequeno o suficiente para minimizar os danos ao vaso, mas grande o suficiente para os procedimentos necessários. Uma agulha de sutura 12-0 é normalmente usada para punção.
9. Corte quatro pedaços de sutura 12-0, cada um com 3-4 cm de comprimento, e passe cada um pelo orifício de punção correspondente. Comece dando um nó solto para evitar emaranhar as suturas.
10. Remova a sutura 6-0 usada para suporte do vaso e amarre os nós com segurança. Solte a pinça hemostática após a conclusão da anastomose.
11. Raspe suavemente a artéria femoral com uma pinça curva da extremidade proximal para a distal para verificar a permeabilidade, garantindo que o sangue flua livremente através do vaso. Além disso, inspecione cuidadosamente o local da anastomose em busca de sinais de vazamento óbvio.

3. Sutura pós-operatória

1. Suturar a pele do membro inferior com sutura cirúrgica 6-0, empregando uma sutura interrompida para garantir um alinhamento preciso e uma aproximação segura do tecido. Após suturar a ferida, aplique tintura de iodo na área suturada para desinfetar a ferida e reduzir ainda mais o risco de infecção.
2. Manter condições estéreis pós-cirurgia. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Não devolva os animais que foram submetidos a cirurgia à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.

4. Observação e amostragem pós-operatória

1. Inspecione regularmente o local da cirurgia em busca de sinais de inflamação, inchaço excessivo ou secreção. Documente a condição do animal e forneça os cuidados adequados conforme necessário.
2. Às 4 semanas após a cirurgia, eutanasiar humanamente os camundongos de acordo com as diretrizes éticas aprovadas. Para a eutanásia, administrar uma overdose de pentobarbital sódico (150 mg/kg, injeção intraperitoneal), garantindo um desfecho indolor e humano. Assim que a inconsciência e a cessação dos reflexos forem confirmadas, inicie a coleta de tecido.
   NOTA: Nos estudos preliminares, descobrimos que a colheita das amostras durante a^3ª semana ou antes não foi propícia à formação de hiperplasia intimal. Por outro lado, a coleta de amostras na^5ª semana levou a hiperplasia intimal excessiva. Esse crescimento excessivo não apenas impediu a observação de experimentos subsequentes, mas também representou riscos potenciais à saúde dos camundongos. Então, a^4ª semana foi selecionada aqui.
3. Coletar amostras de artéria femoral, centrando-se no local da anastomose, estendendo-se aproximadamente 1 cm em ambas as direções da anastomose. Usando uma tesoura fina, excise a artéria femoral junto com todo o tecido muscular circundante.
4. Após a excisão, enxágue a amostra em PBS para remover o sangue residual e, em seguida, fixe-a em formalina neutra a 10% por 1-2 dias para posterior preservação e análise.
   NOTA: Uma formalina neutra a 10% é uma escolha clássica para fixação de tecidos, reticulando proteínas de forma eficaz e preservando a integridade da estrutura do tecido, tornando-a particularmente adequada para o armazenamento de tecidos a longo prazo. Em contraste, o paraformaldeído a 4% (PFA) é um fixador mais suave que é mais adequado para a preservação mais fina de estruturas intracelulares (como ácidos nucléicos e proteínas) e é comumente usado para análise de imuno-histoquímica ou imunofluorescência. O objetivo principal deste estudo é observar as alterações histológicas nos vasos sanguíneos (como hiperplasia intimal e remodelamento vascular) em vez da localização precisa de moléculas ou proteínas intracelulares. Portanto, o efeito de fixação da formalina é suficiente para atender às necessidades experimentais. Se a pesquisa exigir maior fidelidade molecular (como a preservação de RNA ou proteínas), o PFA pode ser uma escolha melhor.

5. Desidratação e incorporação da artéria femoral

1. Após a fixação, coloque as amostras em caixas de incorporação. Enxágue as amostras da artéria femoral com água corrente por 6-8 h antes de serem processadas para desidratação do tecido usando um processador de tecido automatizado.
2. Despeje a parafina derretida em moldes de incorporação, pegue cuidadosamente a artéria femoral usando uma pinça aquecida e incorpore-a verticalmente no molde que contém a parafina derretida. Separe a tampa e a parte inferior da caixa de embutir, com a parte inferior colocada em cima do molde de embutir. Adicione uma pequena quantidade de parafina derretida para fixá-la no lugar, servindo de base para o bloco de parafina. Bolhas de ar devem ser meticulosamente evitadas.
3. Quando o bloco de cera esfriar até o ponto em que uma película de cera transparente se forme na superfície, coloque-o em uma mesa de congelamento para esfriar rapidamente.
4. Remova o bloco de cera embutido do molde de incorporação e apare o excesso de parafina que circunda o bloco de tecido com cuidado usando uma lâmina afiada.

6. Preparação de cortes de parafina da artéria femoral

1. Monte a lâmina no micrótomo, garantindo que a faca esteja afiada para seccionar.
2. Fixe o bloco de parafina no suporte e ajuste o bloco em relação à lâmina para a posição apropriada para seccionar.
3. Apare o bloco para garantir que o tecido embutido possa ser completamente seccionado. Defina a espessura das seções iniciais para 15-20 μm.
4. Ajuste a espessura da seção para aproximadamente 4 μm e prossiga com o seccionamento.
5. Levantar as mechas suavemente com uma escova e transferi-las com uma pinça fina especializada para uma caixa de corrediças cheia de água morna (cerca de 45 °C) para facilitar a flutuação.
6. Transfira as seções espalhadas para lâminas de microscópio. Posicione as lâminas em um ângulo de 45° para drenar o excesso de água. Depois, coloque as lâminas em um forno para secar, normalmente a 37 ° C por 2 h, seguido de cozimento a 60 ° C por 1 h.

7. Coloração de hematoxilina-eosina

1. Hidrate as seções usando uma série de concentrações graduais de etanol, incluindo etanol absoluto, etanol 95%, 80% e 70%, com cada etapa levando aproximadamente 5 min. Em seguida, enxágue as seções com água destilada para remover qualquer etanol residual.
2. Pinte as seções com hematoxilina por aproximadamente 8 a 10 minutos e lave bem 3x com água corrente para remover o excesso de mancha.
3. Para diferenciar as seções manchadas, aplique solução de álcool de ácido clorídrico a 1% por um breve período de 5-7 s.
4. Para intensificar a cor azul, trate os cortes com uma solução de amônia 1:400 por 1 min.
5. Após imersão em etanol a 75%, manche as seções com eosina por 36 s. Após a coloração, desidrate sequencialmente as seções com uma série ascendente de concentrações de etanol (80%, 90%, 95% e 100%), com cada etapa durando 3-5 s.
6. Por fim, cozer as secções a 37 °C no forno durante 10 min, aplicar algumas gotas de agente de vedação numa lâmina de vidro, cobrir a amostra com uma lamínula para as fixar no lugar e deixar secar naturalmente ao ar.

Na cirurgia de anastomose vascular, a lesão mecânica da parede do vaso pode ativar as células íntimas e desencadear a proliferação. Mudanças na velocidade e direção do fluxo sanguíneo após a anastomose também podem estimular a proliferação de células íntimas. O processo de remodelação vascular e a instabilidade de longo prazo do fluxo sanguíneo também podem estimular persistentemente as células íntimas, levando ao espessamento.

Para confi...

A anastomose vascular é uma técnica crucial na cirurgia de reconstrução vascular, com seu modelo animal desempenhando um papel fundamental no estudo dos mecanismos de reestenose pós-operatória. Este modelo oferece uma abordagem controlada para investigar alterações patológicas vasculares, particularmente na compreensão da origem da proliferação excessiva de células na neoíntima durante a reestenose. A fonte de proliferação de células musculares lisas (SMCs) torna-se uma ...

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Gostaríamos de estender nossos sinceros agradecimentos ao Prof. Qingbo Xu e Yanhua Hu da Universidade de Zhejiang por sua valiosa assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelas Fundações Nacionais de Ciências Naturais da China (números de concessão 82070502 e 32171099), pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (números de concessão 2025HJRC0035, 2024NSFSC0709) e pelo Projeto Conjunto da Universidade Médica Luzhou-Southwest (2024LZXNYDJ021, 2024LZXNYDJ014)