הדמיית תאים חיים עם צילום בהילוך מהיר לחקר קינטיקה של התפשטות קרטינוציטים באפידרמיס

כאן, אנו מספקים שיטה לניתוח הדמיית תאים חיים שניתן להשתמש בה כדי לעקוב באופן ידני אחר השושלות של קרטינוציטים במעבר 0 ומאפשרת איסוף מדדי התפשטות, כולל גורל חלוקת התא ומשך מחזור התא.

הדמיית תאים חיים היא שיטה מתפתחת ומאתגרת במקצת לחקר התנהגות קרטינוציטים במבחנה. מבחינה היסטורית, התנהגות חלוקת קרטינוציטים נחקרה באמצעות שיטות כגון ניתוח שיבוט, צביעה חיסונית וניתוח מחזור התא. אף אחת מהשיטות הללו אינה מאפשרת ניתוח של התנהגות קרטינוציטים ברמת התא הבודד בזמן אמת. במהלך העשור האחרון, קבוצות השתמשו בהדמיית תאים חיים כדי לזהות תאי גזע של קרטינוציטים ואבות קדמונים מחויבים ללא צורך בתיוג. זוהו הבדלים בהתנהגות החלוקה של כל קבוצה בהתאמה, בקצב ההתמיינות הסופית ובמשך מחזור התא. כאן מתוארת שיטה להדמיית תאים חיים של קרטינוציטים עם צילום זמן-lapse וניתוחה. מומלץ להשתמש בקרטינוציטים שלא עברו כדי ששיטה זו תחקה בצורה הטובה ביותר התנהגות in vivo . הדמיית תאים חיים מספקת יכולת ייחודית לחקור תאי גזע והתנהגות אב מחויב ברמת התא הבודד ולקבוע גורלות חלוקה, משך מחזור התא, כמו גם מדדי התפשטות אחרים.

היכולת לדמיין אוכלוסיות תאים במבחנה בזמן אמת כאשר הן מתרחבות לפרקי זמן ממושכים היא יתרון ייחודי של הדמיית תאים חיים. הדמיית תאים חיים מאפשרת להעריך את תנועתיות התאים, נדידתם והתפשטותם ברמת התא הבודד. מטרת פרוטוקול זה היא לייעל את ההדמיה של תרביות קרטינוציטים באמצעות צילום זמן-lapse, ולייצר סרטונים שניתן לעקוב אחריהם באופן ידני כדי לקבל נתונים פרטניים על התנהגות תאית.

ההתמקדות שלנו היא בקינטיקה של התפשטות. מניתוח סרטוני הדמיית התאים החיים ניתן להבהיר עצי שושלת, ולהעריך את הזמן בין החלוקות (פרוקסי למשך מחזור התא), כמו גם את פרופורציות החלוקות המובילות לחלוקה נוספת לעומת התמיינות של תאי הבת.

קיימת שונות משמעותית בין תורם לתורם כאשר מתמודדים עם קרטינוציטים ראשוניים וניסיונות כושלים תכופים להתפשטות תאים. בשל כך, חוקרים רבים בוחרים להשתמש בקרטינוציטים בעלי שגשוג גבוה כגון תאי HaCaT או קרטינוציטים יילודים, לעתים קרובות לאחר שעברו מספר מעברים במבחנה¹. גידול קרטינוציטים ראשוניים מעור בוגר או מבוגר לצורך מעקב אחר שושלת יכול להיות מאתגר. עם זאת, ישנן בעיות בשימוש בתאים עוברים מקווי תאים או מעורלה זכרית. מעבר חוזר מביא לתאים השונים באופן משמעותי ממצב in vivo ² שלהם. יתר על כן, הוכח כי תאי HaCaT מגיבים בצורה שונה מקרטינוציטים ראשוניים בבדיקות מרובות ^3,4,5. כדי לנצל תאים הדומים ביותר לעמיתיהם in vivo, נעשה שימוש במעבר 0 קרטינוציטים מתורמים אנושיים בוגרים. תאי גזע קרטינוציטים ואבות מחויבים מציגים הבדלים מובהקים בהתנהגות, המאפשרים להבחין בין מושבות משתי האוכלוסיות באמצעות הדמיית תאים חיים⁶. יכולת חדשה יחסית זו לדמיין את התנהגותם של קרטינוציטים בודדים לטווח ארוך שימשה רק בכמה מחקרים קודמים תוך שימוש בטכניקות דומות ^6,7,8. פרוטוקול זה מתאר הדמיית תאים חיים של קרטינוציטים ראשוניים תוך שימוש במערכת ניתוח התאים החיים IncuCyte S3. מעצי השושלת שנבנים, ניתן לקבוע את סוג המושבה (תאי גזע לעומת אב קדמון מחויב), כמו גם משך מחזור התא ושיעור חלוקות ההתמיינות.

מחקר זה בוצע בהתאם להצהרת הלסינקי. כל הרקמות האנושיות הושגו לאחר אישור מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו (UCSF), והתקבלה הסכמה לכל הרקמות שנעשה בהן שימוש.

1. צילום בהילוך מהיר של מעבר 0 קרטינוציטים אנושיים

הערה: פרוטוקול זה הוא ספציפי ל-IncuCyte S3 ו-SX5.

1. ודא שהתקבלו אישורים מתאימים מוועדת המחקר האנושית של המוסד לשימוש ברקמות אנושיות למחקר.
2. בודד את הקרטינוציטים מעור טרי כפי שתואר קודם לכן⁹.
3. קבע את צפיפות הזריעה עבור הבדיקה. הפעל מחקרי פיילוט עם דגימות בדילולים מרובים מתורמים שונים כדי להבין את צפיפות התאים הדרושה על מנת להבטיח מושבות מספיקות למחקר אך למנוע מושבות מוגזמות שגורמות לחפיפה של מושבות לאורך תקופת התצפית. הפעל פיילוטים אלה בתנאי ניסוי זהים (אותם צלחות, ריאגנטים וכו'), מכיוון שגורמים אלה יכולים לשנות את התוצאות.
   הערה: צפיפות זריעה נמוכה מדי גורמת לצמיחה לא מספקת, בעוד שצפיפות זריעה גבוהה מדי גורמת לחוסר יכולת לעקוב במדויק אחר תאים עקב צפיפות התאים בשדה.
   1. עבור מעבר 0 קרטינוציטים מעורלות יילודים מתחת ל-48 שעות מאוסף המאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס באמצעי איסוף, ודא שצפיפות הזריעה היא 1000-5000/ס"מ². עבור קרטינוציטים P1, השתמש ב-500-2000 תאים/ס"מ². ככל שהמעבר רחוק יותר, כך צפיפות הזריעה נמוכה יותר.
4. תאי לוחית בגודל הלוח שנבחר.
   הערה: ל-96 לוחות באר ומיקרו-לוחות יש אפקט מניסקוס, וכתוצאה מכך התפלגות תאים לא אחידה, כאשר חלק גדול מהגידול נמצא מחוץ לשדה ההדמיה. צלחות עם בארות גדולות יותר (24 צלחות באר למשל) מאפשרות ללכוד יותר נתונים. 24 לוחות באר מאפשרים הדמיה של עד 36 שדות, בעוד ש-96 לוחות באר מאפשרים הדמיה של עד 5 שדות בלבד. עם זאת, מספר השדות שנלכדו במכשיר הוא סופי, ושדות נוספים ישתמשו יותר בקיבולת המצלם. בדרך כלל משתמשים בצלחת 24 בארות.
   1. כדי להשיג פיזור אחיד של תאים על הצלחת ניתן להשתמש בטכניקות שונות. ראשית, במקום לזרוע כל באר בנפרד, ציינו את סך המדיה הדרושה לכל הבארות בדילול ספציפי למיקרו-צינור. לאחר מכן, פיפטה את המספר הכולל של התאים הדרושים כדי שהאליקוט יגיע לצפיפות הרצויה והפוך בעדינות את הצינור כדי לפזר את התאים בצורה הומוגנית.
   2. לאחר הציפוי, הזיזו את הצלחת בתבנית צלב שלוש פעמים (למעלה-למטה, שמאלה-ימינה) ואז העבירו לחממה בזהירות.
      זהירות: אם אתה משתמש במיקרו-פלטה, הימנע מהשורות והעמודות החיצוניות של בארות, מכיוון שמיקרוסקופ זמן-lapse מייצר חום בעת הדמיה ועלול לגרום לאידוי המדיה בבארות אלה. יש לקבץ את בארות הניסוי במרכז הצלחת ולהקיף אותן בבארות המכילות PBS או נוזל סטרילי אחר בקיבולת מקסימלית כדי להפחית את השפעות האידוי/קצה.
5. דגרו על תאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ כדי לאפשר היצמדות.
6. החלף מדיה לאחר 24 שעות.
   הערה: אל תפריע לשכבה החד-שכבתית הגדלה בעת היניקה. השתמש תמיד במדיה מחוממת (37 מעלות צלזיוס) והזרם בעדינות מדיה לבארות באמצעות הקיר הצדדי. המדיה המשמשת כאן היא Epilife/Supplement S7/Primocin. השימוש באנטיביוטיקה במדיה להדמיית תאים חיים לטווח ארוך מומלץ ליישום זה. תרבית מורחבת במכונה המשמשת למספר ניסויים במקביל נמצאת בסיכון גבוה לזיהום. פניצילין וסטרפטומיצין נמצאים בשימוש נפוץ.
7. פתח את החממה על ידי לחיצה על הכפתור המשולש הגדול בפינה השמאלית התחתונה כדי לפתוח את המגש כאשר האור ירוק. הכניסו את הכלי למפרץ פתוח. לאחר מכן, סגור את המגש באמצעות אותו כפתור בפינה השמאלית התחתונה. לעולם אל תפתח את המגש כאשר כפתור הפתיחה אדום, מכיוון שמשמעות הדבר היא שהוא סורק באופן פעיל, והסריקה תופסק.
   התראה: ודא שאין סריקות שמתחילות על-ידי התבוננות במסך במודול הבקר. הוא מציין את השעה עד לסריקה הבאה ואת אורך הסריקה. אם הסריקה החלה, היא תיתן את הזמן עד להשלמת הסריקה.
8. פתח את היישום במחשב והיכנס באמצעות מזהה המשתמש והסיסמה המתאימים. בחר תזמון.
9. לחץ על כפתור + בפינה השמאלית העליונה מתחת ללוח הזמנים כדי להוסיף את הצלחת ללוח הזמנים.
10. בחר סריקה לפי לוח זמנים ולאחר מכן לחץ על הבא.
11. בחר חדש ולאחר מכן לחץ על הבא.
    הערה: אם צלחת זו זהה לניסוי קודם או פועל, ניתן להשתמש בהעתק קודם או העתק זרם כדי לזרז את עיצוב הניסוי.
12. בחר רגיל עבור סוג הסריקה ולאחר מכן לחץ על הבא.
    הערה: Image Lock היא צלחת קניינית של 96 בארות המסייעת למזער את התרחשות אובדן המיקוד/קפיצת תמונה, מה שיכול להיות מועיל אם מתמודדים עם בעיות אלה. סוגי הסריקה האחרים אינם שימושיים במיוחד למעקב אחר שושלת.
13. עבור הגדרות סריקה, בחר דבק תא אחר תא באמצעות ערוץ הפאזה במטרה של פי 10 ולאחר מכן לחץ על הבא.
    הערה: כל עוד נבחר ערוץ הפאזה, אין צורך לבחור אפשרות ניתוח בשלב זה, מכיוון שניתן להתחיל את הניתוח לאחר לכידת הנתונים.
14. בחר את כלי השיט ולאחר מכן לחץ על הבא. רוב הכלים הנפוצים תואמים למכונה, אם כי לא מיקרו-לוחות עשויים להזדקק לקבצים מצורפים מיוחדים כדי להתאים למפרצים של מיקרוסקופ הזמן-lapse.
15. בחר מפרץ ריק כדי למקם את כלי השיט ולאחר מכן לחץ על הבא.
16. בחר את הבארות לסריקה וכן את התמונות לכל באר ולאחר מכן לחץ על הבא. משך הסריקה המשוער יסופק בפינה השמאלית התחתונה של המסך.
17. תן שם לניסוי באמצעות מוסכמת השמות הרצויה. צור מפת לוח של הניסוי לעיון עתידי, ואז לחץ על אוקיי. לבסוף, לחץ על הבא.
18. דחה את הניתוח עד לאחר איסוף הנתונים, מכיוון שיש להתחיל את הניתוח תא אחר תא לאחר השלמת הסריקה. לחץ על הבא.
19. לבסוף, הגדר את תדירות ההדמיה. על מנת לעקוב באופן אמין אחר מיטוזות, המתרחשות במשך 30 דקות, סרוק במרווחים של 20 דקות לאיתור קרטינוציטים. לחץ על הבא ואשר את ההגדרות כדי להתחיל בניסוי.
    הערה: זמני הסריקה אינם יכולים לחפוף, והיצרנים ממליצים שהמכשיר יהיה במנוחה כל עוד הוא סורק. במרווחים של 20 דקות, המשמעות היא שיש להקדיש 10 דקות לכל היותר לסריקה. אם 12 בארות של צלחת של 24 בארות מצולמות ב-36 צפיות לבאר, לוקח 7 דקות להשלמת הסריקה, לכן תמיד שימו לב למשאבים הזמינים לניסוי בעת התכנון.
    1. יש הודעה אם אין מספיק זמן למכונה לנוח, ואם זמני הסריקה חופפים אז לא ניתן להוסיף את כלי השיט ללוח הזמנים. אם כלי השיט לא יכול להתאים ללוח הזמנים במרווח קבוע, לחץ על שמור מיקום מגש ולחץ על הבא.
    2. לחץ פעמיים על לוח הזמנים בחלק העליון של המסך ובחר את כלי השיט בשמורה ולאחר מכן לחץ ידנית כדי להוסיף תמונות במשבצות זמן פתוחות. לחלופין, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני לאחר פתיחת לוח הזמנים כדי למחוק את כל זמני הסריקה המתוזמנים ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להגדיר זמני סריקה חדשים עבור קבוצת סריקה במרווח זמן קבוע.
       הערה: זה יפריע לכל הניסויים הנוכחיים במכונה עד שייקבעו זמנים חדשים. אל תשכח ללחוץ על סמל התקליטון כדי לשמור או על ה-X האדום כדי לבטל שינויים בלוח הזמנים. בחירת הבארות או התצוגות הרצויות היא תהליך פשוט, מכיוון שהמכונה מספקת מיד את זמן הסריקה המשוער עם בחירת הפרמטר. משך הסריקה תלוי בסוג ובמותג של הצלחת שנבחרה, כמו גם במספר הבארות או הנופים שיש לסרוק. זה מאפשר למשתמשים להתאים את פרמטרי הסריקה כך שיתאימו לקיבולת המכשיר.
20. עבור קרטינוציטים, החלף מדיה כל 48 שעות. כדי להבטיח כיוון נכון של הצלחת, המתן להשלמת הסריקה הראשונה בכל פעם שמכניסים כלי למכונה (אם הזמן מאפשר זאת). זו טעות פשוטה. הנח את הצלחת במכונה כך שהאותיות המציינות את השורות יהיו בצד שמאל של המפרץ.
    1. כדי להציג סריקות, לחץ על כפתור התצוגה עם סמל העין ולאחר מכן לחץ פעמיים על הניסוי. שקול לשנות את המדיה מוקדם אם יש שינוי פתאומי בצבע המדיה (מדיה המכילה פנול אדום הופכת לצהובה עקב החמצה), אם יש עודף תאים מתים (יכול להפריע לשגשוג מושבות חיות), או אם נצפתה מורפולוגיה חריגה.
21. לאחר שכל הבארות הפכו שקטות או הגיעו למפגש, ייצא את הניסוי. עקוב אחר מושבות בוגרות במשך ~ שבועיים ויילודים במשך ~ 10 ימים, ואז צפיפות גורמת לירידה בתשואות לניתוחים.
22. כדי לייצא, לחץ על הכרטיסייה תצוגה ולחץ פעמיים על הניסוי תחת רשימת הסריקות האחרונות (ברירת המחדל היא להזמין אותן מהסריקה האחרונה לאחור). לחץ על נוף סמל עם החץ והמתן להפעלת כלי הייצוא.
23. לחצו על 'כפי שמוצג' ולאחר מכן לחצו על 'הבא'.
24. לחץ ידנית על כל שדה תצוגה כדי לייצא ולאחר מכן לחץ על הבא.
25. בחר אם ברצונך ליצור סרט או סדרת תמונות, ולאחר מכן בחר את זמני הסריקה לייצוא. למעקב אחר שושלת קרטינוציטים, השתמש באפשרות הסרט ובחר את כל הסריקות (יש סמל מהיר של בחר הכל עם קו מקווקו כדי לזרז זאת). לחץ על הבא.
26. יצא במהירות של פריים אחד לשנייה באיכות מקסימלית (הגדר זאת באמצעות הסרגל שליד איכות). לחץ על הבא.
27. בחר את תיקיית היעד ואת סוג הקובץ. תן שם לקובץ ולאחר מכן לחץ על ייצוא.
    הערה: ייצוא סרטוני וידאו עשוי להימשך זמן רב, בהתאם למהירות חיבור האינטרנט והמחשב המעורב. היו מוכנים להמתין מספר ימים כדי לייצא את כל קבצי הווידאו לניסויים גדולים יותר. היכולת להיכנס למיקרוסקופ זמן-lapse מרחוק היא נוחה ביותר.

2. שימוש בהדמיית זמן-lapse לבניית עצי שושלת ויצירת גיליונות נתונים

1. פתח את קובץ הווידאו באמצעות נגן מדיה. נגן מדיה VLC מומלץ.
2. גלול בין הסרטונים וזהה מושבות צומחות. עם VLC, השתמש במקש החץ כדי לדלג על פריימים קדימה ואחורה. צלם צילום מסך של המושבה למעקב ותייג את המושבה.
3. זהה מושבה מעניינת בסוף או אחרי כמה ימים של הקלטת וידאו, ואז החזר את הסרטון לאחור וזהה את התא היוצר מושבה.
   הערה: זה המקום שבו צפיפות הזריעה המתאימה חשובה. אם יותר מדי מושבות מתפתחות אחת ליד השנייה, הן מתרחבות ומתמזגות זו לתוך זו מה שהופך את זה לבלתי אפשרי לעקוב במדויק אחר חלוקת התאים.
4. כאשר תא עומד להתחלק, הוא נראה כאילו הוא מתעבה (איור 1). השהה את הסרטון כאשר החלוקה מתרחשת. רשום את שעת החלוקה (חותמת זמן נמצאת בפינה השמאלית התחתונה). צלמו את החלוקה הראשונית הזו ותנו לה את אותה תווית כמו המושבה. רשום את החלוקות בתרשים שושלת מצויר ביד (ראה תוצאות מייצגות). המשך לעקוב ולתעד דורות רבים ככל האפשר.
   הערה: מעקב אוטומטי אחר תאים פותח כדי לזרז את התהליך ולעקוב בצורה מדויקת יותר אחר תאים⁷. אפילו בתנאי תרבית סידן נמוכה עם בידול מינימלי, מודלים של למידת מכונה חסרים כיום את הרגישות לעקוב במדויק אחר חלוקות קרטינוציטים.
5. תמלל עץ שושלת ידני לגיליונות נתונים - כך נקרא "גיליונות ירוקים" בגלל הצבע בגיליון האלקטרוני (קובץ משלים 1).
6. השתמש בגיליונות הירוקים כדי לחשב את הפרופורציות של חלוקות התפשטות והתמיינות, לזהות תאי גזע ומושבות אב מחויבות ומשך מחזור התא (ראה תוצאות מייצגות).
   הערה: המכונה מסוגלת לנתח נתונים באמצעות מנתחי בסיס ותא אחר תא משלה כדי להריץ מספר בדיקות אחרות (מפגש, שריטה). עם זאת, זה מעבר להיקף של פרוטוקול זה.

קרטינוציטים ראשוניים גדלים בצורה סטריאוטיפית, שניתן לעקוב אחריה באמצעות הדמיית תאים חיים. נגן המדיה VLC משמש לסקר הקלטות. הזמן עד לחלוקה הראשונה משתנה ויכול להיות מספר ימים בהתאם למאפייני התורם, כגון גיל, מצב בריאותי או גורמי הגדילה הקיימים בסביבת מבחנה . עם הזריעה הראשונית, לקרטינוציטים יש מראה קטן ומעוגל (איור 1). אחרי הזריעה, הקרטינוציטים שיוצרים מושבה בדרך כלל הופכים שטוחים (איור 1). קרטינוציטים שטוחים אלה נוטים להיות ניידים יותר מעמיתיהם שאינם מתחלקים (סרטון משלים 1). מיד לפני החלוקה, נראה שהקרטינוציט השטוח מתעבה במרכז (איור 1).

למעט החלוקה הראשונית, 95% מהקרטינוציטים שהולכים להתחלק (פרוליפרטיב - P) עושים זאת תוך 48 שעות מהחלוקה^{הקודמת 6}. אלה שאינם נחשבים מובחנים סופית (D) (איור 1)⁶. תאים ממוינים אלה נשארים דבוקים עד סוף תקופת התצפית או עד שהם מתרוממים מהצלחת ומוסרים בהחלפת המדיה שלאחר מכן. תאים שמתמיינים נוטים להתרחב עם הזמן, וכתוצאה מכך מורפולוגיה לא אחידה של מושבת הקרטינוציטים (איור 1). ייצאו את הסרטונים לאחר סיום תקופת התצפית והתחילו בניתוח (איור 2).

מושבות מתועדות בתהליך סטנדרטי. נעשה שימוש בקידומת הווידאו שבה הייתה ממוקמת המושבה (A1, A2..., B1, B2...), ואחריה מספר המושבה. לדוגמה, A2-6 יהיה וידאו A2, מושבה 6. הניתוח מתחיל במעקב אחר שושלת. הרץ קדימה לסוף הסרטון כדי לזהות מושבות, ואז חזור אחורה לתחילת תקופת התצפית כדי לזהות את התא המקורי שיוצר מושבה. עקוב אחר חותמות הזמן של כל החלוקות בזמן שהן מתרחשות וצור דיאגרמה מסועפת ביד, תוך מעקב מדויק אחר כמה שיותר דורות (איור 3). בסופו של דבר כבר לא ניתן לעקוב במדויק אחר חלוקת התאים בשל צפיפות התאים (זה קורה בדרך כלל בסביבות דור 5-7, תלוי אם המושבה מקורה בתאי גזע לעומת אב קדמון מחויב). בדורות מאוחרים יותר, המושבה מתמזגת לעתים קרובות עם מושבה אחרת, או שהמושבה נעלמת מהמסך. בשלב זה, סמן את התא האחרון שניתן לעקוב אחריו כ- U (לא ניתן למעקב). צלם תמיד צילום מסך של המושבה שעוקבת אחריה (ניתן לעשות זאת באמצעות תכונת תמונת המצב ב-VLC) וסמן את המושבה באמצעות המינוח המתואר לעיל. הקפד לתייג את צילום המסך במינוח סטנדרטי, כולל הסרטון הספציפי שנותח ומספר המושבה שניתן להתאים לצילום המסך.

לאחר בניית דיאגרמת הענף, ניתן להעביר נתונים לגיליון אלקטרוני או "גיליון ירוק" (קובץ משלים 1). הגיליון הירוק מכיל את אותה תווית עבור כל מושבה שעוקבת אחריה באמצעות דיאגרמת ענפים. כדי לזהות בקלות את הדורות, הדגשות צבע מתחלפות בין הדורות. זמן 1 של דור 1 מתייחס לתקופה שבין ציפוי התאים להצבתם במיקרוסקופ זמן-lapse. בקובץ משלים 1, זמן 1 של דור 1 הוא 24 שעות, מכיוון שהתאים מונחים על המכונה 24 שעות לאחר הציפוי. זמן 2 מייצג את משך הזמן עד שהתא יעבור את החלוקה הראשונה שלו. נזכיר כי חותמת הזמן בסרטונים אינה מתייחסת ל-24 השעות הנוספות ולכן יש להוסיף את השעות באופן ידני בכל דור. בעת תמלול נתונים מתרשים הענף לגיליון הירוק, הוסף תמיד 24 שעות לזמן החלוקות מכיוון שחותמת הזמן המסופקת על ידי המכונה אינה לוקחת בחשבון את הזמן לפני תחילת ההקלטה. ΔT הוא משך מחזור התא. רוב המחקרים ^6,8 אינם כוללים את ה-ΔT של הדור הראשון בניתוחים, מכיוון שהוא תמיד ארוך בהרבה מזה של הדורות הבאים ומשתנה מאוד, וכתוצאה מכך ניתוחים מוטים.

לאחר בניית היריעה הירוקה, ניתן לקבוע אילו מושבות מקורן בתאי גזע ואילו מקורן באבות קדמונים. מושבות שמציגות חלוקות שגשוג בעיקר (איור 1) ונמשכות עד סוף תקופת התצפית נחשבות למושבות תאי גזע⁶. מושבות שמתמיינות באופן סופי (איור 1) במהלך תקופת התצפית נחשבות למושבות אב מחויבות⁶. לאחר מכן ניתן לחשב את ה-ΔT הממוצע של מושבות תאי גזע ומושבות אב מחויבות, בהתאמה. על ידי חלוקת החלק היחסי של חלוקות D על פני סך החלוקות, ניתן לחשב את שיעור חלוקות ההתמיינות, או עם כל החלוקות המאוגדות של תאי גזע / מושבות אב מחויבות, בהתאמה או לפי דור. הגיליון הירוק הוא דרך שימושית לארגן נתונים כדי להשיג מידע ביעילות והוא מתפתח בהתאם לנתונים ולסטטיסטיקות הדרושים למטרות המחקר.

איור 1: שינויים במורפולוגיה של קרטינוציטים המובילים לטרמינולוגיה של חלוקת תאים וחלוקה. קרטינוציטים מתקדמים דרך רצף סטריאוטיפי של שינויים מורפולוגיים המובילים לחלוקת התא. איור זה מתאר קרטינוציט העובר את רצף האירועים הזה לאורך זמן. תאים בודדים העומדים להתחלק הם תנועתיים ומקבלים בתחילה מורפולוגיה שטוחה ומתעבים באופן מרכזי מיד לפני החלוקה. תאי בת שימשיכו להתרבות מתחלקים תוך 48 שעות מרגע היווצרותם, אחרת הם נחשבים מובחנים סופנית. סרגל קנה מידה 400 מיקרומטר. נוצר ב-BioRender. Ghadially, R. (2025) https://BioRender.com/k40e714 אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ייצוא נתונים ממיקרוסקופ זמן-lapse. מדריך כיצד לייצא נתונים מהמכשיר. נוצר ב-BioRender. Ghadially, R. (2024) BioRender.com/x99d452 אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3. דיאגרמת ענף מבשר (עץ שושלת) כדי ליידע על יצירת גיליונות ירוקים. דוגמה לעץ שושלת, בדרך כלל מצויר ביד. קיצורים: h: שעות, m: min. נוצר ב-BioRender. Ghadially, R. (2025) https://BioRender.com/wbt7z8x אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1. גיליונות נתונים לדוגמה (גיליונות ירוקים) של נתוני הדמיה של תאים חיים שלא פורסמו. גיליון ירוק לדוגמה המכיל נתונים שלא פורסמו. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

סרטון משלים 1. דוגמה לסרטון הדמיה של תאים חיים של קרטינוציטים. סרטון הדמיית תאים חיים עם צפיפות תאים מתאימה למעקב אחר מושבות קרטינוציטים אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

הדמיית תאים חיים של קרטינוציטים היא שיטה נטולת תוויות למעקב אחר התנהגות החלוקה של תאי גזע ואבות מחויבים. בהתחשב בכך שתחזוקת האפידרמיס תלויה בקינטיקה של התפשטות תאי גזע ואבות מחויבים¹⁰, הבנה פרטנית של השינויים באוכלוסיות הקרטינוציטים הללו וכיצד הם מושפעים בתנאים שונים מקלה על פיתוח טיפולים לשיפור פגמים שהתגלו.

בסופו של דבר, מעקב אחר שושלת באמצעות הדמיית תאים חיים תלוי בהשגת נתונים שמישים. היחידות היוצרות מושבה צריכות להיות גלויות בבירור בסרטונים שנוצרו על ידי צילום דולג זמן. עם תאי מעבר 0 מבודדים טריים, קשה להשיג צפיפות שיבוט אמיתית. רק 3%-4% מהקרטינוציטים המצופים יוצרים בסופו של דבר מושבות¹¹. יותר מדי תאים עלולים להפוך את זה לבלתי אפשרי לעקוב אחר חלוקות או אפילו לזהות את התא הראשוני היוצר מושבה. מעט מדי תאים, וייתכן שלא ייווצרו מושבות. באופן דומה, כל דבר שמסתיר את שדה הראייה הופך את זה לבלתי אפשרי לעקוב אחר תאים באמצעות מעקב אחר שושלת. שימוש במזינים פיברובלסטים עלול להקשות על מעקב אחר חלוקות מכיוון שפיברובלסטים מטשטשים את שדה הראייה. באופן דומה, משקעים, פסולת סלולרית ואפילו עיבוי על מכסה הצלחת יכולים לטשטש את המושבות הגדלות. אפילו משהו קטן כמו לא להבטיח שהמיקרו-פלטת מוכנסת היטב לתוך המפרץ שנבחר עלול בסופו של דבר לגרום לניסוי כושל, מכיוון שהתמונה לא תתמקד בתאים. זו הסיבה שחשוב מאוד לנטר את המושבות מדי יום בזמן שהן גדלות במכונה ולהישאר תמיד עד לאחר הסריקה הראשונה, בכל פעם שהמיקרו-פלטה מוסרת מהמכונה לצורך החלפת מדיה, כדי להבטיח שהתאים נלכדים על ידי צילום דולג זמן. בעיה נוספת שפסולת עלולה לגרום היא קפיצת תמונה. בדרך כלל, למיקרוסקופ יש שדות ראייה קבועים שאינם זזים, אך כאשר מצטבר פסולת, או צפיפות התאים גבוהה מדי, המכונה עלולה לאבד את שדה הראייה שלה ולקפוץ לחלק אחר של הצלחת. כדי להימנע מכך, יצרני המכונה פיתחו סוג מיוחד של צלחת 96 בארות עם רשת המונעת אובדן מיקוד.

המכונה מייצרת חום בעת צילום תמונות. חשוב להפחית את הטמפרטורה של החממה המכילה את המיקרוסקופ ל-36.5 מעלות צלזיוס כדי שהמכשיר יתאזן ל-37 מעלות צלזיוס בעת צילום תמונות. בעת שימוש בצלחות עם שטחי פנים קטנים יותר (צלחות 96 באר), קחו בחשבון את החום הנוסף שנוצר. אל תשתמש בבארות ההיקפיות לניסויים (שורות/עמודות ראשונות ואחרונות) ושקול למלא באופן מקסימלי את הבארות המקיפות בארות ניסיוניות בנוזל אחר (PBS סטרילי), והשתמש בסרט נושם כדי להפחית את אובדן האידוי של המדיה. ישנן צלחות המשווקות שניתן לחקור כדי למזער את השפעות הקצה¹². עם זאת, השיטות הנ"ל אפשרו שימוש במיקרו-פלטות תואמות מומלצות.

בעת ניתוח סרטונים, החוקרים צריכים להיות מודעים לדפוסי חלוקה חריגים מהמושבות שלהם. לדוגמה, אם אין חלוקות בתוך נוף במשך 10 ימים ואז יש היווצרות מושבה משתוללת שמקורה בקצה שדה הראייה, לא סביר שזו תהיה החלוקה הראשונה של מושבה חדשה. סביר להניח שמושבה צומחת משדה ראייה מסביב פלשה לחלק של הצלחת שנלכד במקום להיות מושבה חדשה. ניתן לאמת זאת על ידי כניסה לחבילת התוכנה, שיכולה לתאר את כל הלוח (המכיל את כל התצוגות המוקלטות) בנקודות זמן ספציפיות ולהראות את נדידת התאים משדה ראייה אחד למשנהו.

המגבלה העיקרית של שיטה זו היא אופייה עתיר העבודה. כמו כן, מעקב אחר חלוקות תאים מעבר לדור^החמישי הוא קשה ודורש שעות עבודה, צפייה חוזרת בסרטונים כדי ללכוד במדויק מה מתחלק ומתי. ישנם מספר אלגוריתמים אוטומטיים למעקב אחר תאים של למידה עמוקה המפותחים, אשר בסופו של דבר יביאו לניתוח מבוסס בינה מלאכותית בלבד בשנים הקרובות ^7,13,14. עד אז, מעקב ידני, כמו המפורט בפרוטוקול זה, הוא שיטה אפשרית לפיתוח נתוני שושלת.

ללא.

עבודה זו נתמכה על ידי פרס Merit Review מס' I01 CX001816 מארה"ב (ארה"ב) המחלקה לענייני חיילים משוחררים מדעים קליניים שירות מו"פ (CSRD). התוכן אינו מייצג את העמדות של המחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה"ב או של ממשלת ארצות הברית. אנו מודים לד"ר מייקל רוזנבלום על שסיפק לנו גישה למיקרוסקופ דולג הזמן שלו כדי לערוך את הניסויים שלנו.