5-Primer Kemik Tümörü ve Kemik Metastazı Hücre Hatlarında Aminolevulinik Asit Aracılı Fotodinamik Tedavi

Bu protokol, kemik metastatik hücre hatlarının ve primer kemik tümörlerinin 5-aminolevulinik asit aracılı fotodinamik tedaviye (PDT) maruz bırakılması için adım adım metodolojik bir yaklaşım sunar. PDT maruziyetini takiben hücre göç potansiyeli / invazivliği, canlılık, apoptoz ve yaşlanma potansiyeli üzerindeki etkiler de analiz edilir.

Kemik metastazları, etkilenen hastalar için kötü prognoz ve düşük yaşam kalitesi ile ilişkilidir. Fotodinamik tedavi (PDT), lokal metastatik kemik lezyonlarını hedefleyebilen noninvaziv bir tedavi olarak ortaya çıkmaktadır. Bu makale, yapışık hücre hatlarında PDT etkisini incelemek için in vitro bir yöntem sunmaktadır. Bu amaçla, hem primer (dev hücreli kemik tümörü) hem de insan kemiği metastatik kanser hücre hatlarını (primer invaziv duktal meme karsinomu ve renal karsinomdan türetilen) 5-aminolevulinik asit (5-ALA) aracılı PDT'ye tabi tutmak için adım adım bir yaklaşım gösteriyoruz.

5-ALA-PDT ışınlamasından 24 saat sonra (mavi ışık dalga boyu 436 nm), terapötik etki hücre göç potansiyeli, canlılık, apoptotik özellikler ve hücresel büyüme durması (yaşlanma) açısından değerlendirildi. 5-ALA-PDT ışınlamasından sonra, kas-iskelet sistemi kaynaklı hücre hatları aynı dozlara ve PDT'ye maruz kalmaya farklı yanıt verir. PDT maruziyeti ile tetiklenen hücresel hasarın derecesine bağlı olarak, apoptoz ve yaşlanma olmak üzere iki farklı hücre kaderi kaydedildi. Farklı kemik kanseri hücre hatları arasında PDT tedavisine değişken duyarlılık, klinik ortamlarda daha uygun PDT ayarlarının seçilmesi için yararlı bilgiler sağlar. Bu protokol, kas-iskelet sistemi neoplastik hücre hatları bağlamında PDT kullanımını örneklemek için tasarlanmıştır. PDT'nin çeşitli kanser hücre hatları ve çeşitli ışığa duyarlılaştırıcılar ve ışık kaynakları üzerindeki terapötik etkisini araştırmak için ayarlanabilir.

Kemik metastazları için tedavi seçenekleri, onkolojik tedavideki devam eden gelişmelere rağmen hala sınırlı ve zordur. Mevcut standart yöntem, lokal eritem, iç organlara toksisite¹ ve yetersiz kırık² gibi komplikasyonlarla ilişkili olan radyoterapidir. Kemik metastazı olan hastalar sıklıkla ağrı, hiperkalsemi ve nörolojik semptomlardan muzdarip olduklarından, hareket kabiliyetinin bozulması ve yaşam kalitesinin düşmesi nedeniyle alternatif antineoplastik tedavilere ihtiyaç vardır³. Son bulgular, PDT'nin kemik lezyonlarını doğrudan hedeflemek için tek başına veya radyoterapiye destekleyici olarak kullanılabilecek umut verici, alternatif, antineoplastik bir tedavi seçeneği sunduğunu göstermektedir⁴.

PDT'nin mekanizması esas olarak ışıkla uyarılmış ışığa duyarlı bir bileşikten (ışığa duyarlılaştırıcı) doku oksijenine bir enerji transferine dayanır. Bu ışığa duyarlılaştırıcı, nanoskopik düzeyde bir kapasitöre benzer şekilde çalışır. Uygun bir dalga boyunda ışıkla ışınlandığında enerjiyi temel durumda depolayabilir ve uyarılmış bir durumdan orijinal temel duruma⁵ döndüğünde depolanan enerjiyi serbest bırakır. Açığa çıkan enerji iki fotokimyasal reaksiyona yol açar: biri, hidrojen veya bir elektron aktararak oksijenin reaktif oksijen radikallerine dönüşümüdür. İkincisi, ışığa duyarlılaştırıcı substrattan yerel üçlü oksijen parçacıklarına yatay enerji transferi ile tekli oksijen parçacıklarının üretilmesidir⁶. Reaktif oksijen radikalleri ve singlet oksijen molekülleri, lokal tümör hücreleri üzerinde yüksek sitotoksik etkilere sahiptir ve tümör kan damarlarının endotel hücrelerinin apoptozu ile vasküler oklüzyon ve lokal inflamatuar yanıtı indükler⁷.

Konvansiyonel ışığa duyarlılaştırıcılar, hematoporfirinler ve benzoporfirinler gibi porfirin ailesinin türevleridir⁸. Tümör dokusuna daha yüksek afiniteye sahip ışığa duyarlılaştırıcı maddelerin uygulanması PDT⁹ y'nin seçiciliğini artırabilir. Özellikle, protoporfirin IX'un biyosentetik bir öncüsü olan 5-ALA, aktinik keratoz, bazal hücreli karsinom, mesane tümörü ve gastrointestinal kanser gibi tümör hücrelerinde birikebilir⁵. 5-ALA kullanan farklı uygulama yaklaşımları, tümör lokalizasyonu ile ilgili olarak PDT'nin etkinliğini de değiştirebilir. Bu nedenle, PDT uygulaması ile 5-ALA'nın topikal kullanımı, aktinik keratoz^10'a karşı birinci basamak dermatolojik tedavi haline geldi. İnvaziv duktal meme kanseri hücre hatlarının kemik metastazları için son sonuçlar, 5-ALA¹¹ ile PDT'ye maruz kaldıktan sonra hücre göçünün olası inhibisyonunu ve apoptozun indüksiyonunu göstermektedir. Bununla birlikte, kemik dokusu gibi subfasyal insan dokusunda PDT kullanımı, etkinliğin iyileştirilmesi gerektiğinden, hala klinik öncesi ve deneysel klinik aşamasındadır. Nanopartiküllerin ışık bazlı terapi ile uygulamaları diş hekimliğinde zaten büyük etki göstermektedir¹². Bu nedenle, nanopartiküllerin kullanımının PDT ile birleştirilmesinin, uygulama aralığını ortopedik onkolojiye doğru genişletmesi muhtemeldir.

Aşağıdaki protokol, primer kemik tümörlerinden ve kemik metastaz hücre hatlarından kaynaklanan her iki hücrenin nasıl hazırlanacağını ve önceden tanımlanmış bir zaman maruziyeti için 5-ALA aracılı PDT'ye nasıl tabi tutulacağını açıklamaktadır. 5-ALA-PDT ışınlaması sonrası hücresel göç potansiyeli, canlılık ve yaşlanmanın nasıl gerçekleştirileceği ve değerlendirileceğine dair ayrıntılı bir açıklama da dahildir. Adım adım talimatlar, güvenilir ve tekrarlanabilir veriler elde etmek için basit ve özlü bir yaklaşım sağlar. Kemik neoplastik lezyonları için PDT yaklaşımının avantajları, sınırlılıkları ve gelecek perspektifleri de tartışılmıştır.

Üç farklı hücre hattı tipi kullanıldı: renal hücreli karsinomun kemik metastazlarından kaynaklanan bir hücre hattı olan "MAM", invaziv duktal meme karsinomunun kemik metastazları olan "MAC" ve dev hücreli bir kemik tümörü olan "17-1012". Kontrol grubu olarak kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) kullanıldı. Çalışma başlamadan önce kurumsal ve etik onay alınmıştır (proje no: 008/2014BO2-kanser hücre hatları için ve MSC'ler için proje no: 401/2013 BO2).

1. Hücre kültürü

NOT: Kültür ortamı önceden hazırlanabilir. MAM ve 17-1012 için kültür ortamı, %10 (h/h) fetal sığır serumu (FBS) ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş RPMI'den oluşur. MAC ve MSC'ler için kültür ortamı, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamından (DMEM) glutamin ikameli (Malzeme Tablosuna bakınız), %10 (h/h) FBS ile desteklenmiş 4.5 g/L D-glikozdan oluşur.

1. % 80 birleşme elde edilene kadar hücreleri hasat edin ve geçin.
2. Hücreleri 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve PBS'yi bir pipet kullanarak şişeden aspire edin.
   NOT: Bu adım, proteaz inhibitörleri içeren artık tam ortamın uzaklaştırılmasını sağlar.
3. Yapışan hücreleri kültürlendikleri şişenin dibinden ayırmak için 3 mL% 0.05 (h / h) tripsin-EDTA ekleyin.
4. Şişeleri %5 CO 2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de 5 dakika inkübe_edin.
5. Faz kontrast mikroskobu altında hücre ayrılmasını gözlemleyin.
   NOT: Kuluçka süresi her hücre tipi için ayarlanmalıdır. Hücrenin tripsin çözeltisine daha uzun süre maruz kalmasını önleyin (>10 dakika).
6. 3 mL kültür ortamı ekleyerek tripsinizasyonu durdurun.
   NOT: %10 (h/h) FBS içeren her hücre tipi için uygun kültür ortamını eklediğinizden emin olun.
7. Ayrılan hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve 7 ° C'de 350 × g'da 7 dakika santrifüjleyin.
8. Süpernatanı atın.
9. Hücre peletini 1 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin ve daha önce tarif edildiği gibi bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın¹³.

2. PDT kurulumu ve maruz kalma

1. Tüm kabloları ve aksesuarları takarak PDT cihazını hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
2. Gereksiz ışık dağılımını önlemek için odadaki ışığı kısın.
3. Işık fiberini koli bandı yardımıyla doğrudan kuyu plakasının üzerine yerleştirin ve sabitleyin.
   NOT: Tüm hücrelerin ışınlanmasını ve aynı miktarda enerji almasını sağlamak için ışık liflerinin kuyucukların üzerine düzgün bir şekilde dağıtılması arzu edilir (Şekil 1).
4. Işık yoğunluğunda azalmaya neden olabileceğinden, ışık fiberini ciddi şekilde bükmediğinizden veya zarar vermediğinizden emin olun.
5. Işık dağılımını en aza indirmek için kuyu plakalarını alüminyum folyo ile örtün.
6. AÇMA/KAPAMA anahtar düğmesine basarak PDT cihazını açın.
7. Ölçülü kartı PDT cihazının önündeki yuvaya takın.
   NOT: Cihazla birlikte 300 sn maruz kalma süresine karşılık gelen bir ölçülü kart verilir. Ek bir 2.000 s'lik program PDT cihazına otomatik olarak entegre edilir. Her iki pozlama süresi için de ışık, belirtilen süreler boyunca sürekli bir çıkış modunda iletilir.
8. PDT ışık kutusu ekranındaki zamanlayıcının, ölçülen kartta belirtilen süreye değiştiğinden emin olun.
9. Dahili ayak pedalına basarak PDT tedavisine başlayın.
   NOT: Cihaza bir otomatik durdurma işlevi dahil edilmiştir ve sistem otomatik olarak çalışır. Döngü tamamlanmadan önce ışık işlemini durdurmayın veya ışık fiberini çıkarmayın. Işık döngüsünün tamamlanmasının ardından, ışık kaynağı kapağı kapanır ve başka ışık verilmez.

3. Migrasyon tahlili

1. Tohum hücreleri aşağıdaki gibidir: 2 × 10⁴ hücre - MAC, 1 × 10⁴ hücre - MAM, 3 x 10⁴ - 17-1012 ve 2.5 × 10⁴ - MSC'ler opak F-dipli, 6 oyuklu plakalara entegre edilmiş her 2 odacıklı kültür ekine.
2. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 24 saat inkübe edin. Daha sonra ekleri çıkarın.
   NOT: Göç için bir başlangıç referans noktasına ve ilk tarafsız boşluk boyutuna sahip olmak için, daha fazla 5-ALA-PDT maruziyetine maruz kalmayacak (adım 3.3-3.4), bunun yerine doğrudan boyanacak ve nicelleştirilecek (adım 3.5-3.12) ayrı bir plaka kullanılır.
3. Ortamı, 1 mM 5-ALA içeren taze FBS içermeyen ortamla değiştirin.
4. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 4 saat inkübe edin.
   NOT: Kontroller olarak, ek kuyular aynı anda 5-ALA içermeyen ortamla kaplanmalıdır.
5. Hücreleri, bölüm 436'de gösterildiği gibi, 36 s veya 2,000 s'lik önceden tanımlanmış zaman dilimleri için sürekli çıkış modunda mavi ışıklı (300 nm, 2 J/cm2) PDT'ye maruz bırakın.
   NOT: PDT maruziyetine maruz kalmayan plakalar kontrol olarak kullanılmalıdır.
6. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 24 saat inkübe edin.
   NOT: Her hücre tipi için migrasyon derecesini değerlendirmek için hücreleri periyodik olarak kontrol edin. Bu, her hücre hattı için optimize edilmelidir.
7. Hücreleri 1.5 mL PBS ile yıkayın ve daha sonra PBS'yi tamamen çıkarın.
8. Hücreleri PBS'de 1.5 mL% 4 (h / h) paraformaldehit ile 10 dakika boyunca ekleyerek ve inkübe ederek hücreleri sabitleyin.
9. 1.5 mL %70 (h/h) etanol ekleyin ve 10 dakika inkübe edin.
10. Etanolü atın ve plakaların oda sıcaklığında 10 dakika kurumaya bırakın.
11. Hücreleri 1.5 mL %0.2 (h/h) Coomassie mavisi boya ile %90 (h/h) etanol içinde 20 dakika inkübe edin.
12. Plakaları çift damıtılmış suyla yıkayın.
    NOT: Plakaları iyice yıkamak ve kalan kalıntıları temizlemek için plakaları 2-3 kez temiz, çift damıtılmış suya tamamen batırın.
13. Plakaların oda sıcaklığında 24 saat kurumasına izin verin.
    NOT: Bu aşamada, kurutulmuş plakalar en az birkaç hafta oda sıcaklığında saklanabilir.
14. 10 kat büyütmede ters faz kontrast mikroskobu ile hücrelerin boşluklara göçünü görselleştirin ve fotoğraflayın.
    NOT: 5-ALA-PDT'ye maruz kaldıktan sonra 24 saate kadar canlı hücrelerin göçünü gözlemleyin ve fotoğraflayın. Bununla birlikte, sabit hücreler daha sonra saklanabilir ve fotoğraflanabilir.
15. Görüntüleri istenen formatta dışa aktarın ve daha önce açıklandığı gibi bilimsel görüntüleri işlemek ve analiz etmek için yazılım kullanarak boşlukları ölçün¹⁴.

4. Canlılık testi

1. Tüm hücreleri 50 μL kültür ortamında 96 oyuklu plakalarda 1.5 ×^{10: 4} yoğunlukta tohumlayın.
2. Hücreleri standart bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin.
3. 1 mM'lik bir nihai konsantrasyonda 5-ALA içeren 50 μL FBS içermeyen kültür ortamı ekleyin.
4. Hücreleri standart bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 4 saat inkübe edin.
   NOT: Hücreler zaten 50 μL kültür ortamı ile kaplı olduğundan 2x konsantrasyon kullanın. Kültür ortamı ile bir kontrol dahil edilmelidir.
5. Hücreleri, bölüm 436'de belirtildiği gibi, 36 s veya 2,000^s'lik önceden tanımlanmış zaman dilimleri için sürekli çıkış modunda mavi ışıkla (36 nm, 2 J/cm2) PDT'ye maruz bırakın.
   NOT: PDT maruziyetine maruz kalmayan bir negatif kontrol de dahil edilmelidir.
6. Işınlanmış hücreleri standart bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin.
7. Hücrelere 15 μL MTS reaktifi ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 90 dakika inkübe edin.
8. Absorbansı 490 nm dalga boyunda bir spektrofotometre okuyucu ile ölçün.

5. Hücresel büyüme durdurma / yaşlanma testi (β-Galaktosidaz (β-Gal) aktivitesi)

NOT: Burada kullanılan tüm reaktifler ve tamponlar tahlil kitinde sağlanmıştır (Malzeme Tablosuna bakınız).

1. Hücreleri, 100 μL kültür ortamında 96 oyuklu plakalarda 1.5 ×^{10: 4} yoğunlukta tohumlayın. Hücreleri standart bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat, 37 °C,% 5 CO₂ için inkübe edin.
2. 1 mM'lik bir nihai konsantrasyonda 5-ALA ile 100 μL taze FBS içermeyen ortam ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 4 saat inkübe edin.
   NOT: Kontroller olarak, ayrı kuyular aynı anda 5-ALA ışığa duyarlılaştırıcı içermeyen taze ortamla kaplanmalıdır.
3. Hücreleri, bölüm 436'de belirtildiği gibi, 36 s veya 2,000^s'lik önceden tanımlanmış zaman dilimleri için sürekli çıkış modunda mavi ışıkla (36 nm, 2 J/cm2) PDT'ye maruz bırakın.
   NOT: PDT'ye maruz kalmayan bir negatif kontrol plakası da dahil edilmelidir.
4. Hücreleri standart bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de,% 5 CO₂ 'de 24 saat inkübe edin.
5. Ortamı atın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
6. Hücreleri 100 μL 1x hücre lizis tamponu ile örtün ve 4 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
7. Lizatı 350 × g 1'de 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.
8. 50 μL süpernatanı yeni bir 96 oyuklu plakaya pipetleyin ve 50 μL daha 2x tahlil tamponu ekleyin.
9. Yeni 96 oyuklu plakayı 1,5 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
   NOT: Foto ağartmayı önlemek için patlar ışıktan korunmalıdır.
10. Karışımın 50 μL'sini opak duvarlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve 200 μL durdurma çözeltisi ekleyin.
11. Absorbansı 360 nm uyarma/465 nm emisyonda bir floresan mikroplaka okuyucu ile ölçün.

5-ALA PDT maruziyetini takiben, MSC kontrol grubu 5-ALA PDT ışınlamasını takiben migrasyon açısından kayda değer bir etki göstermedi (Şekil 2A, i, v, ix). Buna karşılık, MAC hücreleri (Şekil 1B ve Şekil 2A, iii, vii, xi) ve 17-1012 (Şekil 1B ve Şekil 2A, ii, vi, x) hücre...

Mevcut tedavi seçeneklerine rağmen, kanser terapötik yanıtı değişkendir ve başlangıç doku yapısını korurken kemik metastazlarını tedavi etmek için yeni yaklaşımlar ve hatta kombinasyon tedavileri lehine savunur. Bu bağlamda, PDT umut verici bir alternatiftir. Basit bir bakış açısıyla, PDT iki temel bileşenden oluşur: (1) ışığa duyarlılaştırıcı (PS) olarak adlandırılan toksik olmayan ışığa duyarlı bir boya ve (2) PS'nin absorpsiyon spektrumuna uya...

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Orijinal yayınlardan ortak yazarlarımıza yardımları ve destekleri için teşekkür ederiz.