تصوير الخلايا الحية مع التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني لدراسة حركية تكاثر الخلايا الكيراتينية للبشرة

هنا ، نقدم طريقة لتحليل تصوير الخلايا الحية التي يمكن استخدامها لتتبع سلالات المرور 0 الخلايا الكيراتينية يدويا والتي تسمح بجمع مقاييس الانتشار ، بما في ذلك مصير انقسام الخلية ومدة دورة الخلية.

تصوير الخلايا الحية هو طريقة متطورة وصعبة إلى حد ما لدراسة سلوك الخلايا الكيراتينية في المختبر. تاريخيا ، تم التحقيق في سلوك انقسام الخلايا الكيراتينية من خلال طرق مثل التحليل النسيلي والتلوين المناعي وتحليل دورة الخلية. لا تسمح أي من هذه الطرق بتحليل سلوك الخلايا الكيراتينية على مستوى الخلية المفردة في الوقت الفعلي. على مدى العقد الماضي ، استخدمت المجموعات تصوير الخلايا الحية لتحديد الخلايا الجذعية للخلايا الكيراتينية والأسلاف الملتزمة دون الحاجة إلى وضع العلامات. تم تحديد الاختلافات في سلوك الانقسام لكل مجموعة ، ومعدل التمايز النهائي ، ومدة دورة الخلية. هنا ، يتم وصف طريقة لتصوير الخلايا الحية للخلايا الكيراتينية مع التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني وتحليله. يوصى باستخدام الخلايا الكيراتينية غير المارة لهذه الطريقة لتقليد السلوك في الجسم الحي عن كثب. يوفر تصوير الخلايا الحية قدرة فريدة على دراسة الخلايا الجذعية وسلوك السلف الملتزم على مستوى الخلية المفردة وتحديد مصائر الانقسام ومدة دورة الخلية بالإضافة إلى مقاييس الانتشار الأخرى.

تعد القدرة على تصور مجموعات الخلايا في المختبر في الوقت الفعلي أثناء توسعها لفترات طويلة من الزمن فائدة فريدة لتصوير الخلايا الحية. يسمح تصوير الخلايا الحية بتقييم حركة الخلية وهجرتها وتكاثرها على مستوى الخلية الواحدة. الهدف من هذا البروتوكول هو تحسين تصور مزارع الخلايا الكيراتينية عبر التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني ، وإنتاج مقاطع فيديو يمكن تتبعها يدويا بعد ذلك للحصول على بيانات دقيقة عن السلوك الخلوي.

وينصب تركيزنا على حركية الانتشار. من تحليل مقاطع فيديو تصوير الخلايا الحية ، يمكن توضيح أشجار النسب ، ويمكن تقييم الوقت بين الانقسامات (وكيل لمدة دورة الخلية) ، بالإضافة إلى نسب الانقسامات التي تؤدي إلى مزيد من الانقسام مقابل تمايز الخلايا الوليدة.

هناك تباين كبير من متبرع إلى متبرع عند التعامل مع الخلايا الكيراتينية الأولية والمحاولات الفاشلة المتكررة لتكاثر الخلايا. لهذا السبب ، يختار العديد من الباحثين استخدام الخلايا الكيراتينية عالية التكاثر مثل خلايا HaCaT أو الخلايا الكيراتينية لحديثي الولادة ، غالبا بعد خضوعهم لمقاطع متعددة في المختبر¹. قد يكون استزراع الخلايا الكيراتينية الأولية من الجلد البالغ أو المسن لغرض تتبع النسب أمرا صعبا. ومع ذلك ، هناك مشكلات في استخدام الخلايا المنقولة من خطوط الخلايا أو من القلفة الذكرية. ينتج عن المرور المتكرر خلايا تختلف اختلافا كبيرا عن حالتها في الجسم الحي ². علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن خلايا HaCaT تتفاعل بشكل مختلف عن الخلايا الكيراتينية الأولية في المقايسات المتعددة^3،4،5. للاستفادة من الخلايا التي تشبه إلى حد كبير نظيراتها في الجسم الحي ، يتم استخدام مرور 0 خلايا كيراتينية من المتبرعين البشريين البالغين. تظهر الخلايا الجذعية للخلايا الكيراتينية والأسلاف الملتزمة اختلافات واضحة في السلوك ، مما يسمح بتمييز المستعمرات من أي من المجموعتين عن طريق تصوير الخلايا الحية⁶. تم استخدام هذه القدرة الجديدة نسبيا على تصور سلوك الخلايا الكيراتينية المفردة على المدى الطويل في عدد قليل من الدراسات السابقة باستخدام تقنيات مماثلة^6،7،8. يحدد هذا البروتوكول تصوير الخلايا الحية للخلايا الكيراتينية الأولية باستخدام نظام تحليل الخلايا الحية IncuCyte S3. من أشجار النسب التي يتم إنشاؤها ، يمكن تحديد نوع المستعمرة (الخلايا الجذعية مقابل السلف الملتزم) ، بالإضافة إلى مدة دورة الخلية ونسبة انقسامات التمايز.

أجريت هذه الدراسة وفقا لإعلان هلسنكي. تم الحصول على جميع الأنسجة البشرية بعد موافقة مجلس المراجعة المؤسسي بجامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو (UCSF) ، وتم الحصول على الموافقة على جميع الأنسجة المستخدمة.

1. التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني لمرور 0 الخلايا الكيراتينية البشرية

ملاحظة: هذا البروتوكول خاص ب IncuCyte S3 و SX5.

1. تأكد من الحصول على الموافقات المناسبة من لجنة البحوث البشرية بالمؤسسة لاستخدام الأنسجة البشرية للدراسة.
2. عزل الخلايا الكيراتينية عن الجلد الطازج كما هو موضح^{سابقا 9}.
3. تحديد كثافة البذر للمقايسة. قم بإجراء دراسات تجريبية مع عينات في تخفيفات متعددة من متبرعين مختلفين لفهم كثافة الخلايا اللازمة من أجل ضمان مستعمرات كافية للدراسة ولكن منع المستعمرات المفرطة التي تؤدي إلى تداخل المستعمرة خلال فترة المراقبة. قم بتشغيل هذه الطيارين في ظل ظروف تجريبية متطابقة (نفس الألواح والكواشف وما إلى ذلك) ، حيث يمكن لهذه العوامل تغيير النتائج.
   ملاحظة: تؤدي كثافة البذر المنخفضة جدا إلى نمو غير كاف ، في حين أن كثافة البذر العالية جدا تؤدي إلى عدم القدرة على تتبع الخلايا بدقة بسبب ازدحام الخلايا في الحقل.
   1. بالنسبة لمرور 0 خلايا كيراتينية من قلفة حديثي الولادة أقل من 48 ساعة من مجموعة مخزنة عند 4 درجات مئوية في وسائط التجميع ، تأكد من أن كثافة البذر 1000-5000 / سم². بالنسبة للخلايا الكيراتينية P1 ، استخدم 500-2000 خلية / سم². كلما زاد الممر ، انخفضت كثافة البذر.
4. خلايا اللوحة على حجم اللوحة المحدد.
   ملاحظة: 96 لوحة بئر وصفائح دقيقة لها تأثير الغضروف المفصلي ، مما يؤدي إلى توزيع الخلايا غير المنتظم ، مع وجود الكثير من النمو خارج مجال جهاز التصوير. تسمح الألواح ذات الآبار الكبيرة (24 لوحة بئر على سبيل المثال) بالتقاط المزيد من البيانات. تسمح 24 لوحة بئر بتصور ما يصل إلى 36 حقلا ، بينما تسمح 96 لوحة بئر بتصور ما يصل إلى 5 حقول فقط. ومع ذلك ، فإن عدد الحقول التي تم التقاطها على الأداة محدود ، وستستهلك المزيد من الحقول المزيد من سعة المصور. عادة ، يتم استخدام صفيحة 24 بئر.
   1. لتحقيق توزيع متساو للخلايا على اللوحة ، يمكن استخدام تقنيات مختلفة. أولا ، بدلا من زرع كل بئر بشكل فردي ، قم بتقسيم إجمالي الوسائط اللازمة لجميع الآبار عند تخفيف معين في أنبوب صغير. بعد ذلك ، قم بتدوير الماصة العدد الإجمالي للخلايا اللازمة للوصول إلى الكثافة المطلوبة وقلب الأنبوب برفق لتوزيع الخلايا بشكل متجانس.
   2. بعد الطلاء ، حرك اللوحة في نمط متقاطع ثلاث مرات (لأعلى لأسفل ، من اليسار إلى اليمين) ثم انقلها إلى الحاضنة بعناية.
      تنبيه: في حالة استخدام صفيحة دقيقة ، تجنب الصفوف والأعمدة الخارجية للآبار ، لأن المجهر بفاصل زمني يولد حرارة عند التصوير وقد يتسبب في تبخر الوسائط في تلك الآبار. يجب تجميع الآبار التجريبية في وسط الصفيحة وتحيط بها آبار تحتوي على PBS أو سائل معقم آخر بأقصى سعة لتقليل تأثيرات التبخر / الحافة.
5. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للسماح بالالتصاق.
6. تغيير الوسائط بعد 24 ساعة.
   ملاحظة: لا تزعج الطبقة الأحادية المتنامية عند الشفط. استخدم دائما الوسائط الدافئة (37 درجة مئوية) وقم ببث الوسائط برفق في الآبار باستخدام الجدار الجانبي. الوسائط المستخدمة هنا هي Epilife / Supplement S7 / Primocin. يوصى باستخدام المضادات الحيوية في الوسائط لتصوير الخلايا الحية على المدى الطويل لهذا التطبيق. إن الثقافة الممتدة في آلة تستخدم في تجارب متزامنة متعددة معرضة لخطر كبير للتلوث. يشيع استخدام البنسلين والستربتومايسين.
7. افتح الحاضنة بالضغط على الزر المثلث الكبير في أسفل اليسار لفتح الدرج عندما يكون الضوء أخضر. ضع الوعاء في خليج مفتوح. ثم أغلق الدرج باستخدام نفس الزر الموجود أسفل اليسار. لا تفتح الدرج أبدا عندما يكون الزر المراد فتحه أحمر ، فهذا يعني أنه يقوم بالمسح الضوئي بنشاط ، وسيتم مقاطعة الفحص.
   تنبيه: تأكد من عدم وجود عمليات فحص تبدأ بالنظر إلى الشاشة على وحدة التحكم. يخبرنا بالوقت حتى الفحص التالي وطول الفحص. إذا بدأ المسح ، فسوف يمنح الوقت حتى يكتمل الفحص.
8. افتح التطبيق على الكمبيوتر وقم بتسجيل الدخول باستخدام معرف المستخدم وكلمة المرور المناسبين. حدد جدولة.
9. اضغط على الزر + في الزاوية العلوية اليسرى أسفل الجدول الزمني لإضافة اللوحة إلى الجدول.
10. حدد مسح ضوئي حسب الجدول الزمني، ثم انقر فوق التالي.
11. حدد جديد، ثم انقر على التالي.
    ملاحظة: إذا كانت هذه اللوحة مطابقة لتجربة سابقة أو قيد التشغيل، فيمكن استخدام نسخ السابق أو نسخ الحالي لتسريع تنسيق التجربة.
12. حدد قياسي لنوع المسح الضوئي، ثم انقر على التالي.
    ملاحظة: Image Lock عبارة عن لوحة بئر 96 خاصة تساعد على تقليل حدوث فقدان التركيز / القفز على الصورة ، والتي يمكن أن تكون مفيدة إذا واجهت هذه المشكلات. أنواع الفحص الأخرى ليست مفيدة بشكل خاص لتتبع النسب.
13. لإعدادات الفحص، حدد اللصق خلية تلو الأخرى باستخدام قناة الطور عند هدف 10x، ثم انقر فوق التالي.
    ملاحظة: طالما تم اختيار قناة الطور، فلا يلزم تحديد خيار التحليل في هذه المرحلة، حيث يمكن بدء التحليل بعد التقاط البيانات.
14. حدد الوعاء، ثم انقر على التالي. تتوافق معظم الأوعية الشائعة مع الماكينة ، على الرغم من أن الصفائح غير المجهرية قد تحتاج إلى ملحقات خاصة لتناسب خلجان المجهر بفاصل زمني.
15. حدد خليجا فارغا لوضع السفينة، ثم انقر فوق التالي.
16. حدد الآبار المراد مسحها ضوئيا بالإضافة إلى الصور لكل بئر ، ثم انقر فوق التالي. سيتم توفير مدة الفحص المقدرة في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة.
17. قم بتسمية التجربة باستخدام اصطلاح التسمية المطلوب. قم بإنشاء خريطة لوحة للتجربة للرجوع إليها في المستقبل ، ثم اضغط على حسنا. أخيرا ، انقر فوق التالي.
18. تأجيل التحليل إلى ما بعد جمع البيانات ، حيث يجب بدء التحليل خلية تلو الأخرى بعد اكتمال المسح. انقر فوق التالي.
19. أخيرا ، اضبط تردد التصوير. من أجل تتبع الانقسام بشكل موثوق ، والذي يحدث على مدى 30 دقيقة ، قم بالمسح الضوئي على فترات 20 دقيقة بحثا عن الخلايا الكيراتينية. اضغط على التالي وقم بتأكيد الإعدادات لبدء التجربة.
    ملاحظة: لا يمكن أن تتداخل أوقات المسح الضوئي ، ويوصي المصنعون بأن يكون الجهاز في حالة راحة طالما أنه يقوم بالمسح الضوئي. مع فواصل زمنية مدتها 20 دقيقة ، فهذا يعني أنه يجب قضاء 10 دقائق كحد أقصى في المسح. إذا تم تصوير 12 بئرا من 24 بئرا عند 36 مشاهدة لكل بئر ، فسيستغرق الأمر 7 دقائق حتى يكتمل الفحص ، لذلك ضع في اعتبارك دائما الموارد المتاحة للتجربة عند التخطيط.
    1. هناك إشعار إذا كان هناك وقت غير كاف للماكينة للراحة ، وإذا تداخلت أوقات المسح ، فلا يمكن إضافة السفينة إلى الجدول. إذا لم يكن السفينة تتناسب مع الجدول الزمني على فترة زمنية منتظمة ، فانقر فوق حجز موقع الدرج واضغط على التالي.
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق الجدول الزمني في الجزء العلوي من الشاشة وحدد السفينة الاحتياطية ثم انقر يدويا لإضافة صور في الفترات الزمنية المفتوحة. بدلا من ذلك، انقر بزر الماوس الأيمن بمجرد فتح الجدول الزمني لحذف جميع أوقات الفحص المجدولة وانقر بزر الماوس الأيمن لتعيين أوقات فحص جديدة لمجموعة المسح الضوئي على فاصل زمني منتظم.
       ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى مقاطعة جميع التجارب الموجودة حاليا على الجهاز حتى يتم تعيين أوقات جديدة. لا تنس الضغط على أيقونة القرص المرن للحفظ أو X الأحمر لإلغاء التغييرات التي تطرأ على الجدول الزمني. يعد اختيار الآبار أو المناظر المطلوبة عملية مباشرة ، حيث توفر الماكينة على الفور وقت المسح المقدر عند اختيار المعلمة. تعتمد مدة الفحص على نوع اللوحة المختارة وعلامتها التجارية ، بالإضافة إلى عدد الآبار أو المناظر المراد مسحها ضوئيا. يتيح ذلك للمستخدمين ضبط معلمات المسح الضوئي لتتناسب مع سعة الجهاز.
20. بالنسبة للخلايا الكيراتينية ، قم بتغيير الوسائط كل 48 ساعة. لضمان الاتجاه الصحيح للوحة ، انتظر حتى يكتمل الفحص الأول في كل مرة يتم فيها وضع وعاء في الماكينة (إذا سمح الوقت بذلك). إنه خطأ بسيط لارتكابه. ضع اللوحة في الماكينة بحيث تكون الأحرف التي تشير إلى الصفوف على الجانب الأيسر من الخليج.
    1. لعرض المسح الضوئي، اضغط على الزر عرض مع أيقونة العين ثم انقر نقرا مزدوجا فوق التجربة. ضع في اعتبارك تغيير الوسائط مبكرا إذا كان هناك تغيير مفاجئ في لون الوسائط (تصبح الوسائط المحتوية على الفينول الأحمر صفراء بسبب التحمض) ، إذا كانت هناك خلايا ميتة زائدة (يمكن أن تتداخل مع تكاثر المستعمرات الحية) ، أو إذا لوحظ مورفولوجيا غير طبيعية.
21. بمجرد أن تصبح جميع الآبار هادئة أو تصل إلى التقاء ، قم بتصدير التجربة. اتبع مستعمرات البالغين لمدة ~ 2 أسابيع وحديثي الولادة لمدة ~ 10 أيام ، وفي ذلك الوقت يتسبب الازدحام في تناقص عوائد التحليلات.
22. للتصدير، انقر فوق علامة التبويب عرض وانقر نقرا مزدوجا فوق التجربة ضمن قائمة عمليات الفحص الحديثة (الإعداد الافتراضي هو أن يتم طلبها من أحدث إصدار للخلف). انقر على أفقي مع السهم وانتظر حتى يتم تشغيل أداة التصدير.
23. انقر على كما معروض، ثم انقر على التالي.
24. انقر يدويا على كل حقل عرض لتصديره، ثم انقر على التالي.
25. حدد ما إذا كان الفيلم أو سلسلة الصور مطلوبا أم لا، ثم حدد أوقات المسح الضوئي المراد تصديرها. لتتبع نسب الخلايا الكيراتينية ، استخدم خيار الفيلم وحدد جميع عمليات الفحص (يوجد رمز تحديد الكل السريع مع سطر متقطع لتسريع ذلك). انقر فوق التالي.
26. قم بالتصدير بمعدل 1 إطار في الثانية بأقصى جودة (اضبط هذا باستخدام الشريط بجوار الجودة). انقر فوق التالي.
27. اختر المجلد الهدف ونوع الملف. قم بتسمية الملف، ثم انقر فوق تصدير.
    ملاحظة: قد يستغرق تصدير مقاطع الفيديو وقتا طويلا ، اعتمادا على سرعة الاتصال بالإنترنت والكمبيوتر المعني. كن مستعدا للانتظار عدة أيام لتصدير جميع ملفات الفيديو لتجارب أكبر. يعد امتلاك القدرة على تسجيل الدخول إلى مجهر الفاصل الزمني عن بعد أمرا مريحا للغاية.

2. استخدام التصوير بفاصل زمني لبناء أشجار النسب وإنشاء أوراق البيانات

1. افتح ملف الفيديو باستخدام مشغل وسائط. يوصى باستخدام مشغل وسائط VLC.
2. قم بالتمرير عبر مقاطع الفيديو وحدد المستعمرات المتنامية. باستخدام VLC ، استخدم مفتاح السهم لتخطي الإطارات للأمام والخلف. التقط لقطة شاشة للمستعمرة المراد تتبعها وقم بتسمية المستعمرة.
3. حدد مستعمرة ذات أهمية إما في نهاية أو بعد بضعة أيام من تسجيل الفيديو ، ثم قم بإرجاع الفيديو وتحديد الخلية المكونة للمستعمرة.
   ملاحظة: هذا هو المكان الذي يكون فيه الحصول على كثافة البذر المناسبة أمرا مهما. إذا تطورت العديد من المستعمرات بجانب بعضها البعض ، فإنها تتوسع وتندمج مع بعضها البعض مما يجعل من المستحيل تتبع انقسامات الخلايا بدقة.
4. عندما تكون الخلية على وشك الانقسام ، يبدو أنها تتكثف (الشكل 1). أوقف الفيديو مؤقتا عند حدوث الانقسام. سجل وقت التقسيم (يوجد الطابع الزمني في الزاوية اليسرى السفلية). التقط لقطة شاشة لهذا التقسيم الأولي وامنحه نفس تسمية المستعمرة. سجل التقسيمات في مخطط نسب مرسوم يدويا (انظر النتائج التمثيلية). استمر في تتبع وتوثيق أكبر عدد ممكن من الأجيال.
   ملاحظة: يتم تطوير التتبع الآلي للخلايا لتسريع هذه العملية وتتبع الخلايا بدقة^{أكبر 7}. حتى في ظروف زراعة الكالسيوم المنخفضة مع الحد الأدنى من التمايز ، تفتقر نماذج التعلم الآلي حاليا إلى الحساسية لتتبع انقسامات الخلايا الكيراتينية بدقة.
5. انسخ شجرة النسب اليدوية إلى أوراق البيانات - سميت بهذا الاسم "الأوراق الخضراء" بسبب اللون الموجود في جدول البيانات (الملف التكميلي 1).
6. استخدم الأوراق الخضراء لحساب نسب الانقسامات التكاثرية والتمايزية ، وتحديد الخلايا الجذعية ومستعمرات السلف الملتزمة ، ومدة دورة الخلية (انظر النتائج التمثيلية).
   ملاحظة: الجهاز قادر على تحليل البيانات عبر أجهزة التحليل الأساسية الخاصة به وكل خلية تلو الأخرى لتشغيل فحوصات أخرى متعددة (التقاء ، خدش). ومع ذلك ، فإن هذا خارج نطاق هذا البروتوكول.

تنمو الخلايا الكيراتينية الأولية بطريقة نمطية ، والتي يمكن تتبعها عن طريق تصوير الخلايا الحية. يستخدم مشغل وسائط VLC لمسح التسجيلات. الوقت حتى التقسيم الأول متغير ويمكن أن يكون عدة أيام اعتمادا على خصائص المتبرع ، مثل العمر أو الحالة الصحية أو عوامل النمو الموجودة في بيئة المختبر . عند البذر الأولي ، يكون للخلايا الكيراتينية مظهر صغير مستدير (الشكل 1). بعد البذر ، عادة ما تصبح الخلايا الكيراتينية المكونة للمستعمرة مسطحة (الشكل 1). تميل هذه الخلايا الكيراتينية المسطحة إلى أن تكون أكثر قدرة على الحركة من نظيراتها غير المنقسمة (الفيديو التكميلي 1). مباشرة قبل الانقسام ، يبدو أن الخلايا الكيراتينية المسطحة تتكثف مركزيا (الشكل 1).

باستثناء التقسيم الأولي ، فإن 95٪ من الخلايا الكيراتينية التي ستنقسم (التكاثرية - P) تفعل ذلك في غضون 48 ساعة من القسم^{السابق 6}. تلك التي لا تعتبر متمايزة نهائيا (د) (الشكل 1) ⁶. تظل هذه الخلايا المتمايزة ملتصقة حتى نهاية فترة المراقبة أو حتى ترفع عن اللوحة ويتم إزالتها عند تغيير الوسائط اللاحقة. تميل الخلايا التي تتمايز إلى التوسع بمرور الوقت ، مما يؤدي إلى مورفولوجيا غير منتظمة لمستعمرة الخلايا الكيراتينية (الشكل 1). قم بتصدير مقاطع الفيديو بمجرد انتهاء فترة المراقبة وابدأ التحليل (الشكل 2).

يتم توثيق المستعمرات باستخدام عملية موحدة. يتم استخدام بادئة الفيديو التي كانت تقع فيها المستعمرة (A1 ، A2 ... ، B1 ، B2 ...) ، متبوعا برقم المستعمرة. على سبيل المثال ، سيكون A2-6 فيديو A2 ، مستعمرة 6. يبدأ التحليل بتتبع النسب. تقدم سريعا إلى نهاية الفيديو لتحديد المستعمرات ، ثم ارجع إلى بداية فترة الملاحظة لتحديد الخلية الأصلية المكونة للمستعمرة. تتبع الطوابع الزمنية لجميع الأقسام عند حدوثها وقم بإنشاء مخطط متفرع يدويا ، وتتبع أكبر عدد ممكن من الأجيال بدقة (الشكل 3). في النهاية ، لم يعد من الممكن تتبع انقسامات الخلايا بدقة بسبب الكثافة الخلوية (يحدث هذا عادة في حوالي الجيل 5-7 ، اعتمادا على ما إذا كانت المستعمرة نشأت من خلية جذعية مقابل سلف ملتزم). في الأجيال اللاحقة ، غالبا ما تندمج المستعمرة مع مستعمرة أخرى ، أو تخرج المستعمرة عن الشاشة. في هذه المرحلة ، ضع علامة على آخر خلية قابلة للتتبع على أنها U (لا يمكن تعقبها). التقط دائما لقطة شاشة للمستعمرة التي يتم تتبعها (يمكن القيام بذلك باستخدام ميزة اللقطة على VLC) وقم بتمييز المستعمرة باستخدام التسمية الموضحة أعلاه. تأكد من تسمية لقطة الشاشة بتسمية موحدة ، بما في ذلك الفيديو المحدد الذي تم تحليله ورقم المستعمرة الذي يمكن مطابقته مع لقطة الشاشة.

بمجرد إنشاء الرسم التخطيطي الفرعي ، يمكن نقل البيانات إلى ورقة انتشار أو "ورقة خضراء" (ملف تكميلي 1). تحتوي الورقة الخضراء على نفس الملصق لكل مستعمرة يتم تتبعها عبر مخطط فرعي. لتحديد الأجيال بسهولة ، يتم تبديل إبرازات الألوان بين الأجيال. يشير الوقت 1 من الجيل 1 إلى الفترة من طلاء الخلايا إلى وضعها على مجهر الفاصل الزمني. في الملف التكميلي 1 ، الوقت 1 من الجيل 1 هو 24 ساعة ، حيث يتم وضع الخلايا على الجهاز بعد 24 ساعة من الطلاء. يمثل الوقت 2 المدة حتى تخضع الخلية للانقسام الأول. تذكر أن الطابع الزمني في مقاطع الفيديو لا يأخذ في الحسبان 24 ساعة إضافية ، لذا يجب إضافة الساعات يدويا في كل جيل. عند نسخ البيانات من الرسم التخطيطي الفرعي إلى الورقة الخضراء ، أضف دائما 24 ساعة إلى وقت الأقسام لأن الطابع الزمني الذي يوفره الجهاز لا يأخذ في الاعتبار الوقت الذي يسبق بدء التسجيل. ΔT هي مدة دورة الخلية. معظم الدراسات^6،8 لا تتضمن ΔT للجيل الأول في التحليلات ، لأنها دائما أطول بكثير من تلك الخاصة بالأجيال اللاحقة ومتغيرة للغاية ، مما يؤدي إلى تحليلات منحرفة.

بمجرد إنشاء الورقة الخضراء ، يمكن للمرء تحديد المستعمرات التي تنشأ من الخلايا الجذعية وأيها تنشأ من أسلاف ملتزمة. تعتبر المستعمرات التي تظهر انقسامات تكاثرية في الغالب (الشكل 1) وتستمر حتى نهاية فترة المراقبة مستعمرات الخلايا الجذعية⁶. تعتبر المستعمرات التي تتمايز نهائيا (الشكل 1) خلال فترة المراقبة مستعمرات سلفا ملتزمة⁶. يمكن بعد ذلك حساب متوسط ΔT لمستعمرات الخلايا الجذعية ومستعمرات السلف الملتزمة ، على التوالي. بقسمة نسبة الأقسام D على إجمالي التقسيمات ، يمكن للمرء أن يحسب نسبة أقسام التمايز ، إما مع جميع الأقسام المجمعة للخلايا الجذعية / مستعمرات السلف الملتزمة ، على التوالي أو حسب الجيل. الورقة الخضراء هي طريقة مفيدة لتنظيم البيانات للحصول على المعلومات بكفاءة وتتطور اعتمادا على البيانات والإحصاءات اللازمة لأهداف الدراسة.

الشكل 1: التغييرات في مورفولوجيا الخلايا الكيراتينية التي أدت إلى انقسام الخلايا ومصطلحات الانقسام. تتقدم الخلايا الكيراتينية من خلال تسلسل نمطي للتغيرات المورفولوجية التي تؤدي إلى انقسام الخلية. يصور هذا الشكل خلية كيراتينية تمر بهذا التسلسل من الأحداث بمرور الوقت. الخلايا الفردية التي على وشك الانقسام متحركة وتأخذ في البداية مورفولوجيا مسطحة وتصبح مكثفة مركزيا قبل الانقسام مباشرة. تنقسم الخلايا الوليدة التي ستستمر في التكاثر في غضون 48 ساعة من إنشائها وإلا فإنها تعتبر متمايزة نهائيا. شريط المقياس 400 ميكرومتر. تم إنشاؤه في BioRender. غديالي ، ر. (2025) https://BioRender.com/k40e714 الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تصدير البيانات من مجهر الفاصل الزمني. دليل حول كيفية تصدير البيانات من الجهاز. تم إنشاؤه في BioRender. غديالي ، ر. (2024) BioRender.com/x99d452 الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. مخطط فرع السلائف (شجرة النسب) لإبلاغ إنشاء الأوراق الخضراء. مثال على شجرة النسب ، عادة ما تكون مرسومة باليد. المختصرات: h: ساعات، م: دقيقة. تم إنشاؤه في BioRender. غديالي ، ر. (2025) https://BioRender.com/wbt7z8x الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي 1. أمثلة على أوراق البيانات (الورقات الخضراء) لبيانات تصوير الخلايا الحية غير المنشورة. مثال على الورقة الخضراء التي تحتوي على بيانات غير منشورة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

فيديو تكميلي 1. مثال على فيديو تصوير الخلايا الحية للخلايا الكيراتينية. فيديو تصوير الخلايا الحية بكثافة خلية مناسبة لتتبع مستعمرات الخلايا الكيراتينية الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

تصوير الخلايا الحية للخلايا الكيراتينية هو طريقة خالية من الملصقات لتتبع سلوك انقسام الخلايا الجذعية والأسلاف الملتزمة. بالنظر إلى أن الحفاظ على البشرة يعتمد على حركية تكاثر الخلايا الجذعية والأسلاف الملتزمة¹⁰ ، فإن وجود فهم دقيق للتغيرات في مجموعات الخلايا الكيراتينية هذه وكيف تتأثر في ظروف مختلفة يسهل تطوير العلاجات لتحسين العيوب التي يتم اكتشافها.

في النهاية ، يتوقف تتبع النسب عبر تصوير الخلايا الحية على الحصول على بيانات قابلة للاستخدام. يجب أن تكون وحدات تشكيل المستعمرة مرئية بوضوح في مقاطع الفيديو التي تم إنشاؤها بواسطة التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني. مع مرور 0 خلايا معزولة حديثا ، من الصعب الحصول على كثافة نسيلة حقيقية. فقط 3٪ -4٪ من الخلايا الكيراتينية المطلية تشكل في النهاية مستعمرات¹¹. قد يجعل عدد الخلايا الكبير جدا من المستحيل تتبع الانقسامات أو حتى تحديد الخلية الأولية المكونة للمستعمرة. عدد قليل جدا من الخلايا ، وقد لا تتشكل المستعمرات. وبالمثل ، فإن أي شيء يحجب المجال البصري يجعل من المستحيل تتبع الخلايا عبر تتبع النسب. قد يؤدي استخدام مغذيات الخلايا الليفية إلى صعوبة تتبع الانقسامات لأن الخلايا الليفية تحجب المجال البصري. وبالمثل ، يمكن للرواسب والحطام الخلوي وحتى التكثيف على غطاء الصفيحة أن تحجب المستعمرات النامية. حتى شيء صغير مثل عدم ضمان إدخال الصفيحة الدقيقة بإحكام في الخليج المحدد قد يؤدي في النهاية إلى تجربة فاشلة ، حيث لن تركز الصورة على الخلايا. هذا هو السبب في أنه من المهم جدا مراقبة المستعمرات يوميا أثناء نموها في الماكينة والبقاء دائما حتى بعد الفحص الأول ، كلما تمت إزالة الصفيحة الدقيقة من الجهاز لتغيير الوسائط ، لضمان التقاط الخلايا بواسطة التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني. هناك مشكلة أخرى قد يسببها الحطام وهي القفز على الصور. عادة ما يكون للمجهر مجالات بصرية ثابتة لا تتحرك ، ولكن عندما يتراكم الحطام ، أو ترتفع كثافة الخلايا بشكل كبير ، قد تفقد الآلة مجال رؤيتها وتقفز إلى جزء مختلف من اللوحة. لتجنب ذلك ، طور مصنعو الماكينة نوعا خاصا من الألواح المكونة من 96 بئرا مع شبكة تمنع فقدان التركيز.

تولد الآلة الحرارة أثناء التقاط الصور. من المهم خفض درجة حرارة الحاضنة التي تحتوي على المجهر إلى 36.5 درجة مئوية حتى يتوازن الجهاز إلى 37 درجة مئوية عند التقاط الصور. عند استخدام الألواح ذات المساحات السطحية الأصغر (96 لوحة بئر) ، ضع في اعتبارك الحرارة الإضافية المتولدة. لا تستخدم الآبار الطرفية للتجارب (الصفان / الأعمدة الأولى والأخيرة) ، وفكر في ملء الآبار المحيطة بالآبار التجريبية بسوائل أخرى (PBS معقم) ، واستخدم شريطا قابلا للتنفس لتقليل فقدان التبخر للوسائط. هناك لوحات يتم تسويقها يمكن التحقيق فيها لتقليل تأثيرات الحافة¹². ومع ذلك ، فقد سمحت الطرق المذكورة أعلاه باستخدام الألواح الدقيقة المتوافقة الموصى بها.

عند تحليل مقاطع الفيديو ، يحتاج المحققون إلى أن يكونوا على دراية بأنماط الانقسام غير الطبيعية من مستعمراتهم. على سبيل المثال ، إذا لم تكن هناك انقسامات داخل العرض لمدة 10 أيام ثم كان هناك تشكيل مستعمرة متفشي ينشأ من حافة مجال الرؤية ، فمن غير المحتمل أن يكون التقسيم الأول لمستعمرة جديدة. من المحتمل أن تكون مستعمرة متنامية من مجال بصري محيط قد تعدت على جزء من اللوحة تم التقاطه بدلا من أن تكون مستعمرة جديدة. يمكن التحقق من ذلك عن طريق تسجيل الدخول إلى مجموعة البرامج ، والتي يمكن أن تصور اللوحة بأكملها (التي تحتوي على جميع طرق العرض المسجلة) في نقاط زمنية محددة وإظهار ترحيل الخلايا من مجال رؤية إلى آخر.

القيد الأساسي لهذه الطريقة هو طبيعتها كثيفة العمالة. أيضا ، يعد تتبع انقسامات الخلايا بعد الجيل^الخامس أمرا صعبا ويتطلب ساعات من العمل ، وإعادة مشاهدة مقاطع الفيديو لالتقاط ما يتم الانقسام ومتى. هناك العديد من خوارزميات تتبع الخلايا الآلية للتعلم العميق التي يتم تطويرها ، والتي ستؤدي في النهاية إلى تحليل قائم على الذكاء الاصطناعي البحت في السنوات القادمة^7،13،14. حتى ذلك الحين ، يعد التتبع اليدوي ، كما هو مفصل في هذا البروتوكول ، طريقة مجدية لتطوير بيانات النسب.

اي.

تم دعم هذا العمل من قبل جائزة مراجعة الجدارة رقم I01 CX001816 من الولايات المتحدة (الولايات المتحدة) قسم شؤون المحاربين القدامى ، العلوم السريرية ، خدمة البحث والتطوير (CSRD). لا تمثل المحتويات وجهات نظر وزارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكية أو حكومة الولايات المتحدة. نشكر الدكتور مايكل روزنبلوم على تزويدنا بإمكانية الوصول إلى مجهر الفاصل الزمني لإجراء تجاربنا.