Разработка мышиной модели стеноза анастомотической артерии бедренной артерии

Здесь мы представляем мышиную модель анастомоза бедренной артерии, предлагая исследователям ценную животную модель для изучения и моделирования стеноза сосудистого анастомоза. Это развитие имеет решающее значение для улучшения нашего понимания патофизиологии, лежащей в основе этого состояния, и способствует более точным и эффективным исследованиям сосудистых заболеваний.

В сосудистой хирургии сосудистый анастомоз является распространенным реконструктивным методом, используемым для восстановления кровотока. Тем не менее, рестеноз анастомоза является частым послеоперационным осложнением, в первую очередь вызванным хирургическим вмешательством повреждением сосудов, гиперплазией интимы и воспалительными реакциями. Модель анастомоза бедренной артерии мыши широко используется для исследования механизмов рестеноза анастомоза и восстановления сосудов. Анастомоз бедренной артерии с микроскопическим контролем «конец в конец» позволяет точно моделировать сосудистые повреждения и процессы восстановления после операции, обеспечивая надежный экспериментальный инструмент для изучения патологических механизмов, связанных с рестенозом. Данное исследование направлено на совершенствование хирургической техники анастомоза бедренной артерии у мышей. Благодаря усовершенствованию хирургических методов и оптимизации технических деталей мы добились заметного повышения коэффициента успешности и воспроизводимости модели. Конкретные улучшения включают в себя усовершенствованные методы обработки сосудов во время операции, выбор шовных материалов и оптимизацию методов наложения швов для минимизации утечки анастомоза и послеоперационной окклюзии. В исследовании также подчеркивается наблюдение за гиперплазией интимы, сосудистым ремоделированием в месте анастомоза и долгосрочной проходимостью сосудов. Благодаря этим исследованиям мы предоставляем краткое и эффективное оперативное руководство по проведению анастомоза бедренной артерии у мышей, предлагая надежную техническую поддержку для экспериментальных исследований в сосудистой хирургии. Эта работа закладывает прочную основу для последующих исследований связанных механизмов и оценки терапевтического вмешательства.

Сосудистый анастомоз является фундаментальным методом в процедурах реваскуляризации, играя ключевую роль в восстановлении кровотока и способствуя восстановлению тканей. Тем не менее, возникновение гиперплазии интимы (ИГ) в месте анастомоза часто приводит к рестенозу, что значительно ухудшает долгосрочную проходимость сосудов и негативно влияет на клинические исходы и прогноз пациента ^1,2. ИГ тесно связана с интраоперационным повреждением сосудов, характеризующимся аномальной пролиферацией и миграцией гладкомышечных клеток (СМК) и чрезмерным отложением внеклеточного матрикса¹. Эти сложные и взаимосвязанные патологические процессы подчеркивают критическую необходимость выяснения точных механизмов ИГ для информирования о профилактических и интервенционных стратегиях против рестеноза.

Благодаря своей воспроизводимости и точному контролю, мышиные модели анастомоза бедренной артерии получили широкое применение в исследованиях восстановления сосудов и связанных с ним патологических механизмов ^3,4,5. Сквозной анастомоз у мышей позволяет точно моделировать послеоперационное повреждение анастомоза, обеспечивая динамическое наблюдение за ИГ и ремоделирование сосудов. Эти модели обеспечивают идеальную платформу для изучения взаимодействий между эндотелиальными клетками и SMC после операции и для оценки роли воспалительных реакций в развитии ИГ⁶. Сочетая гистологический анализ и обнаружение молекулярных биомаркеров, исследователи могут всесторонне определить ключевые факторы ИГ, предлагая критически важное представление о его основных механизмах и потенциальных терапевтических мишенях.

Развитие ИГ обусловлено множеством факторов, при этом гемодинамические изменения являются решающим фактором ^1,7,8. В анастомотическом участке области с низким напряжением сдвига и аномальным индексом колебательного сдвига (OSI) являются основными стимулами для пролиферации и миграции SMC ^1,7. Кроме того, несоответствие комплаенсу и турбулентный кровоток вокруг анастомоза усугубляют повреждение эндотелия, ускоряя прогрессирование ИГ⁸. Эти результаты подчеркивают необходимость оптимизации хирургических техник и выбора соответствующих материалов для смягчения патологических изменений в месте анастомоза.

В последние годы баллоны с лекарственным покрытием (DCB) продемонстрировали эффективность в снижении ИГ. Антипролиферативные средства, такие как паклитаксел, эффективно ингибируют пролиферацию и миграцию SMC, значительно снижая частоту рестеноза⁹. Тем не менее, проблемы сохраняются в системах с высоким потоком, таких как артериовенозные трансплантаты, где быстрые колебания напряжения сдвига и высокая скорость кровотока могут снизить эффективность DCBs¹. Будущие исследования должны быть сосредоточены на улучшении применимости ДКБ в различных гемодинамических средах, а также на использовании достижений биоматериаловедения для разработки более персонализированных и эффективных решений для послеоперационного рестеноза. В дополнение к локализованным вмешательствам,^{на развитие} ИГ существенно влияют такие системные факторы, как сахарный диабет, атеросклероз и эндотелиальная дисфункция. Таким образом, клинические стратегии должны отдавать приоритет комплексному лечению этих системных состояний для улучшения общего здоровья сосудов. В то же время, идентификация и мониторинг новых биомаркеров прогрессирования ИГ могут предоставить возможности для раннего вмешательства. Интеграция искусственного интеллекта в хирургическое планирование предлагает еще одно многообещающее направление, позволяющее вычислительно проектировать оптимизированные конфигурации анастомотиков, тем самым повышая показатели успеха операции и продлевая проходимость сосудов.

При изучении послеоперационной ИГ и связанных с ней патологических механизмов модель анастомоза бедренной артерии выделяется своей точностью и воспроизводимостью¹¹. Эта модель, использующая микрохирургические методы для создания сквозного анастомоза бедренной артерии у мышей, точно имитирует локализованную хирургическую травму в месте анастомоза. Преимущества этой модели становятся особенно очевидными по сравнению с такими моделями, как травмы, вызванные проволокой, или другими альтернативами. Основным техническим преимуществом модели анастомоза бедренной артерии является ее способность индуцировать высоколокализованное и контролируемое повреждение сосудов¹². Хирургическая травма позволяет целенаправленно воздействовать на область анастомоза, точно имитируя характер травмы, встречающийся в клинической сосудистой хирургии. Напротив, модели травм, индуцированных проволокой, хотя и более просты в технике, часто приводят к обширной эндотелиальной денудации, что затрудняет воспроизведение локализованной травмы, наблюдаемой в реальных операциях с использованием анастомоза. Кроме того, вариабельность глубины и степени повреждения, вызванного проводами, в разных исследованиях потенциально снижает воспроизводимость результатов. Обширный и диффузный характер повреждений в моделях повреждений проволокой делает их менее актуальными для исследования локализованной ИГ, которая специфически связана с анастомотическими областями.

В этом исследовании, используя мышиную модель анастомоза бедренной артерии, мы систематически совершенствовали хирургические методы для повышения показателей успешности модели и обеспечения долгосрочной проходимости анастомотического участка. Опираясь на эту устоявшуюся основу, наше исследование углубилось в молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе ИГ, включая регуляторные пути, которые регулируют миграцию и пролиферацию СМК, а также роль медиаторов воспаления в прогрессировании ИГ. С помощью этого исследования мы стремимся внести новый теоретический вклад в механизмы постанастомотического рестеноза и создать экспериментальную основу для разработки терапевтических стратегий, специально нацеленных на ИГ.

Это исследование было одобрено, и с животными обращались в соответствии с Руководством по обращению с лабораторными животными и их использованию в Китае. Исследование строго соответствовало этическим требованиям экспериментов на животных и было одобрено Комитетом по этике животных (номер одобрения: SWMU20221109-019). Здесь для настоящего исследования были использованы 8-недельные здоровые мыши C57BL/6 любого пола весом от 20 до 22 г. Животные были размещены в Центре лабораторных животных Юго-Западного медицинского университета (SWMU).

1. Предоперационные процедуры

1. Обезболивайте мышей ингаляцией 3% изофлурана в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами. После начала анестезии убедитесь в полной потере рефлексов, такой как отсутствие реакции на защемление пальца ноги, чтобы обеспечить глубокую анестезию, прежде чем приступать к операции. После индуцирования анестезии уменьшите концентрацию изофлурана до 1%-1,5% для поддержания обезболивающего состояния, гарантируя, что животные остаются в глубокой анестезии на протяжении всей хирургической процедуры.
2. Расположите мышь лежа на спине на хирургической платформе, вытягивая задние конечности без чрезмерного растяжения.
3. Нанесите крем для депиляции на область бедер примерно на 1 минуту, чтобы удалить волосы, затем тщательно очистите область, чтобы удалить остатки крема и выбившиеся волоски.
4. Продезинфицируйте место операции раствором йода 3 раза, чтобы подготовиться к последующим хирургическим этапам.

2. Сосудистый анастомоз бедренной артерии

1. Под стереомикроскопом с помощью микроскальпеля сделайте разрез длиной примерно 1,5 см по оси бедренной кости в области средней части бедра. После разреза кожи выполните тупое рассечение для отделения подкожной клетчатки до тех пор, пока бедренная артерия и бедренная вена не обнажаются. Бедренная артерия расположена латерально к бедренной вене, а нерв расположен выше и латерально от артерии.
2. Тщательно рассеките ткань, чтобы полностью обнажить участок бедренной артерии длиной 1 см. С помощью гемостатических щипцов аккуратно разделите мышцы и глубокие фасции, чтобы обнажить нервы, артерию и вену. Во время этого процесса нерв располагается на самом внешнем слое, артерия – посередине, а вена – на внутреннем.
3. Аккуратно отделите бедренную артерию и бедренную вену с помощью тупого рассечения. Будьте осторожны при использовании тонких щипцов для отделения соединительной ткани, чтобы полностью обнажить бедренную артерию. Поместите стерильную подушечку под бедренную артерию, чтобы предотвратить случайное повреждение иглой во время процедуры. Впоследствии аккуратно зажмите бедренную артерию щипцами, чтобы вызвать гематому.
4. . С помощью небольших кровоостанавливающих щипцов зажмите проксимальный и дистальный концы бедренной артерии. С помощью тонких ножниц аккуратно и симметрично пересеките бедренную артерию.
5. Наберите 1% гепаринизированный физиологический раствор (1% гепарин в обычном физрастворе) в шприц объемом 1 мл для инъекции в анастомоз бедренной артерии. Добавляйте физиологический раствор по 3-4 капли за один раз, сделав несколько повторных полосканий, чтобы удалить сгустки крови из артерии.
6. Чтобы обеспечить поддержку сосуда во время последующего наложения швов и смоделировать потенциальное повреждение, вызванное вмешательством с помощью проводника, в бедренную артерию вставить хирургический шов длиной 1 см 6-0. Обеспечьте правильное выравнивание и гладкость бедренной артерии, чтобы облегчить процесс наложения швов.
7. Используйте хирургический шов 12-0 для анастомоза и отрегулируйте угол наклона иглы под микроскопом так, чтобы игла выходила с внутренней стороны на внешнюю сторону сосуда.
8. Создайте восемь мест прокола, четыре на проксимальном и четыре на дистальных концах бедренной артерии.
   1. Убедитесь, что места пункции расположены в передней, задней, левой и правой точках сосуда, с соответствующими участками на дистальном и проксимальном концах. При выборе этих точек убедитесь, что сосуд доступен, избегайте критических анатомических структур и поддерживайте хороший кровоток во время анастомоза.
   2. Диаметр прокола должен быть достаточно маленьким, чтобы свести к минимуму повреждение сосуда, но достаточно большим для проведения необходимых процедур. Для пункции обычно используется игла для наложения швов 12-0.
9. Вырежьте четыре отрезка шва 12-0, каждый длиной 3-4 см, и проденьте каждый через соответствующее отверстие для прокола. Начните с завязывания свободного узла, чтобы избежать запутывания швов.
10. Снимите шов 6-0, используемый для поддержки судна, и надежно завяжите узлы. Освободите гемостатические щипцы после завершения анастомоза.
11. Аккуратно соскребите бедренную артерию изогнутыми щипцами от проксимального к дистальному концу, чтобы проверить проходимость, убедившись, что кровь свободно течет по сосуду. Кроме того, внимательно осмотрите место анастомоза на наличие любых признаков явной утечки.

3. Послеоперационный шов

1. Сшивайте кожу нижней конечности с помощью хирургического шва 6-0, используя прерывистый шов для обеспечения точного выравнивания и безопасного сближения ткани. После наложения швов на рану нанесите на зашитый участок настойку йода, чтобы обеззаразить рану и еще больше снизить риск инфицирования.
2. Поддерживайте стерильные условия после операции. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Не возвращайте животных, перенесших операцию, в компанию других животных до полного выздоровления.

4. Послеоперационное наблюдение и забор проб

1. Регулярно осматривайте место операции на наличие признаков воспаления, чрезмерного отека или выделений. Задокументируйте состояние животного и при необходимости обеспечьте надлежащий уход.
2. Через 4 недели после операции гуманно усыпьте мышей в соответствии с утвержденными этическими принципами. Для эвтаназии введите передозировку пентобарбитала натрия (150 мг/кг, внутрибрюшинное введение), обеспечивая безболезненную и гуманную конечную точку. Как только потеря сознания и прекращение рефлексов подтверждены, начните забор тканей.
   Примечание: В предварительных исследованиях мы обнаружили, что сбор образцов в течение^3-й недели или ранее не способствует формированию гиперплазии интимы. И наоборот, сбор образцов на^5-й неделе приводил к чрезмерной гиперплазии интимы. Этот чрезмерный рост не только препятствовал наблюдению за последующими экспериментами, но и представлял потенциальную опасность для здоровья мышей. Так что здесь была выбрана^4-я неделя.
3. Соберите образцы бедренной артерии с центром в месте анастомоза, простираясь примерно на 1 см в обоих направлениях от анастомоза. С помощью тонких ножниц иссеките бедренную артерию вместе со всей окружающей мышечной тканью.
4. После иссечения образец промыть в PBS для удаления остатков крови, затем зафиксировать его в 10% нейтральном формалине на 1-2 дня для дальнейшей консервации и анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 10% нейтральный формалин является классическим выбором для фиксации тканей, эффективно сшивая белки и сохраняя целостность структуры ткани, что делает его особенно подходящим для длительного хранения тканей. Напротив, 4% параформальдегид (PFA) является более мягким фиксатором, который лучше подходит для более тонкого сохранения внутриклеточных структур (таких как нуклеиновые кислоты и белки) и обычно используется для иммуногистохимии или иммунофлуоресцентного анализа. Основной целью данного исследования является наблюдение за гистологическими изменениями в кровеносных сосудах (такими как гиперплазия интимы и ремоделирование сосудов), а не за точной локализацией внутриклеточных молекул или белков. Таким образом, фиксирующий эффект формалина достаточен для удовлетворения экспериментальных потребностей. Если исследование требует более высокой молекулярной точности (например, сохранения РНК или белков), PFA может быть лучшим выбором.

5. Обезвоживание и зарастание бедренной артерии

1. После фиксации поместите образцы в закладные коробки. Промойте образцы бедренной артерии проточной водой в течение 6-8 часов перед обработкой на предмет обезвоживания тканей с помощью автоматизированного тканевого процессора.
2. Залить расплавленный парафин в формы для закладки, осторожно подхватить бедренную артерию с помощью нагретых щипцов и вертикально вставить ее в форму, содержащую расплавленный парафин. Отделите крышку и дно закладочной коробки, расположив дно поверх закладной формы. Добавьте небольшое количество растопленного парафина, чтобы зафиксировать его на месте, послужив основой для парафинового блока. Пузырьков воздуха следует тщательно избегать.
3. Когда восковой блок остынет до такой степени, что на поверхности образуется прозрачная восковая пленка, поместите его на стол для замораживания для быстрого охлаждения.
4. Извлеките встроенный восковой блок из закладной формы и аккуратно обрежьте излишки парафина, окружающие тканевый блок, с помощью острого лезвия.

6. Подготовка парафиновых срезов бедренной артерии

1. Установите лезвие на микротом, убедившись, что нож острый для резки.
2. Закрепите парафиновый блок на держателе и отрегулируйте блок относительно лезвия в соответствующее положение для секционирования.
3. Обрежьте блок, чтобы убедиться, что внедренная ткань может быть полностью разрезана. Установите толщину начальных сечений равной 15-20 мкм.
4. Отрегулируйте толщину секции примерно до 4 мкм и приступайте к секционной обработке.
5. Аккуратно поднимите пряди с помощью щетки и перенесите их специальным тонким пинцетом в слайд-бокс, наполненный теплой водой (примерно 45 °C) для облегчения плавания.
6. Перенесите срезы разворота на предметные стекла микроскопа. Расположите направляющие под углом 45°, чтобы слить лишнюю воду. После этого поместите слайды в духовку для сушки, обычно при 37 °C в течение 2 часов, а затем выпекайте при 60 °C в течение 1 часа.

7. Окрашивание гематоксилин-эозином

1. Гидратируйте срезы, используя ряд дифференцированных концентраций этанола, включая абсолютный этанол, 95%, 80% и 70% этанола, при этом каждый этап занимает примерно 5 минут. Затем промойте секции дистиллированной водой, чтобы удалить остатки этанола.
2. Окрашивайте срезы гематоксилином примерно на 8-10 минут и тщательно промойте 3 раза проточной водой, чтобы удалить излишки пятна.
3. Для дифференциации окрашенных участков применяют 1% раствор соляной кислоты на короткий период 5-7 с.
4. Чтобы усилить синий цвет, обработайте срезы раствором нашатырного спирта 1:400 в течение 1 минуты.
5. После замачивания в 75% этаноле окрашивать срезы эозином в течение 36 с. После окрашивания последовательно обезвоживайте срезы с возрастающим рядом концентраций этанола (80%, 90%, 95% и 100%), причем каждый этап длится 3-5 с.
6. Наконец, запекайте срезы при температуре 37 °C в духовке в течение 10 минут, нанесите пару капель герметика на предметное стекло, накройте образец покровным стеклом, чтобы зафиксировать их на месте, и дайте ему высохнуть на воздухе естественным образом.

При хирургии сосудистого анастомоза механическое повреждение стенки сосуда может активировать клетки интимы и спровоцировать пролиферацию. Изменения скорости и направления кровотока после анастомоза также могут стимулировать пролиферацию клеток интимы. Процесс ?...

Сосудистый анастомоз является важнейшим методом в сосудистой реконструктивной хирургии, а его животная модель играет ключевую роль в изучении механизмов послеоперационного рестеноза. Эта модель предлагает контролируемый подход к исследованию сосудистых патологи?...

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Мы хотели бы выразить нашу искреннюю благодарность профессору Цинбо Сюй и Янхуа Ху из Чжэцзянского университета за их ценную техническую помощь. Эта работа была поддержана Национальными фондами естественных наук Китая (номера грантов 82070502 и 32171099), Сычуаньской научно-технической программой (номера грантов 2025HJRC0035, 2024NSFSC0709) и Совместным проектом Лучжоу-Юго-Западного медицинского университета (2024LZXNYDJ021, 2024LZXNYDJ014)