5-טיפול פוטודינמי בתיווך חומצה אמינולוולינית על גידול עצם ראשוני וגרורות בעצמות קווי תאים

פרוטוקול זה מציג גישה מתודולוגית שלב אחר שלב של חשיפת קווי תאים גרורתיים בעצם וגידולי עצם ראשוניים לטיפול פוטודינמי בתיווך חומצה אמינולוולינית (PDT). ההשפעות על פוטנציאל נדידת התאים/פולשניות, כדאיות, אפופטוזיס ופוטנציאל הזדקנות מנותחות גם בעקבות חשיפה ל-PDT.

גרורות בעצמות קשורות לפרוגנוזה גרועה ולאיכות חיים נמוכה עבור החולים הנגועים. טיפול פוטודינמי (PDT) מתגלה כטיפול לא פולשני שיכול להתמקד בנגעים גרורתיים מקומיים בעצמות. מאמר זה מציג שיטה חוץ גופית לחקר השפעת PDT בשורות תאים דבקות. לשם כך, אנו מדגימים גישה צעד אחר צעד להכפיף הן קווי תאי סרטן ראשוניים (גידול עצם ענק) והן קווי תאי סרטן גרורתי בעצמות אנושיות (שמקורם בקרצינומה של שד פולשני ראשוני וקרצינומה כלייתית) ל-PDT בתיווך חומצה 5-אמינולוולינית (5-ALA).

לאחר 24 שעות לאחר הקרנת 5-ALA-PDT (אורך גל אור כחול 436 ננומטר), ההשפעה הטיפולית הוערכה במונחים של פוטנציאל נדידת תאים, כדאיות, תכונות אפופטוטיות ועצירת גדילה תאית (הזדקנות). לאחר הקרנת 5-ALA-PDT, קווי תאים שמקורם בשרירים ושלד מגיבים באופן שונה לאותם מינונים וחשיפה ל-PDT. בהתאם למידת הנזק התאי המופעל על ידי חשיפה ל-PDT, צוינו שני גורלות תאים שונים - אפופטוזיס והזדקנות. רגישות משתנה לטיפול ב-PDT בין קווי תאים שונים של סרטן העצם מספקת מידע שימושי לבחירת הגדרות PDT מתאימות יותר במסגרות קליניות. פרוטוקול זה נועד להדגים את השימוש ב-PDT בהקשר של קווי תאים ניאופלסטיים שרירים ושלד. ניתן להתאים אותו כדי לחקור את ההשפעה הטיפולית של PDT על קווי תאים סרטניים שונים ורגישים לאור ומקורות אור שונים.

האפשרויות הטיפוליות בגרורות בעצמות עדיין מוגבלות ומאתגרות למרות ההתפתחויות המתמשכות בטיפול האונקולוגי. השיטה הסטנדרטית הנוכחית היא רדיותרפיה, הקשורה לסיבוכים כגון אריתמה מקומית, רעילות לאיברים פנימיים¹ ושברים לא מספיקים². יש צורך בטיפולים אנטי-ניאופלסטיים אלטרנטיביים מכיוון שחולים עם גרורות בעצמות סובלים לעתים קרובות מכאבים, היפרקלצמיה ותסמינים נוירולוגיים הגורמים לפגיעה בניידות ולירידה באיכות החיים³. ממצאים אחרונים מראים כי PDT מספק אפשרות טיפול מבטיחה ואנטי-ניאופלסטית להתמקדות ישירה בנגעי עצם, שניתן להשתמש בהם לבד או כתמיכה לרדיותרפיה⁴.

המנגנון של PDT מבוסס בעיקרו על העברת אנרגיה מתרכובת רגישה לאור מעוררת אור (רגישות לאור) לחמצן ברקמות. רגישות לאור זו פועלת באופן דומה לקבל ברמה ננוסקופית. הוא יכול לאגור אנרגיה במצב קרקע כאשר הוא מוקרן באורך גל מתאים של אור ומשחרר אנרגיה מאוחסנת כאשר הוא חוזר ממצב נרגש למצב הקרקע המקורי⁵. האנרגיה המשתחררת מובילה לשתי תגובות פוטוכימיות: האחת היא הפיכת חמצן לרדיקלי חמצן תגובתיים על ידי העברת מימן או אלקטרון. השני הוא ייצור חלקיקי חמצן בודדים על ידי העברת אנרגיה אופקית מהמצע הרגיש לאור לחלקיקי חמצן משולשים מקומיים⁶. לרדיקלי חמצן תגובתיים ומולקולות חמצן בודדות יש השפעות ציטוטוקסיות מאוד על תאי גידול מקומיים וגורמים לחסימת כלי דם ותגובה דלקתית מקומית על ידי אפופטוזיס של תאי אנדותל של כלי הדם של הגידול⁷.

רגישים לאור קונבנציונליים הם נגזרות ממשפחת הפורפירינים כגון המטופורפירינים ובנזופורפירינים⁸. מריחת חומרים רגישים לאור בעלי זיקה גבוהה יותר לרקמת הגידול יכולה להגביר את הסלקטיביות של PDT⁹ y. בפרט, 5-ALA, שהוא קודמן ביוסינתטי של פרוטופורפירין IX, יכול להצטבר בתאי גידול כגון קרטוזיס אקטיני, קרצינומה של תאי בסיס, גידול בשלפוחית השתן וסרטן מערכת העיכול⁵. גישות אספקה שונות המשתמשות ב-5-ALA יכולות גם לשנות את היעילות של PDT ביחס ללוקליזציה של הגידול. לפיכך, שימוש מקומי ב-5-ALA עם יישום PDT הפך לטיפול דרמטולוגי קו ראשון נגד קרטוזיס אקטיני¹⁰. תוצאות אחרונות של גרורות בעצמות של קווי תאי סרטן שד פולשניים מצביעות על עיכוב אפשרי של נדידת תאים ואינדוקציה של אפופטוזיס לאחר חשיפה ל-PDT עם 5-ALA¹¹. עם זאת, השימוש ב-PDT ברקמות אנושיות תת-פאשיאליות כמו רקמת עצם עדיין נמצא בשלב הקליני הפרה-קליני עד הניסיוני שלו מכיוון שיש לשפר את היעילות. יישומים של ננו-חלקיקים עם טיפול מבוסס אור כבר מראים השפעה רבה ברפואת שיניים¹². לפיכך, סביר להניח ששילוב השימוש בננו-חלקיקים עם PDT ירחיב את טווח היישומים שלו לכיוון אונקולוגיה אורתופדית.

הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להכין את שני התאים שמקורם בגידולי עצם ראשוניים ובקווי תאים של גרורות בעצמות ולהכפיף אותם ל-PDT בתיווך 5-ALA לחשיפה מוגדרת מראש. כלול גם תיאור מפורט כיצד לבצע ולהעריך את פוטנציאל הנדידה התאית, החיוניות וההזדקנות לאחר הקרנת 5-ALA-PDT. הוראות שלב אחר שלב מספקות גישה פשוטה ותמציתית לרכישת נתונים אמינים וניתנים לשחזור. נדונים גם היתרונות, המגבלות והפרספקטיבות העתידיות של גישת PDT לנגעים ניאופלסטיים בעצמות.

נעשה שימוש בשלושה סוגים שונים של קווי תאים: "MAM" - קו תאים שמקורו בגרורות בעצמות של קרצינומה של תאי כליה, "MAC" - גרורות בעצמות של קרצינומה פולשנית של שד, ו- "17-1012" - גידול תאי ענק של עצם. תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח (MSCs) שימשו כקבוצת ביקורת. אישור מוסדי ואתי התקבל לפני תחילת המחקר (מספר פרויקט: 008/2014BO2 עבור קווי התאים הסרטניים ומספר הפרויקט: 401/2013 BO2 עבור MSCs).

1. תרבית תאים

הערה: ניתן להכין מדיה תרבותית מראש. מדיום התרבית עבור MAM ו-17-1012 מורכב מ-RPMI בתוספת 10% (v/v) סרום בקר עוברי (FBS) ו-2 מ"מ L-גלוטמין. מדיום התרבית עבור MAC ו-MSCs מורכב ממדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) עם תחליף גלוטמין (ראה טבלת החומרים), 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז בתוספת 10% (v/v) FBS.

1. קציר ומעבר תאים עד להשגת מפגש של 80%.
2. שטפו את התאים עם 5 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) ושאבו את ה-PBS מהבקבוק באמצעות פיפטה.
   הערה: שלב זה מבטיח הסרה של שאריות מדיום שלם המכיל מעכבי פרוטאז.
3. הוסף 3 מ"ל של 0.05% (v/v) טריפסין-EDTA כדי לנתק את התאים הדבקים מתחתית הבקבוק בו הם מתורבתים.
4. דגרו את הצלוחיות למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5% CO₂.
5. התבונן בניתוק התא תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה.
   הערה: יש להתאים את זמן הדגירה לכל סוג תא. יש למנוע חשיפת תאים לתמיסת טריפסין לתקופות ארוכות יותר (>10 דקות).
6. עצור את הטריפסיניזציה על ידי הוספת תוספת של 3 מ"ל של מדיום תרבית.
   הערה: הקפד להוסיף את מדיום התרבית המתאים לכל סוג תא המכיל 10% (v/v) FBS.
7. העבירו את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה אותם למשך 7 דקות בטמפרטורה של 350 × גרם ב-7 מעלות צלזיוס.
8. השליכו את הסופרנטנט.
9. השעו מחדש את כדור התאים ב-1 מ"ל של מדיום תרבית וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר כמתואר קודם לכן¹³.

2. הגדרת PDT וחשיפה

1. הכן את מכשיר ה-PDT (ראה טבלת החומרים) על ידי חיבור כל הכבלים והאביזרים.
2. עמעמו את האור בחדר כדי למנוע פיזור אור מיותר.
3. מקם וייצב את סיב האור בעזרת סרט דביק ישירות על גבי צלחת הבאר.
   הערה: רצוי פיזור אחיד של סיבי האור על גבי הבארות כדי להבטיח שכל התאים מוקרנים ומקבלים את אותה כמות אנרגיה (איור 1).
4. הקפד לא לכופף או לפגוע קשות בסיב האור מכיוון שהדבר עלול להוביל להפחתה בעוצמת האור.
5. מכסים את צלחות הבאר בנייר אלומיניום כדי למזער את פיזור האור.
6. הפעל את מכשיר ה-PDT על ידי לחיצה על לחצן מתג ההפעלה/כיבוי .
7. הכנס את הכרטיס הנמדד לחריץ בחזית התקן ה-PDT.
   הערה: כרטיס מדידה אחד מסופק עם המכשיר המתאים לזמן חשיפה של 300 שניות. תוכנית נוספת של 2,000 שניות משולבת אוטומטית במכשיר ה-PDT. בשני זמני החשיפה, האור מועבר במצב פלט רציף לתקופות שצוינו.
8. ודא שהטיימר בתצוגת תיבת האור PDT משתנה לזמן שנקבע המצוין בכרטיס המדוד.
9. התחל את הטיפול ב-PDT על ידי לחיצה על דוושת כף הרגל המשולבת.
   הערה: פונקציית עצירה אוטומטית משולבת בהתקן, והמערכת פועלת אוטומטית. אין להפסיק את תהליך האור או להסיר את סיב האור לפני השלמת המחזור. בסיום מחזור האור, תריס מקור האור נסגר ולא מועבר אור נוסף.

3. בדיקת הגירה

1. תאי זרעים כדלקמן: 2 × 10⁴ תאים - MAC, 1 × 10⁴ תאים - MAM, 3 x 10⁴ - 17-1012, ו- 2.5 × 10⁴ - MSCs לכל תרבית דו-קאמרית משולבת בצלחות אטומות עם 6 בארות.
2. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 24 שעות. הסר את התוספות לאחר מכן.
   הערה: כדי לקבל נקודת ייחוס התחלתית לנדידה ולגודל הפער הראשוני הבלתי מוטה, נעשה שימוש בלוח נפרד, שלא יהיה נתון לחשיפה נוספת של 5-ALA-PDT (שלבים 3.3-3.4) אלא צבוע ומכומת ישירות (שלבים 3.5-3.12).
3. החלף את המדיום במדיום טרי נטול FBS המכיל 1 מ"מ של 5-ALA.
4. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 4 שעות.
   הערה: כבקרות, בארות נוספות צריכות להיות מכוסות במקביל במדיום ללא 5-ALA.
5. הכניסו את התאים ל-PDT עם אור כחול (436 ננומטר, 36 J/cm²) במצב פלט רציף עבור מסגרות זמן מוגדרות מראש של 300 שניות או 2,000 שניות, כפי שמצוין בסעיף 2.
   הערה: יש להשתמש בלוחות שאינם נתונים לחשיפת PDT כבקרות.
6. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 24 שעות.
   הערה: בדוק את התאים מעת לעת כדי להעריך את מידת הנדידה עבור כל סוג תא. יש למטב זאת עבור כל שורת תא.
7. שטפו את התאים עם 1.5 מ"ל PBS והסירו לחלוטין את ה- PBS לאחר מכן.
8. תקן את התאים על ידי הוספה ודגירה של התאים עם 1.5 מ"ל של 4% (v/v) paraformaldehyde ב-PBS למשך 10 דקות.
9. הוסף 1.5 מ"ל של 70% אתנול (v/v) ודגירה למשך 10 דקות.
10. השליכו את האתנול והניחו לצלחות להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
11. דגרו את התאים עם 1.5 מ"ל של 0.2% (v/v) צבע כחול Coomassie באתנול 90% (v/v) למשך 20 דקות.
12. שוטפים את הצלחות במים מזוקקים כפולים.
    הערה: כדי לשטוף היטב את הצלחות ולהסיר את הפסולת שנותרה, טבלו את הצלחות במלואן 2-3 פעמים במים נקיים ומזוקקים כפולים.
13. הניחו לצלחות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
    הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את הצלחות המיובשות בטמפרטורת החדר למשך מספר שבועות לפחות.
14. דמיין וצלם את נדידת התאים לרווחים עם מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה בהגדלה של פי 10.
    הערה: התבונן וצלם את נדידת התאים החיים עד 24 שעות לאחר חשיפה ל-5-ALA-PDT. עם זאת, ניתן לאחסן תאים קבועים ולצלם אותם מאוחר יותר.
15. ייצא את התמונות בפורמט הרצוי וכימת את הפערים באמצעות תוכנה לעיבוד וניתוח תמונות מדעיות כמתואר קודם לכן¹⁴.

4. בדיקת כדאיות

1. זרע את כל התאים בצפיפות של 1.5 × 10⁴ בצלחות של 96 בארות ב -50 מיקרוליטר של מדיום תרבית.
2. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 24 שעות בחממת תרבית תאים רגילה.
3. הוסף 50 מיקרוליטר נוספים של מדיום תרבית נטול FBS המכיל 5-ALA בריכוז סופי של 1 מ"מ.
4. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 4 שעות בחממת תרבית תאים רגילה.
   הערה: השתמש בריכוז פי 2 מכיוון שהתאים כבר מכוסים ב-50 מיקרוליטר של מדיום תרבית. יש לכלול שליטה עם מדיום תרבותי.
5. חשוף את התאים לחשיפת PDT עם אור כחול (436 ננומטר, 36 J/cm²) במצב פלט רציף עבור מסגרות זמן מוגדרות מראש של 300 שניות או 2,000 שניות, כפי שמצוין בסעיף 2.
   הערה: יש לכלול גם בקרה שלילית שאינה נתונה לחשיפה ל-PDT.
6. דגרו על התאים המוקרנים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 24 שעות בחממת תרבית תאים רגילה.
7. הוסף 15 מיקרוליטר של מגיב MTS לתאים ודגר את התאים למשך 90 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
8. מדוד את הספיגה בעזרת קורא ספקטרופוטומטר באורך גל של 490 ננומטר.

5. בדיקת עצירת צמיחה תאית / הזדקנות (פעילות β-Galactosidase( β-Gal)

הערה: כל הריאגנטים והמאגרים המשמשים כאן סופקו בערכת הבדיקה (ראה טבלת החומרים).

1. זרע את התאים בצפיפות של 1.5 × 10⁴ בצלחות של 96 בארות ב -100 מיקרוליטר של מדיום תרבית. דגרו על התאים למשך 24 שעות, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ בחממת תרבית תאים רגילה.
2. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום טרי נטול FBS עם 5-ALA בריכוז סופי של 1 מ"מ ודגירה למשך 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
   הערה: כבקרות, בארות נפרדות צריכות להיות מכוסות במקביל במדיום טרי ללא רגישות לאור 5-ALA.
3. חשוף את התאים לחשיפת PDT עם אור כחול (436 ננומטר, 36 J/cm²) במצב פלט רציף עבור מסגרות זמן מוגדרות מראש של 300 שניות או 2,000 שניות, כפי שמצוין בסעיף 2.
   הערה: יש לכלול גם לוחית בקרה שלילית שאינה חשופה ל-PDT.
4. דגרו על התאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ בחממת תרבית תאים רגילה.
5. השליכו את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם PBS.
6. מכסים את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר ליזה של תאים 1x ודוגרים למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
7. צנטריפוגה את הליזאט ב-350 × גרם 1 למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ואוספים את הסופרנטנט.
8. פיפטה 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצלחת חדשה של 96 בארות והוסף עוד 50 מיקרוליטר של מאגר בדיקה פי 2.
9. הנח את הצלחת החדשה של 96 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי.
   הערה: יש להגן על הפטות מפני אור כדי למנוע הלבנת אור.
10. מעבירים 50 מיקרוליטר מהתערובת לצלחת אטומה של 96 בארות ומוסיפים 200 מיקרוליטר של תמיסת עצירה.
11. מדוד את הספיגה עם קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי בעירור של 360 ננומטר/פליטה של 465 ננומטר.

בעקבות חשיפה ל-5-ALA PDT, קבוצת הביקורת של MSC לא הראתה השפעה בולטת במונחים של נדידה לאחר הקרנת 5-ALA PDT (איור 2A, i, v, ix). לעומת זאת, תאי MAC (איור 1B ואיור 2A, iii, vii, xi) ותאי 17-1012 (איור 1B ואיור 2A

למרות אפשרויות הטיפול הנוכחיות, התגובה הטיפולית בסרטן משתנה, ודוגלת בגישות חדשות או אפילו טיפולים משולבים לטיפול בגרורות בעצמות תוך שמירה על מבנה הרקמה הראשוני. בהקשר זה, PDT היא אלטרנטיבה מבטיחה. מנקודת מבט פשטנית, PDT מורכב משני מרכיבים בסיסיים: (1) צבע רגיש לאור לא רעיל הנ...

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

אנו מודים למחברים השותפים שלנו מהפרסומים המקוריים על עזרתם ותמיכתם.