Epidermal Keratinosit Proliferasyon Kinetiğini İncelemek için Zaman Atlamalı Fotoğrafçılık ile Canlı Hücre Görüntüleme

Burada, 0 keratinositlerin soylarını manuel olarak izlemek için kullanılabilecek ve hücre bölünmesi kaderi ve hücre döngüsü süresi dahil olmak üzere proliferasyon ölçümlerinin toplanmasına izin veren canlı hücre görüntüleme analizi için bir yöntem sunuyoruz.

Canlı hücre görüntüleme, keratinosit davranışını in vitro olarak incelemek için gelişen ve biraz zorlayıcı bir yöntemdir. Tarihsel olarak, keratinosit bölünme davranışı klonal analiz, immün boyama ve hücre döngüsü analizi gibi yöntemlerle araştırılmıştır. Bu yöntemlerin hiçbiri, keratinosit davranışının tek hücre düzeyinde gerçek zamanlı olarak analizine izin vermez. Son on yılda, gruplar keratinosit kök hücrelerini ve taahhüt edilen progenitörleri etiketlemeye gerek kalmadan tanımlamak için canlı hücre görüntülemeyi kullandılar. Her bir grubun bölünme davranışında, terminal farklılaşma hızında ve hücre döngüsü süresinde farklılıklar tespit edilmiştir. Burada, hızlandırılmış fotoğrafçılık ile keratinosit canlı hücre görüntüleme ve analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemin in vivo davranışı en yakından taklit etmesi için geçişsiz keratinositlerin kullanılması önerilir. Canlı hücre görüntüleme, kök hücre ve işlenmiş progenitör davranışını tek hücre düzeyinde incelemek ve bölünme kaderlerini, hücre döngüsü süresini ve diğer proliferasyon ölçümlerini belirlemek için benzersiz bir yetenek sağlar.

Hücre popülasyonlarını uzun süreler boyunca genişledikçe gerçek zamanlı olarak in vitro olarak görselleştirme yeteneği, canlı hücre görüntülemenin benzersiz bir avantajıdır. Canlı hücre görüntüleme, hücre hareketliliğinin, göçünün ve proliferasyonunun tek hücre düzeyinde değerlendirilmesine olanak tanır. Bu protokolün amacı, keratinosit kültürlerinin hızlandırılmış fotoğrafçılık yoluyla görselleştirilmesini optimize etmek ve daha sonra hücresel davranış hakkında ayrıntılı veriler elde etmek için manuel olarak izlenebilen videolar üretmektir.

Odak noktamız proliferasyon kinetiğidir. Canlı hücre görüntüleme videolarının analizinden, soy ağaçları açıklanabilir ve bölünmeler arasındaki süre (hücre döngüsü süresi için bir vekil) ve ayrıca yavru hücrelerin farklılaşmasına karşı daha fazla bölünmeye yol açan bölünmelerin oranları değerlendirilebilir.

Primer keratinositlerle uğraşırken önemli donör-donör değişkenliği ve hücre yayılımında sık sık başarısız girişimler vardır. Bu nedenle, birçok araştırmacı, HaCaT hücreleri veya neonatal keratinositler gibi yüksek oranda proliferatif keratinositleri, genellikle in vitro^1'de birden fazla geçiş geçirdikten sonra kullanmayı tercih eder. Soy takibi amacıyla yetişkin veya yaşlı deriden birincil keratinositlerin kültürlenmesi zor olabilir. Bununla birlikte, hücre hatlarından veya erkek sünnet derisinden pasajlı hücrelerin kullanımı ile ilgili sorunlar vardır. Tekrarlanan pasaj, in vivo durum^2'den önemli ölçüde farklı hücrelerle sonuçlanır. Ayrıca, HaCaT hücrelerinin çoklu deneylerde^primer keratinositlerden farklı reaksiyona girdiği gösterilmiştir ^3,4,5. İn vivo muadillerine en çok benzeyen hücreleri kullanmak için, yetişkin insan donörlerinden alınan pasaj 0 keratinositleri kullanılır. Keratinosit kök hücreleri ve kararlı progenitörler, her iki popülasyondan kolonilerin canlı hücre görüntüleme yoluyla ayırt edilmesine izin veren belirgin davranış farklılıkları sergiler⁶. Tek keratinositlerin uzun vadedeki davranışını görselleştirmek için bu nispeten yeni yetenek, benzer teknikler kullanan önceki birkaç çalışmada kullanılmıştır^6,7,8. Bu protokol, IncuCyte S3 Canlı Hücre Analiz Sistemini kullanarak primer keratinositlerin canlı hücre görüntülemesini ana hatlarıyla belirtir. İnşa edilen soy ağaçlarından, koloni tipi (kök hücreye karşı taahhüt edilen progenitör), ayrıca hücre döngüsü süresi ve farklılaşma bölünmelerinin oranı belirlenebilir.

Bu çalışma Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm insan dokusu, Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco (UCSF) kurumsal inceleme kurulu (IRB) tarafından onaylandıktan sonra elde edildi ve kullanılan tüm dokular için onay alındı.

1. Geçiş 0 insan keratinositlerinin hızlandırılmış fotoğrafçılığı

NOT: Bu protokol IncuCyte S3 ve SX5'e özgüdür.

1. Çalışma için insan dokusunu kullanmak için kurumun insan araştırma komitesinden uygun onayların alındığından emin olun.
2. Keratinositleri daha önce tarif edildiği gibi taze ciltten izole edin⁹.
3. Tahlil için tohumlama yoğunluğunu belirleyin. Çalışma için yeterli kolonileri sağlamak, ancak gözlem süresi boyunca koloni örtüşmesine neden olan aşırı kolonileri önlemek için gereken hücre yoğunluğunu anlamak için farklı donörlerden alınan çoklu seyreltmelerde örneklerle pilot çalışmalar yapın. Bu pilotları aynı deneysel koşullar altında (aynı plakalar, reaktifler vb.) çalıştırın, çünkü bu faktörler sonuçları değiştirebilir.
   NOT: Çok düşük bir tohumlama yoğunluğu yetersiz büyümeye neden olurken, çok yüksek bir tohumlama yoğunluğu, tarladaki hücrelerin kalabalıklaşması nedeniyle hücrelerin doğru bir şekilde izlenememesine neden olur.
   1. Toplama ortamında 4 ° C'de saklanan bir koleksiyondan 48 saatin altındaki yenidoğan sünnet derilerinden elde edilen Passage 0 keratinositleri için tohumlama yoğunluğunun 1000-5000 /^cm2 olduğundan emin olun. P1 keratinositler için 500-2000 hücre /^cm2 kullanın. Geçiş ne kadar uzak olursa, tohumlama yoğunluğu o kadar düşük olur.
4. Seçilen plaka boyutundaki plaka hücreleri.
   NOT: 96 oyuklu plaka ve mikroplaka, menisküs etkisine sahiptir, bu da düzgün olmayan hücre dağılımına neden olur ve büyümenin çoğu görüntüleyici alanının dışındadır. Daha büyük kuyucuklu plakalar (örneğin 24 kuyulu plakalar) daha fazla verinin yakalanmasına izin verir. 24 kuyulu plaka, 36 adede kadar alanın görselleştirilmesine izin verirken, 96 kuyulu plaka sadece 5 alana kadar görselleştirmeye izin verir. Bununla birlikte, bir cihazda yakalanan alan sayısı sınırlıdır ve daha fazla alan, görüntüleyicinin kapasitesinin daha fazlasını tüketecektir. Tipik olarak, 24 oyuklu bir plaka kullanılır.
   1. Hücrelerin plaka üzerinde eşit bir şekilde dağılmasını sağlamak için çeşitli teknikler kullanılabilir. İlk olarak, her bir kuyucuğu ayrı ayrı tohumlamak yerine, tüm kuyucuklar için gereken toplam ortamı belirli bir seyreltmede bir mikrotüpe ayırın. Ardından, alikotun istenen yoğunluğa ulaşması için gereken toplam hücre sayısını pipetleyin ve hücreleri homojen bir şekilde dağıtmak için tüpü nazikçe ters çevirin.
   2. Kaplamadan sonra, plakayı üç kez çapraz düzende (yukarı-aşağı, sola-sağa) hareket ettirin ve ardından dikkatlice inkübatöre aktarın.
      DİKKAT: Bir mikroplaka kullanıyorsanız, hızlandırılmış mikroskop görüntüleme sırasında ısı üreteceğinden ve bu kuyucuklardaki ortamın buharlaşmasına neden olabileceğinden, kuyuların dış sıralarından ve sütunlarından kaçının. Deney kuyuları, plakanın merkezinde gruplandırılmalı ve buharlaşma/kenar etkilerini azaltmak için maksimum kapasitede PBS veya diğer steril sıvılar içeren kuyucuklarla çevrelenmelidir.
5. Yapışmayı sağlamak için hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 24 saat inkübe edin.
6. Medyayı 24 saat sonra değiştirin.
   NOT: Emme sırasında büyüyen tek tabakayı rahatsız etmeyin. Daima ısıtılmış ortam (37 °C) kullanın ve ortamı yan duvarı kullanarak kuyucuklara nazikçe akıtan. Burada kullanılan besiyeri Epilife/Supplement S7/Primosin'dir. Bu uygulama için uzun süreli canlı hücre görüntülemesi için besiyerlerinde antibiyotik kullanılması önerilir. Birden fazla eşzamanlı deney için kullanılan bir makinedeki genişletilmiş kültür, kontaminasyon için yüksek risk altındadır. Penisilin ve streptomisin yaygın olarak kullanılır.
7. Işık yeşil olduğunda tepsiyi açmak için sol alttaki büyük üçgen düğmeye basarak kuluçka makinesini açın. Gemiyi açık bir koya koyun. Ardından, sol alttaki aynı düğmeyi kullanarak tepsiyi kapatın. Açma düğmesi kırmızı olduğunda tepsiyi asla açmayın, çünkü bu, aktif olarak tarama yaptığı ve taramanın kesintiye uğrayacağı anlamına gelir.
   DİKKAT: Denetleyici modülündeki ekrana bakarak başlayan herhangi bir tarama olmadığından emin olun. Bir sonraki taramaya kadar geçen süreyi ve taramanın uzunluğunu söyler. Tarama başladıysa, tarama tamamlanana kadar geçen süreyi verecektir.
8. Uygulamayı bilgisayarda açın ve uygun kullanıcı kimliği ve şifreyi kullanarak oturum açın. Planla'yı seçin.
9. Plakayı programa eklemek için programın altında sol üst köşedeki + düğmesine basın.
10. Scan on Schedule'ı (Zamanlamaya Göre Tara) seçin, ardından Next (İleri) düğmesini tıklatın.
11. Yeni'yi seçin ve İleri'ye tıklayın.
    NOT: Bu plaka önceki veya devam eden bir deneyle aynıysa, denemenin biçimlendirilmesini hızlandırmak için Öncekini Kopyala veya Akımı Kopyala kullanılabilir.
12. Scan type (Tarama türü) için Standard (Standart ) seçeneğini belirleyin ve ardından Next (İleri) düğmesini tıklatın.
    NOT: Görüntü Kilidi, odak kaybı/görüntü atlama oluşumunu en aza indirmeye yardımcı olan tescilli bir 96 kuyulu plakadır ve bu sorunlarla karşılaşıldığında yardımcı olabilir. Diğer tarama türleri, köken izleme için özellikle kullanışlı değildir.
13. Tarama ayarları için, 10x objektifinde faz kanalını kullanarak Hücre Hücre Yapışık'ı seçin ve ardından İleri'ye tıklayın.
    NOT: Faz kanalı seçildiği sürece, veriler yakalandıktan sonra analiz başlatılabileceğinden, bu noktada herhangi bir analiz seçeneğinin seçilmesine gerek yoktur.
14. Gemiyi seçin, ardından İleri'ye tıklayın. En yaygın kaplar makineyle uyumludur, ancak mikroplaka olmayanların hızlandırılmış mikroskobun bölmelerine sığması için özel ataşmanlara ihtiyacı olabilir.
15. Gemiyi yerleştirmek için boş bir bölme seçin ve ardından İleri'ye tıklayın.
16. Taranacak kuyuları ve kuyu başına görüntüleri seçin, ardından İleri'ye tıklayın. Tahmini tarama süresi ekranın sol alt kısmında sağlanacaktır.
17. İstenen adlandırma kuralını kullanarak denemeyi adlandırın. İleride başvurmak üzere deneyin bir plaka haritasını oluşturun ve ardından Tamam'a basın. Son olarak, İleri'ye tıklayın.
18. Tarama tamamlandıktan sonra hücre hücre analizin başlatılması gerektiğinden, analizi veri toplama sonrasına erteleyin. Sonrakine tıkla.
19. Son olarak, görüntüleme sıklığını ayarlayın. 30 dakikadan fazla süren mitozları güvenilir bir şekilde izlemek için, keratinositler için 20 dakikalık aralıklarla tarayın. Deneyi başlatmak için İleri'ye basın ve ayarları onaylayın.
    NOT: Tarama süreleri çakışamaz ve üreticiler makinenin tarama yaptığı sürece hareketsiz kalmasını önerir. 20 dakikalık aralıklarla, bu da tarama için maksimum 10 dakika harcanması gerektiği anlamına gelir. 24 kuyulu bir plakanın 12 kuyusu, kuyu başına 36 görünümde görüntüleniyorsa, taramanın tamamlanması 7 dakika sürer, bu nedenle planlama yaparken deney için mevcut kaynaklara her zaman dikkat edin.
    1. Makinenin dinlenmesi için yeterli zaman yoksa bir bildirim verilir ve tarama süreleri çakışırsa, kap programa eklenemez. Gemi düzenli aralıklarla programa sığamıyorsa, Tepsi konumunu rezerve et'e tıklayın ve İleri'ye basın.
    2. Ekranın üst kısmındaki programa çift tıklayın ve yedekteki gemiyi seçin, ardından açık zaman dilimlerine resim eklemek için manuel olarak tıklayın. Alternatif olarak, zamanlanan tüm tarama zamanlarını silmek için zamanlama açıldıktan sonra sağ tıklatın ve bir tarama grubu için düzenli aralıklarla yeni tarama zamanları ayarlamak için sağ tıklatın.
       NOT: Bu, yeni saatler ayarlanana kadar o anda makinede bulunan tüm deneyleri kesintiye uğratır. Kaydetmek için disket simgesine veya programdaki değişiklikleri iptal etmek için kırmızı X işaretine basmayı unutmayın. İstenen kuyuların veya görünümlerin seçilmesi basit bir işlemdir, çünkü makine parametre seçiminin ardından tahmini tarama süresini hemen sağlar. Tarama süresi, seçilen plakanın türüne ve markasına ve ayrıca taranacak kuyucuk veya görünüm sayısına bağlıdır. Bu, kullanıcıların tarama parametrelerini makinenin kapasitesine uyacak şekilde ayarlamasına olanak tanır.
20. Keratinositler için, her 48 saatte bir ortamı değiştirin. Doğru plaka yönünü sağlamak için, makineye her kap yerleştirildiğinde ilk taramanın tamamlanmasını bekleyin (zaman izin verirse). Yapılması basit bir hatadır. Plakayı, sıraları gösteren harfler bölmenin sol tarafında olacak şekilde makineye yerleştirin.
    1. Taramaları görüntülemek için, göz simgeli Görünüm düğmesine basın ve ardından deneyi çift tıklayın. Ortamın renginde ani bir değişiklik varsa (fenol kırmızısı içeren ortamın asitlenme nedeniyle sararması), fazla ölü hücre varsa (canlı kolonilerin çoğalmasını engelleyebilir) veya anormal morfoloji gözlenirse, ortamı erken değiştirmeyi düşünün.
21. Tüm kuyular hareketsiz hale geldiğinde veya birleştiği yere ulaştığında, deneyi dışa aktarın. Yetişkin kolonileri ~ 2 hafta ve yenidoğan - 10 gün boyunca takip edin, bu süre zarfında kalabalık analizler için azalan getirilere neden olur.
22. Dışa aktarmak için, Görünüm sekmesini tıklatın ve son taramalar listesinin altındaki denemeyi çift tıklatın (varsayılan ayar, bunların en son geriye doğru sıralanmasıdır). Oklu Manzara simgesini tıklayın ve dışa aktarma aracının başlatılmasını bekleyin.
23. Görüntülendiği Gibi'yi tıklatın, sonra İleri'yi tıklatın.
24. Dışa aktarmak için her bir görüntü alanını elle tıklayın, sonra İleri'yi tıklayın.
25. Bir filmin mi yoksa bir dizi görüntünün mü istendiğini seçin ve ardından dışa aktarılacak tarama sürelerini seçin. Keratinosit soy takibi için film seçeneğini kullanın ve tüm taramaları seçin (bunu hızlandırmak için kesikli bir çizgiye sahip hızlı bir Tümünü seç simgesi vardır). Sonrakine tıkla.
26. Maksimum kalitede saniyede 1 kare hızında dışa aktarın (bunu kalitenin yanındaki çubuğu kullanarak ayarlayın). Sonrakine tıkla.
27. Hedef klasörü ve dosya türünü seçin. Dosyayı adlandırın ve ardından Dışa Aktar'ı tıklatın.
    NOT: Videoların dışa aktarılması, internet bağlantısının hızına ve ilgili bilgisayara bağlı olarak uzun zaman alabilir. Daha büyük deneyler için tüm video dosyalarını dışa aktarmak için birkaç gün beklemeye hazır olun. Hızlandırılmış mikroskoba uzaktan giriş yapabilme özelliğine sahip olmak son derece kullanışlıdır.

2. Soy ağaçları oluşturmak ve veri sayfaları oluşturmak için hızlandırılmış görüntülemeyi kullanma

1. Bir medya oynatıcı kullanarak video dosyasını açın. VLC medya oynatıcı önerilir.
2. Videolar arasında gezinin ve büyüyen kolonileri belirleyin. VLC ile kareleri ileri ve geri atlamak için ok tuşunu kullanın. İzlenecek koloninin ekran görüntüsünü alın ve koloniyi etiketleyin.
3. Birkaç günlük video kaydının sonunda veya sonrasında ilgilenilen bir koloniyi tanımlayın, ardından videoyu geri sarın ve koloni oluşturan hücreyi tanımlayın.
   NOT: Uygun tohumlama yoğunluğuna sahip olmanın önemli olduğu yer burasıdır. Yan yana çok fazla koloni gelişirse, genişler ve birbirleriyle birleşirler, bu da hücre bölünmelerini doğru bir şekilde izlemeyi imkansız hale getirir.
4. Bir hücre bölünmek üzereyken, yoğunlaşmış gibi görünür (Şekil 1). Bölme gerçekleştiğinde videoyu duraklatın. Bölme zamanını kaydedin (sol alt köşede bir zaman damgası vardır). Bu ilk bölünmenin ekran görüntüsünü alın ve ona koloni ile aynı etiketi verin. Bölümleri elle çizilmiş bir soy diyagramına kaydedin (bkz. Mümkün olduğu kadar çok nesli izlemeye ve belgelemeye devam edin.
   NOT: Otomatik hücre izleme, bu süreci hızlandırmak ve hücreleri daha doğru bir şekilde izlemek için geliştirilmektedir⁷. Minimum farklılaşma ile düşük kalsiyum kültürü koşullarında bile, makine öğrenimi modelleri şu anda keratinosit bölünmelerini doğru bir şekilde izleme hassasiyetinden yoksundur.
5. Manuel köken ağacını veri sayfalarına dönüştürün - elektronik tablodaki renk nedeniyle "yeşil sayfalar" olarak adlandırılır (Ek Dosya 1).
6. Proliferatif ve farklılaşma bölünmelerinin oranlarını hesaplamak, kök hücreyi ve taahhüt edilmiş progenitör kolonileri ve hücre döngüsü süresini belirlemek için yeşil sayfaları kullanın (temsili sonuçlara bakınız).
   NOT: Makine, birden fazla başka tahlil (birleşme, çizik) çalıştırmak için kendi temel ve hücre hücre analizörleri aracılığıyla verileri analiz edebilir. Ancak bu, bu protokolün kapsamı dışındadır.

Primer keratinositler, canlı hücre görüntüleme ile izlenebilen kalıplaşmış bir şekilde büyür. VLC medya oynatıcı, kayıtları araştırmak için kullanılır. İlk bölünmeye kadar geçen süre değişkendir ve donörün yaş, sağlık durumu veya in vitro ortamda bulunan büyüme faktörleri gibi özelliklerine bağlı olarak birkaç gün olabilir. İlk tohumlamada, keratinositler küçük, yuvarlak bir görünüme sahiptir (Şekil 1). Tohumlamadan sonra, koloni oluşturan keratinositler tipik olarak düzleşir (Şekil 1). Bu düzleştirilmiş keratinositler, bölünmeyen muadillerinden daha hareketli olma eğilimindedir (Ek Video 1). Bölünmeden hemen önce, düzleşmiş keratinosit merkezi olarak yoğunlaşıyor gibi görünmektedir (Şekil 1).

İlk bölünme dışında, bölünecek olan keratinositlerin% 95'i (proliferatif - P) bunu önceki bölünme^6'nın 48 saati içinde yapar. Olmayanlar terminal olarak farklılaşmış olarak kabul edilir (D) (Şekil 1)⁶. Bu farklılaşmış hücreler, gözlem süresinin sonuna kadar veya plakadan kalkana kadar bağlı kalır ve sonraki ortam değişikliğinde çıkarılır. Farklılaşan hücreler zamanla genişleme eğilimindedir ve bu da keratinosit kolonisinin düzgün olmayan morfolojisine neden olur (Şekil 1). Gözlem süresi sona erdiğinde videoları dışa aktarın ve analize başlayın (Şekil 2).

Koloniler standartlaştırılmış bir süreç kullanılarak belgelenir. Koloninin bulunduğu video öneki (A1, A2..., B1, B2...) ve ardından koloni numarası kullanılır. Örneğin, A2-6 video A2, koloni 6 olacaktır. Analiz, köken izleme ile başlar. Kolonileri tanımlamak için bir videonun sonuna hızlı bir şekilde ilerleyin, ardından orijinal koloni oluşturan hücreyi tanımlamak için gözlem süresinin başına geri sarın. Tüm bölümlerin zaman damgalarını oluştukları anda takip edin ve mümkün olduğu kadar çok nesli doğru bir şekilde izleyerek elle dallı bir diyagram oluşturun (Şekil 3). Sonunda, hücresel yoğunluğa bağlı olarak hücre bölünmelerini doğru bir şekilde izlemek artık mümkün değildir (bu, koloninin bir kök hücreden mi yoksa kararlı bir progenitörden mi kaynaklandığına bağlı olarak genellikle 5-7. nesil civarında olur). Daha sonraki nesillerde, koloni genellikle başka bir koloni ile birleşir veya koloni ekran dışına çıkar. Bu noktada, son izlenebilir hücreyi U (izlenemez) olarak işaretleyin. Her zaman izlenen koloninin ekran görüntüsünü alın (bu, VLC'deki anlık görüntü özelliği kullanılarak yapılabilir) ve yukarıda açıklanan isimlendirmeyi kullanarak koloniyi işaretleyin. Ekran görüntüsünü, analiz edilen belirli video ve ekran görüntüsüyle eşleştirilebilecek koloni numarası da dahil olmak üzere standartlaştırılmış terminoloji ile etiketlediğinizden emin olun.

Şube diyagramı oluşturulduktan sonra, veriler bir elektronik tabloya veya "yeşil sayfaya" (Ek Dosya 1) aktarılabilir. Yeşil sayfa, dal diyagramı aracılığıyla izlenen her koloni için aynı etiketi içerir. Nesilleri kolayca tanımlamak için, renk vurguları nesiller arasında değiştirilir. 1. neslin 1. zamanı, hücrelerin kaplanmasından hızlandırılmış mikroskoba yerleştirilmesine kadar geçen süreyi ifade eder. Ek Dosya 1'de, hücreler kaplamadan 24 saat sonra makineye yerleştirildiği için 1. neslin 1. zamanı 24 saattir. Zaman 2, hücrenin ilk bölünmesinden geçene kadar geçen süreyi temsil eder. Videolardaki zaman damgasının ek 24 saati hesaba katmadığını hatırlayın, bu nedenle saatlerin her nesilde manuel olarak eklenmesi gerekir. Şube diyagramından yeşil sayfaya veri aktarırken, makine tarafından sağlanan zaman damgası kayıt başlamadan önceki zamanı hesaba katmadığından, bölme zamanına her zaman 24 saat ekleyin. ΔT, hücre döngüsü süresidir. Çoğu çalışma ^6,8, analizlerde ilk neslin ΔT'sini içermez, çünkü her zaman sonraki nesillerinkinden çok daha uzun ve son derece değişkendir, bu da çarpık analizlere neden olur.

Yeşil tabaka oluşturulduktan sonra, hangi kolonilerin kök hücrelerden ve hangilerinin taahhüt edilmiş atalardan kaynaklandığı belirlenebilir. Ağırlıklı olarak proliferatif bölünmeler gösteren (Şekil 1) ve gözlem süresinin sonuna kadar süren koloniler kök hücre kolonileri⁶ olarak kabul edilir. Gözlem süresi boyunca terminal olarak farklılaşan koloniler (Şekil 1), taahhüt edilmiş progenitör koloniler⁶ olarak kabul edilir. Daha sonra sırasıyla kök hücre kolonilerinin ve taahhüt edilen progenitör kolonilerin ortalama ΔT'si hesaplanabilir. D bölünmelerinin oranını toplam bölünmelere bölerek, sırasıyla kök hücre / taahhüt edilmiş progenitör kolonilerin tüm havuzlanmış bölünmeleri ile veya nesle göre farklılaşma bölümlerinin oranı hesaplanabilir. Yeşil sayfa, bilgiyi verimli bir şekilde elde etmek için verileri düzenlemenin yararlı bir yoludur ve çalışmanın hedefleri için hangi veri ve istatistiklere ihtiyaç duyulduğuna bağlı olarak gelişir.

Şekil 1: Keratinosit morfolojisinde hücre bölünmesi ve bölünme terminolojisine yol açan değişiklikler. Keratinositler, hücre bölünmesine yol açan stereotipik bir morfolojik değişiklikler dizisi boyunca ilerler. Bu şekil, zaman içinde bu olaylar dizisine maruz kalan bir keratinositi göstermektedir. Bölünmek üzere olan bireysel hücreler hareketlidir ve başlangıçta düzleştirilmiş bir morfoloji alır ve bölünmeden hemen önce merkezi olarak yoğunlaşır. Çoğalmaya devam edecek olan yavru hücreler, üretildikten sonraki 48 saat içinde bölünürler, aksi takdirde terminal olarak farklılaşmış olarak kabul edilirler. Ölçek çubuğu 400 μm. BioRender'da oluşturuldu. Ghadially, R. (2025) https://BioRender.com/k40e714 Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Zaman atlamalı mikroskoptan veri aktarımı. Makineden verilerin nasıl dışa aktarılacağına ilişkin bir kılavuz. BioRender'da oluşturuldu. Ghadially, R. (2024) BioRender.com/x99d452 Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Yeşil sayfaların oluşturulmasını bildirmek için öncü dal diyagramı (soy ağacı). Tipik olarak elle çizilmiş bir soy ağacı örneği. Kısaltmalar: h: saat, m: dk. BioRender'da oluşturuldu. Ghadially, R. (2025) https://BioRender.com/wbt7z8x Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. Yayınlanmamış canlı hücre görüntüleme verilerinin örnek veri sayfaları (yeşil sayfalar). Yayınlanmamış verileri içeren örnek bir yeşil sayfa. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1. Örnek keratinosit canlı hücre görüntüleme videosu. Keratinosit kolonilerini izlemek için uygun hücre yoğunluğuna sahip bir canlı hücre görüntüleme videosu Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Keratinositlerin canlı hücre görüntülemesi, kök hücrelerin ve kararlı progenitörlerin bölünme davranışını izlemek için etiketsiz bir yöntemdir. Epidermisin bakımının kök hücrelerin ve taahhüt edilen progenitörlerin proliferasyon kinetiğine bağlı olduğu göz önüne alındığında¹⁰, bu keratinosit popülasyonlarındaki değişikliklerin ve bunların çeşitli koşullarda nasıl etkilendiğinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, keşfedilen kusurları iyileştirmek için tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırır.

Sonuç olarak, canlı hücre görüntüleme yoluyla soy izleme, kullanılabilir verilerin elde edilmesine bağlıdır. Koloni oluşturan birimlerin, hızlandırılmış fotoğrafçılık tarafından oluşturulan videolarda net bir şekilde görülebilmesi gerekir. Yeni izole edilmiş geçiş 0 hücreleri ile gerçek bir klonal yoğunluk elde etmek zordur. Plakalı keratinositlerin sadece% 3 -% 4'ü sonuçta koloniler oluşturur¹¹. Çok fazla hücre, bölünmeleri izlemeyi ve hatta ilk koloni oluşturan hücreyi tanımlamayı imkansız hale getirebilir. Çok az hücre ve koloni oluşmayabilir. Benzer şekilde, görme alanını engelleyen herhangi bir şey, soy takibi yoluyla hücrelerin izlenmesini imkansız hale getirir. Fibroblast besleyicilerin kullanılması, fibroblastlar görme alanını gizlediği için bölünmeleri izlemeyi zorlaştırabilir. Benzer şekilde, plakanın kapağındaki çökeltiler, hücresel kalıntılar ve hatta yoğunlaşma, büyüyen kolonileri gizleyebilir. Mikroplakanın seçilen bölmeye güvenli bir şekilde yerleştirilmesini sağlamamak kadar küçük bir şey bile, görüntü hücrelere odaklanmayacağı için sonuçta başarısız bir deneyle sonuçlanabilir. Bu nedenle, kolonileri makinede büyürken günlük olarak izlemek ve hücrelerin hızlandırılmış fotoğrafçılık tarafından yakalandığından emin olmak için, ortam değişiklikleri için mikroplaka makineden her çıkarıldığında her zaman ilk taramadan sonraya kadar kalmak çok önemlidir. Enkazın neden olabileceği bir diğer sorun da görüntü atlamadır. Tipik olarak, mikroskop hareket etmeyen sabit görsel alanlara sahiptir, ancak döküntü biriktiğinde veya hücre yoğunluğu çok yükseldiğinde, makine görüş alanını kaybedebilir ve plakanın farklı bir bölümüne atlayabilir. Bunu önlemek için, makinenin üreticileri, odak kaybını önleyen bir ızgaraya sahip özel bir 96 oyuklu plaka geliştirdi.

Makine, görüntü çekerken ısı üretir. Görüntü çekerken cihazın 37 °C'ye dengelenmesi için mikroskobu içeren inkübatörün sıcaklığının 36,5 °C'ye düşürülmesi önemlidir. Daha küçük yüzey alanlarına sahip plakalar (96 kuyulu plakalar) kullanırken, üretilen ek ısıyı göz önünde bulundurun. Çevresel kuyuları deneyler için kullanmayın (ilk ve son sıralar/sütunlar) ve deney kuyularını çevreleyen kuyuları diğer sıvılarla (steril PBS) maksimum düzeyde doldurmayı düşünün ve ortamın buharlaşma kaybını azaltmak için nefes alabilen bant kullanın. Kenar etkilerini en aza indirmek için araştırılabilecek pazarlanabilen plakalar vardır¹². Bununla birlikte, yukarıda belirtilen yöntemler, önerilen uyumlu mikroplakaların kullanımına izin vermiştir.

Videoları analiz ederken, araştırmacıların kolonilerinden gelen anormal bölünme modellerinin farkında olmaları gerekir. Örneğin, 10 gün boyunca bir görüş alanı içinde herhangi bir bölünme olmazsa ve daha sonra görüş alanının kenarından kaynaklanan yaygın bir koloni oluşumu varsa, bunun yeni bir koloninin ilk bölünmesi olması pek olası değildir. Çevredeki bir görsel alandan büyüyen bir koloninin, yeni bir koloni olmaktan ziyade, plakanın yakalanan kısmına tecavüz etmiş olması muhtemeldir. Bu, tüm plakayı (kaydedilen tüm görünümleri içeren) belirli zaman noktalarında gösterebilen ve hücrelerin bir görüş alanından diğerine geçişini gösterebilen yazılım paketine giriş yaparak doğrulanabilir.

Bu yöntemin birincil sınırlaması, emek yoğun doğasıdır. Ayrıca, 5^{. nesli geçen} hücre bölünmelerini izlemek zordur ve neyin ne zaman bölündüğünü doğru bir şekilde yakalamak için videoları yeniden izleyerek saatlerce çalışma gerektirir. Geliştirilmekte olan birden fazla derin öğrenme otomatik hücre izleme algoritması var ve bu da önümüzdeki yıllarda tamamen yapay zeka tabanlı analizlerle sonuçlanacak ^7,13,14. O zamana kadar, bu protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi manuel izleme, köken verilerini geliştirmek için uygun bir yöntemdir.

Hiç kimse.

Bu çalışma, Amerika Birleşik Devletleri'nden (ABD) CX001816 I01 Numaralı Merit İnceleme Ödülü ile desteklenmiştir. Gazi İşleri Bakanlığı Klinik Bilimler Ar-Ge (CSRD) Hizmeti. İçerikler, ABD Gazi İşleri Bakanlığı'nın veya Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin görüşlerini temsil etmemektedir. Deneylerimizi yürütmek için hızlandırılmış mikroskobuna erişmemizi sağladığı için Dr. Michael Rosenblum'a teşekkür ederiz.