Live-Zell-Imaging mit Zeitrafferfotografie zur Untersuchung der Proliferationskinetik der epidermalen Keratinozyten

Hier stellen wir eine Methode zur Bildgebung lebender Zellen zur Verfügung, mit der die Abstammungslinien von Keratinozyten der Passage 0 manuell verfolgt werden können und die die Erfassung von Proliferationsmetriken ermöglicht, einschließlich des Verschicksals der Zellteilung und der Zellzyklusdauer.

Die Bildgebung lebender Zellen ist eine sich entwickelnde und etwas herausfordernde Methode, um das Verhalten von Keratinozyten in vitro zu untersuchen. In der Vergangenheit wurde das Teilungsverhalten von Keratinozyten mit Methoden wie klonaler Analyse, Immunfärbung und Zellzyklusanalyse untersucht. Keine dieser Methoden ermöglicht es, das Verhalten von Keratinozyten auf Einzelzellebene in Echtzeit zu analysieren. In den letzten zehn Jahren haben Gruppen die Bildgebung lebender Zellen genutzt, um Keratinozyten-Stammzellen und verbindliche Vorläuferzellen zu identifizieren, ohne dass eine Markierung erforderlich war. Unterschiede wurden im Teilungsverhalten, der Rate der terminalen Differenzierung und der Zellzyklusdauer der jeweiligen Gruppe festgestellt. Hier wird ein Verfahren zur Bildgebung lebender Keratinozyten mit Zeitrafferfotografie und dessen Analyse beschrieben. Für diese Methode wird die Verwendung von nicht passageierten Keratinozyten empfohlen, um das In-vivo-Verhalten am ehesten nachzuahmen. Die Bildgebung von lebenden Zellen bietet eine einzigartige Möglichkeit, das Verhalten von Stammzellen und engagierten Vorläuferzellen auf Einzelzellebene zu untersuchen und das Schicksal der Teilung, die Dauer des Zellzyklus sowie andere Proliferationsmetriken zu bestimmen.

Die Möglichkeit, Zellpopulationen in vitro in Echtzeit zu visualisieren, während sie sich über längere Zeiträume ausdehnen, ist ein einzigartiger Vorteil der Lebendzellbildgebung. Die Bildgebung von lebenden Zellen ermöglicht die Beurteilung der Beweglichkeit, Migration und Proliferation von Zellen auf Einzelzellebene. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Visualisierung von Keratinozytenkulturen durch Zeitrafferfotografie zu optimieren und Videos zu produzieren, die dann manuell verfolgt werden können, um detaillierte Daten über das zelluläre Verhalten zu erhalten.

Unser Fokus liegt auf der Proliferationskinetik. Aus der Analyse der Live-Zell-Imaging-Videos können Abstammungsbäume aufgeklärt und die Zeit zwischen den Teilungen (ein Proxy für die Zellzyklusdauer) sowie die Anteile der Teilungen, die zu einer weiteren Teilung im Vergleich zur Differenzierung der Tochterzellen führen, bewertet werden.

Es gibt eine erhebliche Variabilität von Spender zu Spender beim Umgang mit primären Keratinozyten und häufige fehlgeschlagene Versuche der Zellvermehrung. Aus diesem Grund entscheiden sich viele Forscher für die Verwendung von stark proliferativen Keratinozyten wie HaCaT-Zellen oder neonatalen Keratinozyten, oft nachdem sie mehrere Passagen in vitro durchlaufen haben¹. Die Kultivierung von primären Keratinozyten aus erwachsener oder gealterter Haut zum Zwecke der Abstammungsverfolgung kann eine Herausforderung darstellen. Es gibt jedoch Probleme bei der Verwendung von passageierten Zellen aus Zelllinien oder aus der männlichen Vorhaut. Wiederholtes Passieren führt zu Zellen, die sich signifikant von ihrem in vivo-Zustand ^{unterscheiden 2}. Darüber hinaus wurde in mehreren Assays gezeigt, dass HaCaT-Zellen anders reagieren als primäre Keratinozyten ^3,4,5. Um Zellen zu verwenden, die ihren in vivo-Gegenstücken am ähnlichsten sind, werden Passage-0-Keratinozyten von erwachsenen menschlichen Spendern verwendet. Keratinozyten-Stammzellen und engagierte Vorläuferzellen weisen deutliche Unterschiede im Verhalten auf, die es ermöglichen, Kolonien aus beiden Populationen mittels Lebendzell-Imaging zu unterscheiden⁶. Diese relativ neue Fähigkeit, das Verhalten einzelner Keratinozyten über einen längeren Zeitraum sichtbar zu machen, wurde nur in wenigen früheren Studien mit^{ähnlichen Techniken genutzt 6,7,8}. Dieses Protokoll beschreibt die Bildgebung von primären Keratinozyten in lebenden Zellen unter Verwendung des IncuCyte S3 Lebendzellanalysesystems. Aus den konstruierten Stammbäumen kann der Kolonietyp (Stammzelle versus fester Vorläufer) sowie die Zellzyklusdauer und der Anteil der Differenzierungsteilungen bestimmt werden.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Das gesamte menschliche Gewebe wurde nach Genehmigung durch das Institutional Review Board (IRB) der University of California, San Francisco (UCSF) gewonnen, und für alle verwendeten Gewebe wurde die Zustimmung eingeholt.

1. Zeitrafferfotografie der Passage 0 menschlicher Keratinozyten

HINWEIS: Dieses Protokoll ist spezifisch für die IncuCyte S3 und SX5.

1. Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Genehmigungen des Humanforschungsausschusses der Institution für die Verwendung von menschlichem Gewebe für die Studie eingeholt wurden.
2. Isolieren Sie die Keratinozyten aus der frischen Haut, wie zuvor beschrieben⁹.
3. Bestimmen Sie die Aussaatdichte für den Assay. Führen Sie Pilotstudien mit Proben in mehreren Verdünnungen von verschiedenen Spendern durch, um die Zelldichte zu verstehen, die erforderlich ist, um eine ausreichende Anzahl von Kolonien für die Studie zu gewährleisten, aber übermäßige Kolonien zu verhindern, die zu einer Überlappung der Kolonien über den Beobachtungszeitraum führen. Führen Sie diese Pilotprojekte unter identischen Versuchsbedingungen (gleiche Platten, Reagenzien usw.) durch, da diese Faktoren die Ergebnisse verändern können.
   HINWEIS: Eine zu niedrige Aussaatdichte führt zu unzureichendem Wachstum, während eine zu hohe Aussaatdichte dazu führt, dass Zellen aufgrund der Überfüllung der Zellen auf dem Feld nicht genau verfolgt werden können.
   1. Für Passage 0-Keratinozyten aus neonatalen Vorhäuten unter 48 h aus einer Entnahme, die bei 4 °C in Entnahmemedien gelagert wurde, stellen Sie sicher, dass die Aussaatdichte 1000-5000/cm² beträgt. Für P1-Keratinozyten verwenden Sie 500-2000 Zellen/cm². Je weiter der Durchgang, desto geringer die Aussaatdichte.
4. Plattenzellen auf der ausgewählten Plattengröße.
   HINWEIS: 96-Well-Platten und Mikrotiterplatten haben einen Meniskuseffekt, der zu einer ungleichmäßigen Zellverteilung führt, wobei ein Großteil des Wachstums außerhalb des Feldes des Imagers liegt. Platten mit größeren Vertiefungen (z. B. 24-Well-Platten) ermöglichen die Erfassung von mehr Daten. 24-Well-Platten ermöglichen die Visualisierung von bis zu 36 Feldern, während 96-Well-Platten die Visualisierung von nur 5 Feldern ermöglichen. Die Anzahl der auf einem Instrument erfassten Felder ist jedoch begrenzt, und mehr Felder verbrauchen einen größeren Teil der Kapazität des Imagers. In der Regel wird eine 24-Well-Platte verwendet.
   1. Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Platte zu erreichen, können verschiedene Techniken eingesetzt werden. Anstatt jede Vertiefung einzeln zu bepflanzen, aliquotieren Sie zunächst das gesamte für alle Vertiefungen benötigte Medium bei einer bestimmten Verdünnung in ein Mikroröhrchen. Pipettieren Sie dann die Gesamtzahl der Zellen, die das Aliquot benötigt, um die gewünschte Dichte zu erreichen, und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um die Zellen homogen zu verteilen.
   2. Bewegen Sie die Platte nach dem Anrichten dreimal kreuzförmig (oben-unten, links-rechts) und geben Sie sie dann vorsichtig in den Inkubator.
      VORSICHT: Wenn Sie eine Mikroplatte verwenden, vermeiden Sie die äußeren Reihen und Spalten von Vertiefungen, da das Zeitraffermikroskop bei der Bildgebung Wärme erzeugt und zur Verdunstung des Mediums in diesen Vertiefungen führen kann. Die Versuchsvertiefungen sollten in der Mitte der Platte gruppiert und von Vertiefungen umgeben werden, die PBS oder eine andere sterile Flüssigkeit mit maximaler Kapazität enthalten, um Verdunstungs-/Randeffekte zu reduzieren.
5. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO₂ , um eine Adhärenz zu ermöglichen.
6. Medienwechsel nach 24 h.
   HINWEIS: Stören Sie die wachsende Monoschicht beim Saugen nicht. Verwenden Sie immer erwärmte Medien (37 °C) und strömen Sie das Medium mit Hilfe der Seitenwand vorsichtig in die Vertiefungen. Das hier verwendete Medium ist Epilife/Supplement S7/Primocin. Für diese Anwendung wird der Einsatz von Antibiotika in Medien für die Langzeitbildgebung lebender Zellen empfohlen. Erweiterte Kulturen in einer Maschine, die für mehrere gleichzeitige Experimente verwendet werden, sind einem hohen Kontaminationsrisiko ausgesetzt. Penicillin und Streptomycin werden häufig verwendet.
7. Öffnen Sie den Inkubator, indem Sie den großen dreieckigen Knopf unten links drücken, um das Tablett zu öffnen, wenn das Licht grün leuchtet. Stellen Sie das Schiff in eine offene Bucht. Schließen Sie dann das Fach mit der gleichen Taste unten links. Öffnen Sie das Fach niemals, wenn die Taste zum Öffnen rot ist, da dies bedeutet, dass der Scanvorgang aktiv ist und der Scanvorgang unterbrochen wird.
   VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass keine Scans gestartet werden, indem Sie auf den Bildschirm des Controller-Moduls schauen. Es zeigt die Zeit bis zum nächsten Scan und die Länge des Scans an. Wenn der Scanvorgang gestartet wurde, wird die Zeit bis zum Abschluss des Scans angezeigt.
8. Öffnen Sie die Anwendung auf dem Computer und melden Sie sich mit der entsprechenden Benutzerkennung und dem entsprechenden Kennwort an. Wählen Sie Zeitplan aus.
9. Drücken Sie die Schaltfläche + in der oberen linken Ecke unter dem Zeitplan, um die Platte zum Zeitplan hinzuzufügen.
10. Wählen Sie Nach Zeitplan scannen und klicken Sie dann auf Weiter.
11. Wählen Sie Neu aus und klicken Sie dann auf Weiter.
    HINWEIS: Wenn diese Platte mit einem vorherigen oder laufenden Experiment identisch ist, kann die Option "Vorherige kopieren " oder "Aktuell kopieren " verwendet werden, um die Formatierung des Experiments zu beschleunigen.
12. Wählen Sie Standard als Scantyp aus und klicken Sie dann auf Weiter.
    HINWEIS: Image Lock ist eine proprietäre 96-Well-Platte, die dazu beiträgt, das Auftreten von Fokusverlusten/Bildsprüngen zu minimieren, was hilfreich sein kann, wenn diese Probleme auftreten. Die anderen Scan-Typen sind für die Herkunftsverfolgung nicht besonders nützlich.
13. Wählen Sie für die Scan-Einstellungen die Option "Zelle für Zelle mit dem Phasenkanal bei 10x-Objektiv adhärent" aus und klicken Sie dann auf "Weiter".
    HINWEIS: Solange der Phasenkanal ausgewählt ist, muss an dieser Stelle keine Analyseoption ausgewählt werden, da die Analyse nach der Datenerfassung gestartet werden kann.
14. Wählen Sie das Schiff aus und klicken Sie dann auf Weiter. Die meisten gängigen Gefäße sind mit dem Gerät kompatibel, obwohl Nicht-Mikrotiterplatten möglicherweise spezielle Aufsätze benötigen, um in die Buchten des Zeitraffermikroskops zu passen.
15. Wählen Sie eine leere Bucht aus, in der das Schiff platziert werden soll, und klicken Sie dann auf Weiter.
16. Wählen Sie die zu scannenden Vertiefungen sowie die Bilder pro Vertiefung aus und klicken Sie dann auf Weiter. Die geschätzte Scandauer wird unten links auf dem Bildschirm angezeigt.
17. Benennen Sie das Experiment mit der gewünschten Namenskonvention. Erstellen Sie eine Tafelkarte des Experiments, um später darauf zurückgreifen zu können, und klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie abschließend auf Weiter.
18. Verschieben Sie die Analyse bis nach der Datenerfassung, da die Zell-für-Zell-Analyse nach Abschluss des Scanvorgangs gestartet werden muss. Klicken Sie auf Weiter.
19. Stellen Sie abschließend die Häufigkeit der Bildgebung ein. Um Mitosen, die über 30 Minuten auftreten, zuverlässig zu verfolgen, scannen Sie in 20-Minuten-Intervallen nach Keratinozyten. Drücken Sie auf Weiter und bestätigen Sie die Einstellungen, um das Experiment zu starten.
    HINWEIS: Die Scanzeiten dürfen sich nicht überschneiden, und die Hersteller empfehlen, dass das Gerät so lange im Ruhezustand ist, wie es scannt. Bei 20-Minuten-Intervallen bedeutet dies, dass maximal 10 Minuten für das Scannen aufgewendet werden sollten. Wenn 12 Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 36 Ansichten pro Vertiefung abgebildet werden, dauert es 7 Minuten, bis der Scan abgeschlossen ist, also denken Sie bei der Planung immer an die für das Experiment verfügbaren Ressourcen.
    1. Es gibt eine Benachrichtigung, wenn die Maschine nicht genügend Zeit zum Ausruhen hat und sich die Scanzeiten überschneiden, kann das Schiff nicht in den Fahrplan aufgenommen werden. Wenn das Schiff in regelmäßigen Abständen nicht in den Fahrplan passt, klicken Sie auf Tablettplatz reservieren und klicken Sie auf Weiter.
    2. Doppelklicken Sie auf den Fahrplan oben auf dem Bildschirm, wählen Sie das Schiff in Reserve aus und klicken Sie dann manuell, um Bilder zu offenen Zeitfenstern hinzuzufügen. Alternativ können Sie mit der rechten Maustaste klicken, sobald der Zeitplan geöffnet ist, um alle geplanten Scanzeiten zu löschen, und mit der rechten Maustaste klicken, um in regelmäßigen Abständen neue Scanzeiten für eine Scangruppe festzulegen.
       HINWEIS: Dadurch werden alle Experimente, die sich derzeit auf dem Gerät befinden, unterbrochen, bis neue Zeiten festgelegt werden. Vergessen Sie nicht, auf das Diskettensymbol zu klicken, um zu speichern, oder auf das rote X, um Änderungen am Zeitplan abzubrechen. Die Auswahl der gewünschten Vertiefungen oder Ansichten ist ein unkomplizierter Vorgang, da das Gerät sofort nach der Parameterauswahl die geschätzte Scanzeit liefert. Die Scandauer hängt von der Art und Marke der ausgewählten Platte sowie von der Anzahl der zu scannenden Vertiefungen oder Ansichten ab. Auf diese Weise können Benutzer die Scan-Parameter an die Kapazität des Geräts anpassen.
20. Bei Keratinozyten alle 48 Stunden das Medium wechseln. Um die korrekte Ausrichtung der Platte zu gewährleisten, warten Sie, bis der erste Scan jedes Mal abgeschlossen ist, wenn ein Gefäß in die Maschine eingesetzt wird (sofern es die Zeit erlaubt). Es ist ein einfacher Fehler, den man machen kann. Setzen Sie die Platte so in die Maschine ein, dass sich die Buchstaben, die die Reihen bezeichnen, auf der linken Seite des Schachts befinden.
    1. Um Scans anzuzeigen, drücken Sie die Schaltfläche Ansicht mit dem Augensymbol und doppelklicken Sie dann auf das Experiment. Erwägen Sie einen frühzeitigen Medienwechsel, wenn sich die Farbe des Mediums plötzlich ändert (phenolrothaltige Medien werden aufgrund der Versauerung gelb), wenn überschüssige tote Zellen vorhanden sind (kann die Proliferation lebender Kolonien beeinträchtigen) oder wenn eine abnormale Morphologie beobachtet wird.
21. Sobald alle Vertiefungen zur Ruhe gekommen sind oder einen Zusammenfluss erreicht haben, exportieren Sie das Experiment. Verfolgen Sie adulte Kolonien für ~2 Wochen und Neugeborene für ~10 Tage, wobei die Überfüllung zu einem abnehmenden Ertrag für die Analysen führt.
22. Klicken Sie zum Exportieren auf die Registerkarte Ansicht und doppelklicken Sie auf das Experiment unter der Liste der letzten Scans (standardmäßig werden sie von den neuesten Scans nach hinten sortiert). Klicken Sie auf das Querformat-Symbol mit dem Pfeil und warten Sie, bis das Exportwerkzeug gestartet wird.
23. Klicken Sie auf "Wie angezeigt" und dann auf "Weiter".
24. Klicken Sie manuell auf jedes Ansichtsfeld, das exportiert werden soll, und klicken Sie dann auf Weiter.
25. Wählen Sie aus, ob ein Film oder eine Bildserie gewünscht werden soll, und wählen Sie dann die zu exportierenden Scanzeiten aus. Verwenden Sie für die Nachverfolgung der Keratinozyten-Abstammung die Option Film und wählen Sie alle Scans aus (es gibt ein schnelles Symbol Alle auswählen mit einer gestrichelten Linie, um dies zu beschleunigen). Klicken Sie auf Weiter.
26. Exportieren Sie mit 1 Bild pro Sekunde bei maximaler Qualität (stellen Sie dies über den Balken neben Qualität ein). Klicken Sie auf Weiter.
27. Wählen Sie den Zielordner und den Dateityp aus. Benennen Sie die Datei und klicken Sie dann auf Exportieren.
    HINWEIS: Das Exportieren von Videos kann je nach Geschwindigkeit der Internetverbindung und des beteiligten Computers sehr lange dauern. Seien Sie darauf vorbereitet, mehrere Tage zu warten, um alle Videodateien für größere Experimente zu exportieren. Die Möglichkeit, sich aus der Ferne in das Zeitraffermikroskop einzuloggen, ist äußerst praktisch.

2. Verwendung von Zeitraffer-Bildgebung zur Erstellung von Abstammungsbäumen und Erstellung von Datenblättern

1. Öffnen Sie die Videodatei mit einem Mediaplayer. Der VLC Media Player wird empfohlen.
2. Scrollen Sie durch die Videos und identifizieren Sie wachsende Völker. Verwenden Sie bei VLC die Pfeiltaste, um Frames vorwärts und rückwärts zu überspringen. Machen Sie einen Screenshot der zu verfolgenden Kolonie und beschriften Sie die Kolonie.
3. Identifizieren Sie eine Kolonie von Interesse, entweder am Ende oder nach einigen Tagen der Videoaufzeichnung, spulen Sie dann das Video zurück und identifizieren Sie die koloniebildende Zelle.
   HINWEIS: Hier ist es wichtig, die richtige Aussaatdichte zu haben. Entwickeln sich zu viele Kolonien nebeneinander, dehnen sie sich aus und verschmelzen ineinander, so dass es unmöglich ist, Zellteilungen genau nachzuvollziehen.
4. Wenn sich eine Zelle zu teilen droht, scheint sie sich zu verdichten (Abbildung 1). Halten Sie das Video an, wenn die Teilung erfolgt. Notieren Sie die Zeit der Division (ein Zeitstempel befindet sich in der unteren linken Ecke). Machen Sie einen Screenshot dieser ersten Teilung und geben Sie ihr die gleiche Bezeichnung wie die Kolonie. Notieren Sie die Unterteilungen in einem handgezeichneten Abstammungsdiagramm (siehe Repräsentative Ergebnisse). Verfolgen und dokumentieren Sie weiterhin so viele Generationen wie möglich.
   HINWEIS: Die automatisierte Zellverfolgung wurde/wird entwickelt, um diesen Prozess zu beschleunigen und Zellen genauer zu verfolgen⁷. Selbst unter kalziumarmen Kulturbedingungen mit minimaler Differenzierung fehlt es den Modellen des maschinellen Lernens derzeit an der Empfindlichkeit, um Keratinozytenteilungen genau zu verfolgen.
5. Transkribieren Sie den manuellen Abstammungsbaum in Datenblätter - aufgrund der Farbe in der Tabelle so genannte "grüne Blätter" (Ergänzende Datei 1).
6. Verwenden Sie die grünen Blätter, um die Anteile der proliferativen und der Differenzierungsteilung zu berechnen, Stammzell- und committed Vorläuferkolonien und die Zellzyklusdauer zu identifizieren (siehe repräsentative Ergebnisse).
   HINWEIS: Das Gerät ist in der Lage, Daten über seine eigenen Basis- und Zell-für-Zell-Analysatoren zu analysieren, um mehrere andere Assays (Confluence, Scratch) durchzuführen. Dies würde jedoch den Rahmen dieses Protokolls sprengen.

Primäre Keratinozyten wachsen auf stereotype Weise, was durch Lebendzellbildgebung verfolgt werden kann. Der VLC Media Player wird verwendet, um Aufnahmen zu überwachen. Die Zeit bis zur ersten Teilung ist variabel und kann mehrere Tage betragen, abhängig von den Merkmalen des Spenders, wie z. B. Alter, Gesundheitszustand oder den in vitro vorhandenen Wachstumsfaktoren. Bei der ersten Aussaat haben die Keratinozyten ein kleines, abgerundetes Aussehen (Abbildung 1). Nach der Aussaat werden die koloniebildenden Keratinozyten typischerweise abgeflacht (Abbildung 1). Diese abgeflachten Keratinozyten neigen dazu, beweglicher zu sein als ihre nicht teilenden Gegenstücke (Ergänzendes Video 1). Unmittelbar vor der Teilung scheint der abgeflachte Keratinozyten zentral zu kondensieren (Abbildung 1).

Mit Ausnahme der anfänglichen Teilung tun 95% der Keratinozyten, die sich teilen werden (proliferativ - P), dies innerhalb von 48 Stunden nach der vorherigen Teilung⁶. Diejenigen, die dies nicht tun, gelten als terminale differenzierte (D) (Abbildung 1)⁶. Diese differenzierten Zellen bleiben bis zum Ende des Beobachtungszeitraums oder bis sie sich von der Platte abheben und beim anschließenden Medienwechsel entfernt werden, haften. Zellen, die sich differenzieren, neigen dazu, sich im Laufe der Zeit auszudehnen, was zu einer uneinheitlichen Morphologie der Keratinozytenkolonie führt (Abbildung 1). Exportieren Sie die Videos, sobald der Beobachtungszeitraum abgelaufen ist, und beginnen Sie mit der Analyse (Abbildung 2).

Die Dokumentation der Völker erfolgt nach einem standardisierten Prozess. Es wird das Videopräfix verwendet, in dem sich die Kolonie befand (A1, A2..., B1, B2...), gefolgt von der Kolonienummer. Beispiel: A2-6 wäre Video A2, Kolonie 6. Die Analyse beginnt mit der Abstammungsverfolgung. Spulen Sie zum Ende eines Videos vor, um Kolonien zu identifizieren, und spulen Sie dann zum Anfang des Beobachtungszeitraums zurück, um die ursprüngliche koloniebildende Zelle zu identifizieren. Verfolgen Sie die Zeitstempel aller Divisionen, sobald sie auftreten, und erstellen Sie von Hand ein verzweigtes Diagramm, indem Sie so viele Generationen wie möglich genau verfolgen (Abbildung 3). Irgendwann ist es aufgrund der Zelldichte nicht mehr möglich, die Zellteilungen genau zu verfolgen (dies geschieht in der Regel um die Generation 5-7, je nachdem, ob die Kolonie von einer Stammzelle oder von einem festen Vorläufer abstammt). In späteren Generationen verschmilzt die Kolonie oft mit einer anderen Kolonie oder die Kolonie verschwindet aus dem Bild. Markieren Sie an dieser Stelle die letzte verfolgbare Zelle als U (nicht nachvollziehbar). Machen Sie immer einen Screenshot der zu verfolgenden Kolonie (dies kann mit der Snapshot-Funktion von VLC erfolgen) und markieren Sie die Kolonie mit der oben beschriebenen Nomenklatur. Stellen Sie sicher, dass Sie den Screenshot mit einer standardisierten Nomenklatur beschriften, einschließlich des spezifischen analysierten Videos und der Kolonienummer, die mit dem Screenshot abgeglichen werden kann.

Sobald das Verzweigungsdiagramm erstellt wurde, können die Daten in eine Tabellenkalkulation oder ein "grünes Blatt" übertragen werden (Zusatzdatei 1). Das grüne Blatt enthält die gleiche Beschriftung für jede Kolonie, die über ein Astdiagramm verfolgt wird. Um die Generationen leicht identifizieren zu können, werden die Farbhervorhebungen zwischen den Generationen abgewechselt. Zeit 1 der Generation 1 bezieht sich auf den Zeitraum von der Beschichtung der Zellen bis zum Platzieren auf dem Zeitraffermikroskop. In der Zusatzdatei 1 beträgt der Zeitpunkt 1 der Generation 1 24 h, da die Zellen 24 h nach dem Plattieren auf die Maschine gelegt werden. Zeit 2 stellt die Dauer bis zur ersten Teilung der Zelle dar. Denken Sie daran, dass der Zeitstempel in den Videos die zusätzlichen 24 Stunden nicht berücksichtigt, so dass die Stunden in jeder Generation manuell hinzugefügt werden müssen. Wenn Sie Daten aus dem Verzweigungsdiagramm auf das grüne Blatt übertragen, addieren Sie immer 24 h zur Zeit der Division, da der vom Gerät bereitgestellte Zeitstempel die Zeit bis zum Beginn der Aufzeichnung nicht berücksichtigt. ΔT ist die Dauer des Zellzyklus. Die meisten Studien ^6,8 beziehen den ΔT der ersten Generation nicht in die Analysen ein, da er immer viel länger ist als der der nachfolgenden Generationen und extrem variabel ist, was zu verzerrten Analysen führt.

Sobald das grüne Blatt erstellt ist, kann man feststellen, welche Kolonien von Stammzellen und welche von festen Vorläuferzellen stammen. Kolonien, die überwiegend proliferative Teilungen aufweisen (Abbildung 1) und bis zum Ende des Beobachtungszeitraums bestehen, gelten als Stammzellkolonien⁶. Kolonien, die sich während des Beobachtungszeitraums endgültig differenzieren (Abbildung 1), gelten als engagierte Vorläuferkolonien⁶. Anschließend kann die mittlere ΔT von Stammzellkolonien bzw. engagierten Vorläuferkolonien berechnet werden. Indem man den Anteil der D-Teilungen durch die Gesamtteilungen dividiert, kann man den Anteil der Differenzierungsteilungen berechnen, entweder mit allen gepoolten Teilungen von Stammzellen bzw. engagierten Vorläuferkolonien oder nach Generation. Das Green Sheet ist eine nützliche Möglichkeit, Daten zu organisieren, um effizient Informationen zu erhalten, und es entwickelt sich weiter, je nachdem, welche Daten und Statistiken für die Ziele der Studie benötigt werden.

Abbildung 1: Veränderungen in der Keratinozytenmorphologie, die zur Zellteilung und zur Terminologie der Zellteilung führen. Keratinozyten durchlaufen eine stereotype Abfolge morphologischer Veränderungen, die zur Zellteilung führen. Diese Abbildung zeigt einen Keratinozyten, der diese Abfolge von Ereignissen im Laufe der Zeit durchläuft. Einzelne Zellen, die sich kurz vor der Teilung befinden, sind beweglich und nehmen zunächst eine abgeflachte Morphologie an und verdichten sich unmittelbar vor der Teilung zentral. Tochterzellen, die sich weiter vermehren, teilen sich innerhalb von 48 Stunden nach ihrer Erzeugung, andernfalls gelten sie als terminale Differenzierung. Maßstabsleiste 400 μm. Erstellt in BioRender. Ghadially, R. (2025) https://BioRender.com/k40e714 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Exportieren von Daten aus dem Zeitraffermikroskop. Eine Anleitung zum Exportieren von Daten aus dem Gerät. Erstellt in BioRender. Ghadially, R. (2024) BioRender.com/x99d452 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3. Vorläufer-Zweigdiagramm (Abstammungsbaum), um die Erstellung von Green Sheets zu unterstützen. Ein Beispiel für einen Abstammungsbaum, der in der Regel handgezeichnet ist. Abkürzungen: h: Stunden, m: min. Erstellt in BioRender. Ghadially, R. (2025) https://BioRender.com/wbt7z8x Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Akte 1. Beispieldatenblätter (grüne Blätter) von unveröffentlichten Lebendzell-Bildgebungsdaten. Ein Beispiel für ein grünes Blatt mit unveröffentlichten Daten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 1. Beispiel für ein Video zur Bildgebung lebender Keratinozyten. Ein Live-Zell-Imaging-Video mit geeigneter Zelldichte zur Verfolgung von Keratinozytenkolonien Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Lebendzellbildgebung von Keratinozyten ist eine markierungsfreie Methode, um das Teilungsverhalten von Stammzellen und verbindlichen Vorläuferzellen zu verfolgen. Angesichts der Tatsache, dass die Aufrechterhaltung der Epidermis von der Proliferationskinetik von Stammzellen und verbindlichen Vorläuferzellen abhängt¹⁰, erleichtert ein detailliertes Verständnis der Veränderungen in diesen Keratinozytenpopulationen und wie sie unter verschiedenen Bedingungen beeinflusst werden, die Entwicklung von Therapien zur Verbesserung entdeckter Defekte.

Letztendlich hängt die Abstammungsverfolgung mittels Lebendzell-Imaging davon ab, verwertbare Daten zu erhalten. Die koloniebildenden Einheiten müssen in den Videos, die durch Zeitrafferfotografie erzeugt werden, deutlich sichtbar sein. Mit frisch isolierten Passage-0-Zellen ist es schwierig, eine echte klonale Dichte zu erreichen. Nur 3%-4% der plattierten Keratinozyten bilden schließlich Kolonien¹¹. Zu viele Zellen können es unmöglich machen, Teilungen zu verfolgen oder sogar die ursprüngliche koloniebildende Zelle zu identifizieren. Zu wenige Zellen und Kolonien können sich nicht bilden. In ähnlicher Weise macht es alles, was das Gesichtsfeld verdeckt, unmöglich, Zellen über die Herkunftsverfolgung zu verfolgen. Die Verwendung von Fibroblasten-Feedern kann es schwierig machen, die Teilung zu verfolgen, da Fibroblasten das Gesichtsfeld verdecken. In ähnlicher Weise können Ausfällungen, Zelltrümmer und sogar Kondenswasser auf dem Deckel der Platte die wachsenden Kolonien verdecken. Selbst etwas so Kleines wie das Nicht-Sicherstellen, dass die Mikroplatte sicher in den ausgewählten Schacht eingesetzt wird, kann letztendlich zu einem fehlgeschlagenen Experiment führen, da das Bild nicht auf die Zellen fokussiert wird. Aus diesem Grund ist es sehr wichtig, die Kolonien täglich zu überwachen, während sie in der Maschine wachsen, und immer bis nach dem ersten Scan zu bleiben, wenn die Mikroplatte für einen Medienwechsel aus der Maschine genommen wird, um sicherzustellen, dass die Zellen von der Zeitrafferfotografie erfasst werden. Ein weiteres Problem, das Schmutz verursachen kann, ist das Überspringen von Bildern. Normalerweise verfügt das Mikroskop über feste Gesichtsfelder, die sich nicht bewegen, aber wenn sich Schmutz ansammelt oder die Zelldichte zu hoch wird, kann das Gerät sein Sichtfeld verlieren und zu einem anderen Teil der Platte springen. Um dies zu vermeiden, haben die Hersteller der Maschine eine spezielle Art von 96-Well-Platte mit einem Gitter entwickelt, das einen Fokusverlust verhindert.

Die Maschine erzeugt bei der Aufnahme von Bildern Wärme. Es ist wichtig, die Temperatur des Inkubators, in dem sich das Mikroskop befindet, auf 36,5 °C zu senken, damit das Gerät bei der Aufnahme von Bildern auf 37 °C ausgleicht. Bei der Verwendung von Platten mit kleineren Oberflächen (96-Well-Platten) ist die zusätzlich erzeugte Wärme zu berücksichtigen. Verwenden Sie die peripheren Vertiefungen nicht für Experimente (erste und letzte Reihe/Spalte) und erwägen Sie, die Vertiefungen um die Versuchsbohrungen herum maximal mit anderen Flüssigkeiten (steriles PBS) zu füllen, und verwenden Sie atmungsaktives Klebeband, um den Verdunstungsverlust von Medien zu reduzieren. Es gibt Platten, die auf dem Markt sind, die untersucht werden könnten, um Kanteneffekte zu minimieren¹². Die oben genannten Methoden haben jedoch die Verwendung von empfohlenen kompatiblen Mikroplatten ermöglicht.

Bei der Analyse von Videos müssen sich die Ermittler der abnormalen Teilungsmuster ihrer Kolonien bewusst sein. Wenn es beispielsweise 10 Tage lang keine Teilungen innerhalb einer Ansicht gibt und dann eine zügellose Koloniebildung vom Rand des Sichtfelds ausgeht, ist es unwahrscheinlich, dass es sich um die erste Teilung einer neuen Kolonie handelt. Es ist wahrscheinlich, dass eine wachsende Kolonie aus einem umgebenden Gesichtsfeld in den eingefangenen Teil der Platte eindrang, anstatt dass es sich um eine neue Kolonie handelte. Dies kann durch Einloggen in die Software-Suite überprüft werden, die die gesamte Platte (mit allen aufgezeichneten Ansichten) zu bestimmten Zeitpunkten darstellen und die Wanderung von Zellen von einem Sichtfeld in ein anderes anzeigen kann.

Die Haupteinschränkung dieser Methode ist ihre arbeitsintensive Natur. Außerdem ist es schwierig, Zellteilungen nach der 5^. Generation zu verfolgen, und erfordert stundenlange Arbeit, um Videos erneut anzusehen, um genau zu erfassen, was sich wann teilt. Es werden mehrere automatisierte Deep-Learning-Zellverfolgungsalgorithmen entwickelt, die in den kommenden Jahren schließlich zu einer rein KI-basierten Analyse führen werden ^7,13,14. Bis dahin ist die manuelle Nachverfolgung, wie sie in diesem Protokoll beschrieben wird, eine praktikable Methode, um Abstammungsdaten zu entwickeln.

Nichts.

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Merit Review Award Nummer I01 CX001816 aus den Vereinigten Staaten (U.S.) Ministerium für Veteranenangelegenheiten, klinische Wissenschaften, F&E (CSRD) Service. Die Inhalte repräsentieren nicht die Ansichten des US-Ministeriums für Veteranenangelegenheiten oder der Regierung der Vereinigten Staaten. Wir danken Dr. Michael Rosenblum für die Bereitstellung seines Zeitraffermikroskops für die Durchführung unserer Experimente.