5-аминолевулиновая кислота-опосредованная фотодинамическая терапия первичных опухолей костей и клеточных линий метастазов в кости

Данный протокол представляет собой пошаговый методологический подход к воздействию линий метастатических клеток костей и первичных опухолей костей на фотодинамическую терапию (ФДТ), опосредованную 5-аминолевулиновой кислотой. Влияние на потенциал/инвазивность миграции клеток, жизнеспособность, апоптоз и потенциал старения также анализируется после воздействия ФДТ.

Метастазы в кости связаны с плохим прогнозом и низким качеством жизни пациентов. Фотодинамическая терапия (ФДТ) является неинвазивной терапией, которая может быть нацелена на локальные метастатические поражения костей. В данной работе представлен метод in vitro для изучения эффекта ФДТ в адгезивных клеточных линиях. С этой целью мы демонстрируем пошаговый подход к тому, чтобы подвергнуть как первичные (гигантоклеточная опухоль кости), так и метастатические раковые линии костей человека (полученные из первичной инвазивной протоковой карциномы молочной железы и почечной карциномы) 5-аминолевулиновой кислоте (5-ALA)-опосредованной ФДТ.

Через 24 ч после облучения 5-ALA-PDT (длина волны синего света 436 нм) терапевтический эффект оценивали с точки зрения потенциала миграции клеток, жизнеспособности, апоптотических особенностей и остановки клеточного роста (старения). После облучения 5-ALA-PDT клеточные линии скелетно-мышечной системы по-разному реагируют на одни и те же дозы и воздействие ФДТ. В зависимости от степени повреждения клеток, вызванного воздействием ФДТ, отмечались две разные судьбы клеток – апоптоз и старение. Вариабельная чувствительность к ФДТ-терапии среди различных клеточных линий рака костей дает полезную информацию для выбора более подходящих условий ФДТ в клинических условиях. Этот протокол разработан для иллюстрации использования ФДТ в контексте неопластических клеточных линий опорно-двигательного аппарата. Он может быть скорректирован для исследования терапевтического эффекта ФДТ на различные линии раковых клеток, различные фотосенсибилизаторы и источники света.

Терапевтические возможности лечения метастазов в костях по-прежнему ограничены и сложны, несмотря на продолжающиеся разработки в области лечения рака. В настоящее время стандартным методом является лучевая терапия, которая связана с такими осложнениями, как местная эритема, токсичность для внутренних органов¹ и недостаточные переломы². Существует потребность в альтернативных противоопухолевых методах лечения, поскольку пациенты с метастазами в кости часто страдают от боли, гиперкальциемии и неврологических симптомов, которые приводят к нарушению подвижности и снижению качества жизни³. Последние результаты показывают, что ФДТ представляет собой многообещающий, альтернативный, противоопухолевый вариант лечения непосредственно нацеленных на поражения костей, который может быть использован отдельно или в качестве поддерживающего^{лучевой терапии}.

Механизм ФДТ в основном основан на передаче энергии от светочувствительного соединения (фотосенсибилизатора) к тканевому кислороду. Этот фотосенсибилизатор работает аналогично конденсатору на наноскопическом уровне. Он может накапливать энергию в основном состоянии при облучении соответствующей длиной волны света и высвобождает накопленную энергию при возвращении из возбужденного состояния в исходное основное состояние⁵. Высвобождаемая энергия приводит к двум фотохимическим реакциям: одна из них — превращение кислорода в активные радикалы кислорода путем переноса водорода или электрона. Во-вторых, это получение синглетных частиц кислорода путем горизонтальной передачи энергии от подложки фотосенсибилизатора к локальным триплетным частицам кислорода⁶. Активные радикалы кислорода и синглетные молекулы кислорода оказывают высокоцитотоксическое действие на локальные опухолевые клетки и индуцируют окклюзию сосудов и местную воспалительную реакцию путем апоптоза эндотелиальных клеток опухолевых кровеносных сосудов⁷.

Обычные фотосенсибилизаторы являются производными семейства порфиринов, таких как гематопорфирины и бензопорфирины⁸. Применение фотосенсибилизирующих веществ с более высоким сродством к опухолевой ткани может повысить селективность ФДТ⁹ лет. В частности, 5-АЛК, который является биосинтетическим предшественником протопорфирина IX, может накапливаться в опухолевых клетках, таких как актинический кератоз, базалиома, опухоль мочевого пузыря^{и рак} желудочно-кишечного тракта. Различные подходы к доставке с использованием 5-ALA также могут варьировать эффективность ФДТ в отношении локализации опухоли. Таким образом, местное применение 5-АЛК с применением ФДТ стало дерматологической терапией первой линии против актинического кератоза¹⁰. Последние результаты по костным метастазам инвазивных протоковых клеточных линий рака молочной железы указывают на возможное ингибирование миграции клеток и индукцию апоптоза после воздействия ФДТ с 5-ALA¹¹. Тем не менее, использование ФДТ в субфасциальных тканях человека, таких как костная ткань, все еще находится на доклинической или экспериментальной клинической стадии, поскольку эффективность необходимо повысить. Применение наночастиц в светотерапии уже показало большое влияние в стоматологии¹². Таким образом, вполне вероятно, что сочетание применения наночастиц с ФДТ расширит область ее применения в сторону ортопедической онкологии.

В следующем протоколе описывается, как препарировать клетки, происходящие из первичных опухолей костей, и клеточные линии костных метастазов, и подвергнуть их 5-ALA-опосредованной PDT в течение заданного времени воздействия. Также включено подробное описание того, как выполнять и оценивать потенциал миграции клеток, жизнеспособность и старение после облучения 5-ALA-PDT. Пошаговые инструкции обеспечивают простой и лаконичный подход к получению надежных и воспроизводимых данных. Также обсуждаются преимущества, ограничения и будущие перспективы подхода ФДТ к опухолевым поражениям костей.

Были использованы три различных типа клеточных линий: "MAM" - клеточная линия, происходящая из костных метастазов почечно-клеточной карциномы, "MAC" - костные метастазы инвазивной протоковой карциномы молочной железы и "17-1012" - гигантоклеточная опухоль кости. В качестве контрольной группы использовали мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из костного мозга. Перед началом исследования было получено институциональное и этическое одобрение (номер проекта: 008/2014BO2 - для линий раковых клеток и номер проекта: 401/2013 BO2 для МСК).

1. Культура клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Питательные среды могут быть приготовлены заранее. Питательная среда для MAM и 17-1012 состоит из RPMI с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 2 мМ L-глутамина. Питательная среда для ПДК и МСК состоит из модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM) с заменителем глутамина (см. Таблицу материалов), 4,5 г/л D-глюкозы с добавлением 10% (v/v) FBS.

1. Забор и пассаж клеток до тех пор, пока не будет достигнуто 80% слияние.
2. Промойте клетки 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и аспирируйте PBS из колбы с помощью пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап обеспечивает удаление остаточной полной среды, содержащей ингибиторы протеазы.
3. Добавьте 3 мл 0,05% (v/v) трипсина-ЭДТА для диссоциации адгезивных клеток со дна колбы, в которой они культивируются.
4. Инкубируйте колбы в течение 5 минут при 37 °C во влажной атмосфере с 5%_CO2.
5. Наблюдайте за отслоением клеток под фазово-контрастным микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации должно быть скорректировано для каждого типа клеток. Не допускайте контакта клеток с раствором трипсина в течение более длительных периодов времени (>10 минут).
6. Остановите трипсинизацию, добавив 3 мл питательной среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно добавьте соответствующую питательную среду для каждого типа клеток, содержащую 10% (v/v) FBS.
7. Перенесите отделенные элементы в центрифужную пробирку и центрифугируйте их в течение 7 мин при 350 × г при 7 °C.
8. Выбросьте надосадочную жидкость.
9. Повторно суспендируйте гранулы клеток в 1 мл питательной среды и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, как описано ранее¹³.

2. Настройка и экспозиция ФДТ

1. Подготовьте устройство PDT (см. Таблицу материалов), подключив все кабели и аксессуары.
2. Приглушите свет в комнате, чтобы избежать ненужного рассеивания света.
3. Расположите и стабилизируйте легкое волокно с помощью клейкой ленты непосредственно на верхней части луночной пластины.
   Примечание: Равномерное распределение световых волокон в верхней части лунок желательно для обеспечения того, чтобы все клетки облучались и получали одинаковое количество энергии (Рисунок 1).
4. Следите за тем, чтобы не сильно погнуть или повредить легкое волокно, так как это может привести к снижению интенсивности света.
5. Накройте пластины лунок алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму рассеивание света.
6. Включите устройство PDT, нажав кнопку ВКЛ/ВЫКЛ.
7. Вставьте измерительную карту в слот на передней панели устройства PDT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В комплект поставки входит одна измерительная карта, соответствующая времени экспозиции 300 с. Дополнительная программа на 2 000 с автоматически интегрируется в устройство PDT. Для обоих периодов экспозиции свет подается в режиме непрерывного выхода в течение указанных периодов.
8. Убедитесь, что таймер на дисплее лайтбокса PDT изменяется на предписанное время, указанное на карте дозирования.
9. Начните процедуру ФДТ, нажав на встроенную ножную педаль.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В устройство встроена функция автоматической остановки, и система работает автоматически. Не останавливайте световой процесс и не удаляйте легкое волокно до завершения цикла. По завершении светового цикла затвор источника света закрывается, и свет больше не подается.

3. Миграционный анализ

1. Затравочные клетки следующие: 2 × 10⁴ клетки - МАС, 1 × 10⁴ клетки - МАМ, 3 х 10⁴ - 17-1012, и 2,5 × 10⁴ - МСК в каждую 2-камерную культуральную вставку, интегрированную в непрозрачные F-образные, 6-луночные планшеты.
2. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%_CO2 в течение 24 ч. После этого снимите вставки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы получить исходную точку отсчета для миграции и начальный размер несмещенного зазора, используется отдельная пластина, которая не будет подвергаться дальнейшему воздействию 5-ALA-PDT (шаги 3.3-3.4), а вместо этого будет непосредственно окрашена и количественно определена (шаги 3.5-3.12).
3. Замените среду свежей средой без FBS, содержащей 1 мМ 5-ALA.
4. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%_CO2 в течение 4 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве контроля дополнительные лунки должны быть одновременно покрыты средой без 5-АЛК.
5. Подвергните элементы воздействию ФДТ с синим светом (436 нм, 36 Дж/^см2) в режиме непрерывного выхода в течение заданных временных интервалов 300 с или 2000 с, как указано в разделе 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты, которые не подвергались воздействию ФДТ, должны использоваться в качестве контроля.
6. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%_CO2 в течение 24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Периодически проверяйте клетки, чтобы оценить степень миграции для каждого типа клеток. Это должно быть оптимизировано для каждой клеточной линии.
7. Промойте клетки 1,5 мл PBS и после этого полностью удалите PBS.
8. Зафиксируйте клетки, добавив и инкубируя клетки с 1,5 мл 4% (v/v) параформальдегида в PBS в течение 10 минут.
9. Добавьте 1,5 мл 70% (v/v) этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
10. Выбросьте этанол и дайте пластинам высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение 10 минут.
11. Инкубируйте клетки с 1,5 мл 0,2% (v/v) синего красителя Кумасси и 90% (v/v) этанола в течение 20 минут.
12. Вымойте тарелки дважды дистиллированной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы тщательно вымыть пластины и удалить оставшийся мусор, полностью погрузите пластины 2-3 раза в чистую воду двойной дистилляции.
13. Дайте пластинам высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе высушенные тарелки можно хранить при комнатной температуре не менее нескольких недель.
14. Визуализируйте и фотографируйте миграцию клеток в щели с помощью обратного фазово-контрастного микроскопа с 10-кратным увеличением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте и фотографируйте миграцию живых клеток в течение 24 часов после воздействия 5-ALA-PDT. Тем не менее, фиксированные клетки могут быть сохранены и сфотографированы позже.
15. Экспортируйте изображения в желаемом формате и количественно оцените пробелы с помощью программного обеспечения для обработки и анализа научных изображений, как описано ранее¹⁴.

4. Анализ жизнеспособности

1. Затравить все клетки при плотности 1,5 × 104^в 96-луночные планшеты в 50 мкл питательной среды.
2. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%_CO2 в течение 24 ч в стандартном инкубаторе для клеточных культур.
3. Добавьте еще 50 мкл питательной среды, не содержащей FBS, содержащей 5-ALA в конечной концентрации 1 мМ.
4. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%_CO2 в течение 4 ч в стандартном инкубаторе для клеточных культур.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте концентрацию в 2 раза, так как клетки уже покрыты 50 мкл питательной среды. Следует включить контроль с питательной средой.
5. Подвергайте клетки воздействию ФДТ синим светом (436 нм, 36 Дж/^см2) в режиме непрерывной выработки в течение заданных временных интервалов 300 с или 2000 с, как указано в разделе 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Также должен быть включен отрицательный контроль, который не подвергается воздействию ФДТ.
6. Облученные клетки инкубируют при 37 °C, 5%_CO2 в течение 24 ч в стандартном инкубаторе для клеточных культур.
7. Добавьте 15 мкл реагента MTS в клетки и инкубируйте клетки в течение 90 мин при 37 °C, 5%_CO2.
8. Измерьте поглощение с помощью спектрофотометрического ридера на длине волны 490 нм.

5. Анализ остановки клеточного роста/старения (активность β-галактозидазы (β-Gal))

ПРИМЕЧАНИЕ: Все использованные здесь реагенты и буферы были предоставлены в наборе для анализа (см. Таблицу материалов).

1. Затравливают клетки при плотности 1,5 × 104^в 96-луночные планшеты в 100 мкл питательной среды. Инкубируйте клетки в течение 24 ч, 37 °C, 5%_CO2 в стандартном инкубаторе для клеточных культур.
2. Добавьте 100 μл свежей среды, не содержащей FBS, с 5-ALA в конечной концентрации 1 мМ и инкубируйте в течение 4 часов при 37 °C, 5%_CO2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве контроля отдельные лунки следует одновременно накрыть свежей средой без фотосенсибилизатора 5-ALA.
3. Подвергайте клетки воздействию ФДТ синим светом (436 нм, 36 Дж/^см2) в режиме непрерывной выработки в течение заданных временных интервалов 300 с или 2000 с, как указано в разделе 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В комплект также должна входить отрицательная контрольная пластина, которая не подвергается воздействию ФДТ.
4. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C, 5%_CO2 в стандартном инкубаторе для клеточных культур.
5. Выбросьте средство и промойте клетки два раза PBS.
6. Налейте на клетки 100 мкл 1x буфера для лизиса клеток и инкубируйте в течение 5 минут при 4 °C.
7. Центрифугируйте лизат при 350 × г 1 в течение 10 мин при 4 °C и соберите надосадочную жидкость.
8. Пипеткой внесите 50 мкл надосадочной жидкости в новый 96-луночный планшет и добавьте еще 50 мкл 2-кратного буфера для анализа.
9. Поместите новый планшет на 96 лунок в инкубатор с температурой 37 °C на 1,5 часа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Паштеты должны быть защищены от света во избежание фотообесцвечивания.
10. Перелейте 50 μL смеси в 96-луночный планшет с непрозрачными стенками и добавьте 200 μL стоп-раствора.
11. Измерьте поглощение с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера при возбуждении 360 нм/излучении 465 нм.

После воздействия 5-АЛК ФДТ контрольная группа МСК не показала заметного эффекта с точки зрения миграции после облучения 5-АЛК ФДТ (рис. 2A, i, v, ix). Напротив, клетки MAC (рис. 1B и рис. 2A, iii, vii, xi) и 17-1012 (

Несмотря на существующие варианты лечения, терапевтический ответ на рак вариафичен, что свидетельствует в пользу новых подходов или даже комбинированных методов лечения метастазов в костях с сохранением исходной структуры ткани. В этом контексте ФДТ является персп?...

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарим наших соавторов из оригинальных публикаций за помощь и поддержку.