5-Aminolävulinsäure-vermittelte photodynamische Therapie an primären Knochentumor- und Knochenmetastasenzelllinien

Dieses Protokoll stellt einen schrittweisen methodischen Ansatz vor, um knochenmetastasierende Zelllinien und primäre Knochentumoren einer 5-Aminolävulinsäure-vermittelten photodynamischen Therapie (PDT) auszusetzen. Die Auswirkungen auf das Zellmigrationspotenzial/die Invasivität, die Lebensfähigkeit, die Apoptose und das Seneszenzpotenzial werden ebenfalls nach PDT-Exposition analysiert.

Knochenmetastasen sind mit einer schlechten Prognose und einer geringen Lebensqualität der betroffenen Patienten verbunden. Die photodynamische Therapie (PDT) entwickelt sich zu einer nicht-invasiven Therapie, die auf lokale metastasierende Knochenläsionen abzielen kann. In dieser Arbeit wird eine in vitro Methode vorgestellt, um den PDT-Effekt in adhärenten Zelllinien zu untersuchen. Zu diesem Zweck demonstrieren wir einen Schritt-für-Schritt-Ansatz, um sowohl primäre (Riesenzellknochentumor) als auch humane knochenmetastasierende Krebszelllinien (abgeleitet von einem primären invasiven duktalen Mammakarzinom und Nierenkarzinom) einer 5-Aminolävulinsäure (5-ALA)-vermittelten PDT zu unterziehen.

Nach 24 Stunden nach 5-ALA-PDT-Bestrahlung (blaues Licht, Wellenlänge 436 nm) wurde der therapeutische Effekt in Bezug auf das Zellmigrationspotenzial, die Lebensfähigkeit, die apoptotischen Eigenschaften und den zellulären Wachstumsstillstand (Seneszenz) untersucht. Nach der 5-ALA-PDT-Bestrahlung reagieren muskuloskelettale Zelllinien unterschiedlich auf die gleichen Dosen und die gleiche Exposition wie bei der PDT. Abhängig vom Ausmaß der zellulären Schädigung, die durch die PDT-Exposition ausgelöst wurde, wurden zwei unterschiedliche Zellschicksale - Apoptose und Seneszenz - festgestellt. Die unterschiedliche Empfindlichkeit der PDT-Therapie bei verschiedenen Knochenkrebszelllinien liefert nützliche Informationen für die Auswahl geeigneter PDT-Einstellungen im klinischen Umfeld. Dieses Protokoll soll beispielhaft für die Anwendung der PDT im Zusammenhang mit muskuloskelettalen neoplastischen Zelllinien stehen. Es kann angepasst werden, um die therapeutische Wirkung der PDT auf verschiedene Krebszelllinien und verschiedene Photosensibilisatoren und Lichtquellen zu untersuchen.

Die Therapiemöglichkeiten für Knochenmetastasen sind trotz der Weiterentwicklung der onkologischen Behandlung nach wie vor begrenzt und herausfordernd. Die derzeitige Standardmethode ist die Strahlentherapie, die mit Komplikationen wie lokalem Erythem, Toxizität für die inneren Organe¹ und unzureichenden Frakturen² verbunden ist. Es besteht ein Bedarf an alternativen antineoplastischen Therapien, da Patienten mit Knochenmetastasen häufig unter Schmerzen, Hyperkalzämie und neurologischen Symptomen leiden, die zu einer eingeschränkten Mobilität und einer verminderten Lebensqualität führen³. Jüngste Erkenntnisse zeigen, dass die PDT eine vielversprechende, alternative, antineoplastische Behandlungsoption zur direkten Behandlung von Knochenläsionen darstellt, die allein oder unterstützend zur Strahlentherapie eingesetzt werden kann⁴.

Der Mechanismus der PDT beruht im Wesentlichen auf einem Energietransfer von einer lichtangeregten lichtempfindlichen Verbindung (Photosensibilisator) auf Gewebesauerstoff. Dieser Photosensibilisator funktioniert auf nanoskopischer Ebene ähnlich wie ein Kondensator. Er kann Energie im Grundzustand speichern, wenn er mit einer geeigneten Lichtwellenlänge bestrahlt wird, und gibt gespeicherte Energie wieder ab, wenn er aus einem angeregten Zustand in den ursprünglichen Grundzustand zurückkehrt⁵. Die freigesetzte Energie führt zu zwei photochemischen Reaktionen: Die eine ist die Umwandlung von Sauerstoff in reaktive Sauerstoffradikale durch Übertragung von Wasserstoff oder einem Elektron. Die zweite ist die Erzeugung von Singulett-Sauerstoffpartikeln durch horizontale Energieübertragung vom Photosensibilisatorensubstrat auf lokale Triplett-Sauerstoffpartikel⁶. Reaktive Sauerstoffradikale und Singulett-Sauerstoffmoleküle haben eine stark zytotoxische Wirkung auf lokale Tumorzellen und induzieren einen Gefäßverschluss und eine lokale Entzündungsreaktion durch Apoptose von Endothelzellen der Tumorblutgefäße⁷.

Herkömmliche Photosensibilisatoren sind Derivate der Porphyrinfamilie wie Hämatoporphyrine und Benzoporphyrine⁸. Die Applikation von photosensibilisierenden Substanzen mit höherer Affinität zum Tumorgewebe kann die Selektivität von PDT⁹ y erhöhen. Insbesondere 5-ALA, ein biosynthetischer Vorläufer von Protoporphyrin IX, kann sich in Tumorzellen wie aktinischer Keratose, Basalzellkarzinom, Blasentumor und Magen-Darm-Krebs anreichern⁵. Unterschiedliche Verabreichungsansätze mit 5-ALA können auch die Effizienz der PDT in Bezug auf die Tumorlokalisation variieren. So wurde die topische Anwendung von 5-ALA mit der Anwendung von PDT zur dermatologischen Erstlinientherapie gegen aktinische Keratose¹⁰. Neuere Ergebnisse für Knochenmetastasen invasiver duktaler Brustkrebszelllinien deuten auf eine mögliche Hemmung der Zellmigration und Induktion der Apoptose nach Exposition gegenüber PDT mit 5-ALA^{hin 11}. Die Anwendung der PDT in subfaszialem menschlichem Gewebe wie Knochengewebe befindet sich jedoch noch im präklinischen bis experimentellen klinischen Stadium, da die Wirksamkeit verbessert werden muss. Anwendungen von Nanopartikeln mit lichtbasierter Therapie zeigen bereits große Auswirkungen in der Zahnmedizin¹². Daher ist es wahrscheinlich, dass die Kombination der Verwendung von Nanopartikeln mit der PDT den Anwendungsbereich in Richtung orthopädischer Onkologie erweitern wird.

Das folgende Protokoll beschreibt, wie sowohl Zellen, die aus primären Knochentumoren stammen, als auch Knochenmetastasenzelllinien präpariert und einer 5-ALA-vermittelten PDT für einen vordefinierten Zeitraum unterzogen werden. Eine detaillierte Beschreibung der Durchführung und Beurteilung des zellulären Migrationspotenzials, der Vitalität und der Seneszenz nach 5-ALA-PDT-Bestrahlung ist ebenfalls enthalten. Schritt-für-Schritt-Anleitungen bieten einen einfachen und prägnanten Ansatz, um zuverlässige und reproduzierbare Daten zu erhalten. Die Vorteile, Grenzen und Zukunftsperspektiven des PDT-Ansatzes bei neoplastischen Knochenläsionen werden ebenfalls diskutiert.

Es wurden drei verschiedene Arten von Zelllinien verwendet: "MAM" - eine Zelllinie, die aus Knochenmetastasen des Nierenzellkarzinoms stammt, "MAC" - Knochenmetastasen eines invasiven duktalen Mammakarzinoms und "17-1012" - ein riesigzelliger Tumor des Knochens. Als Kontrollgruppe wurden aus dem Knochenmark gewonnene mesenchymale Stammzellen (MSCs) verwendet. Die institutionelle und ethische Genehmigung wurde vor Beginn der Studie eingeholt (Projektnummer: 008/2014BO2 für die Krebszelllinien und Projektnummer: 401/2013 BO2 für MSCs).

1. Zellkultur

HINWEIS: Nährmedien können im Voraus vorbereitet werden. Das Nährmedium für MAM und 17-1012 besteht aus RPMI, das mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) und 2 mM L-Glutamin ergänzt wird. Das Nährmedium für MAC und MSC besteht aus Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) mit Glutaminersatz (siehe Materialtabelle), 4,5 g/L D-Glucose, ergänzt mit 10% (v/v) FBS.

1. Ernte und Passage der Zellen, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist.
2. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und aspirieren Sie das PBS mit einer Pipette aus dem Kolben.
   HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass das restliche vollständige Medium, das Proteaseinhibitoren enthält, entfernt wird.
3. 3 ml 0,05 % (v/v) Trypsin-EDTA werden zugegeben, um die adhärenten Zellen vom Boden des Kolbens, in dem sie kultiviert werden, zu dissoziieren.
4. Die Kolben werden 5 Minuten lang bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubiert.
5. Beobachten Sie die Zellablösung unter einem Phasenkontrastmikroskop.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit muss für jeden Zelltyp angepasst werden. Verhindern Sie die Exposition der Zellen gegenüber Trypsinlösung über einen längeren Zeitraum (>10 Minuten).
6. Stoppen Sie die Trypsinisierung, indem Sie 3 ml Nährmedium hinzufügen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie für jeden Zelltyp, der 10 % (v/v) FBS enthält, das entsprechende Kulturmedium hinzufügen.
7. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein Zentrifugationsröhrchen und zentrifugieren Sie sie 7 min lang bei 350 × g bei 7 °C.
8. Entsorgen Sie den Überstand.
9. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Kulturmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, wie zuvor beschrieben¹³.

2. PDT-Einrichtung und Belichtung

1. Bereiten Sie das PDT-Gerät vor (siehe Materialtabelle), indem Sie alle Kabel und Zubehörteile anschließen.
2. Dimmen Sie das Licht im Raum, um unnötige Lichtverluste zu vermeiden.
3. Positionieren und stabilisieren Sie die Lichtfaser mit Hilfe von Klebeband direkt auf der Well-Platte.
   HINWEIS: Eine gleichmäßige Verteilung der Lichtfasern auf den Vertiefungen ist erwünscht, um sicherzustellen, dass alle Zellen bestrahlt werden und die gleiche Menge an Energie erhalten (Abbildung 1).
4. Achten Sie darauf, die Lichtfaser nicht stark zu verbiegen oder zu beschädigen, da dies zu einer Verringerung der Lichtintensität führen kann.
5. Decken Sie die Well-Platten mit Aluminiumfolie ab, um die Lichtableitung zu minimieren.
6. Schalten Sie das PDT-Gerät ein, indem Sie die EIN-/AUS-Schaltertaste drücken.
7. Setzen Sie die getaktete Karte in den Steckplatz an der Vorderseite des PDT-Geräts ein.
   HINWEIS: Im Lieferumfang des Geräts ist eine getaktete Karte enthalten, die einer Belichtungszeit von 300 s entspricht. Ein zusätzliches 2.000-s-Programm wird automatisch in das PDT-Gerät integriert. Für beide Belichtungszeiten wird das Licht für die angegebenen Zeiträume in einem kontinuierlichen Ausgabemodus abgegeben.
8. Stellen Sie sicher, dass der Timer auf dem PDT-Lightbox-Display auf die auf der gemessenen Karte angegebene Zeit wechselt.
9. Starten Sie die PDT-Behandlung, indem Sie das eingebaute Fußpedal betätigen.
   HINWEIS: Das Gerät verfügt über eine automatische Stoppfunktion, und das System läuft automatisch. Stoppen Sie den Lichtvorgang nicht und entfernen Sie die Lichtfaser nicht, bevor der Zyklus abgeschlossen ist. Nach Beendigung des Lichtzyklus wird die Lichtquellenklappe geschlossen und es wird kein weiteres Licht abgegeben.

3. Migrations-Assay

1. Keimzellen wie folgt: 2 × 10⁴ Zellen - MAC, 1 × 10⁴ Zellen - MAM, 3 x 10⁴ - 17-1012 und 2,5 × 10⁴ - MSCs in jeden 2-Kammer-Kultureinsatz, der in undurchsichtige 6-Well-Platten mit F-Boden integriert ist.
2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ für 24 h. Entfernen Sie anschließend die Einsätze.
   HINWEIS: Um einen Ausgangsreferenzpunkt für die Migration und die anfängliche unverzerrte Spaltgröße zu erhalten, wird eine separate Platte verwendet, die keiner weiteren 5-ALA-PDT-Exposition (Schritte 3.3-3.4) unterzogen, sondern direkt gefärbt und quantifiziert wird (Schritte 3.5-3.12).
3. Ersetzen Sie das Medium durch frisches FBS-freies Medium, das 1 mM 5-ALA enthält.
4. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ für 4 h.
   HINWEIS: Als Kontrollen sollten zusätzliche Vertiefungen gleichzeitig mit Medium ohne 5-ALA abgedeckt werden.
5. Die Zellen werden einer PDT mit blauem Licht (436 nm, 36 J/cm²) in einem kontinuierlichen Ausgabemodus für vordefinierte Zeiträume von 300 s oder 2.000 s unterzogen, wie in Abschnitt 2 gezeigt.
   HINWEIS: Platten, die keiner PDT-Exposition ausgesetzt sind, sollten als Kontrollen verwendet werden.
6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ für 24 h.
   HINWEIS: Überprüfen Sie die Zellen regelmäßig, um den Grad der Migration für jeden Zelltyp zu beurteilen. Dies muss für jede Zelllinie optimiert werden.
7. Waschen Sie die Zellen mit 1,5 mL PBS und entfernen Sie das PBS anschließend vollständig.
8. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie die Zellen hinzufügen und 10 Minuten lang mit 1,5 ml 4% (v/v) Paraformaldehyd in PBS inkubieren.
9. Fügen Sie 1,5 ml 70% (v/v) Ethanol hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang.
10. Entsorgen Sie das Ethanol und lassen Sie die Platten 10 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
11. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang mit 1,5 ml 0,2 % (v/v) Coomassieblau-Farbstoff in 90 % (v/v) Ethanol.
12. Waschen Sie die Teller mit doppelt destilliertem Wasser.
    HINWEIS: Um die Platten gründlich zu waschen und den restlichen Schmutz zu entfernen, tauchen Sie die Platten 2-3 Mal vollständig in sauberes, doppelt destilliertes Wasser.
13. Lassen Sie die Platten 24 h bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die getrockneten Platten mindestens mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
14. Visualisieren und fotografieren Sie die Wanderung von Zellen in Lücken mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop bei 10-facher Vergrößerung.
    HINWEIS: Beobachten und fotografieren Sie die Wanderung lebender Zellen bis zu 24 Stunden nach der 5-ALA-PDT-Exposition. Fixierte Zellen können jedoch gelagert und später fotografiert werden.
15. Exportieren Sie die Bilder in das gewünschte Format und quantifizieren Sie die Lücken mit Hilfe einer Software zur Verarbeitung und Analyse wissenschaftlicher Bilder, wie zuvor beschrieben¹⁴.

4. Viabilitätsprüfung

1. Alle Zellen mit einer Dichte von 1,5 × 10⁴ in 96-Well-Platten in 50 μl Kulturmedium aussäen.
2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ für 24 h in einem Standard-Zellkultur-Inkubator.
3. Fügen Sie weitere 50 μl FBS-freies Kulturmedium hinzu, das 5-ALA in einer Endkonzentration von 1 mM enthält.
4. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ für 4 h in einem Standard-Zellkultur-Inkubator.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine 2-fache Konzentration, da die Zellen bereits mit 50 μl Kulturmedium bedeckt sind. Eine Kontrolle mit Nährmedium sollte beigefügt werden.
5. Die Zellen werden einer PDT-Belichtung mit blauem Licht (436 nm, 36 J/cm²) in einem kontinuierlichen Ausgabemodus für vordefinierte Zeiträume von 300 s oder 2.000 s ausgesetzt, wie in Abschnitt 2 gezeigt.
   HINWEIS: Eine Negativkontrolle, die keiner PDT-Exposition unterzogen wird, sollte ebenfalls einbezogen werden.
6. Inkubieren Sie die bestrahlten Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ für 24 h in einem Standard-Zellkultur-Inkubator.
7. Geben Sie 15 μl MTS-Reagenz auf die Zellen und inkubieren Sie die Zellen 90 Minuten lang bei 37 °C, 5 % CO₂.
8. Messen Sie die Extinktion mit einem Spektralphotometer-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 490 nm.

5. Zellulärer Wachstumsarrest/Seneszenz-Assay (β-Galactosidase( β-Gal)-Aktivität)

HINWEIS: Alle hier verwendeten Reagenzien und Puffer wurden im Assay-Kit enthalten (siehe Materialtabelle).

1. Die Zellen werden mit einer Dichte von 1,5 × 10⁴ in 96-Well-Platten in 100 μl Kulturmedium ausgesät. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h, 37 °C, 5 % CO₂ in einem Standard-Zellkultur-Inkubator.
2. 100 μl frisches FBS-freies Medium mit 5-ALA in einer Endkonzentration von 1 mM zugeben und 4 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
   HINWEIS: Als Kontrollen sollten separate Vertiefungen gleichzeitig mit frischem Medium ohne 5-ALA-Photosensibilisator abgedeckt werden.
3. Die Zellen werden einer PDT-Belichtung mit blauem Licht (436 nm, 36 J/cm²) in einem kontinuierlichen Ausgabemodus für vordefinierte Zeiträume von 300 s oder 2.000 s ausgesetzt, wie in Abschnitt 2 gezeigt.
   HINWEIS: Eine Negativkontrollplatte, die keiner PDT ausgesetzt ist, sollte ebenfalls enthalten sein.
4. Inkubieren Sie die Zellen 24 h lang bei 37 °C, 5 % CO₂ in einem Standard-Zellkultur-Inkubator.
5. Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.
6. Die Zellen mit 100 μl 1x Zelllysepuffer bedecken und 5 min bei 4 °C inkubieren.
7. Das Lysat wird bei 350 × g 1 10 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand aufgefangen.
8. Pipettieren Sie 50 μl des Überstands auf eine neue 96-Well-Platte und fügen Sie weitere 50 μl 2x Assay-Puffer hinzu.
9. Stellen Sie die neue 96-Well-Platte für 1,5 h in einen 37 °C heißen Inkubator.
   HINWEIS: Die Pasteten sollten vor Licht geschützt werden, um ein Photobleichen zu vermeiden.
10. Übertragen Sie 50 μl der Mischung in eine undurchsichtige 96-Well-Platte und fügen Sie 200 μl Stopplösung hinzu.
11. Messen Sie die Absorption mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader bei 360 nm Anregung/465 nm Emission.

Nach 5-ALA PDT-Exposition zeigte die MSC-Kontrollgruppe keinen nennenswerten Effekt in Bezug auf die Migration nach 5-ALA PDT-Bestrahlung (Abbildung 2A, i, v, ix). Im Gegensatz dazu zeigten MAC-Zellen (Abbildung 1B und Abbildung 2A, iii, vii, xi) und 17-1012 (Abbildung 1B und Abbildung 2A, ii, vi, x...

Trotz der derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten ist das therapeutische Ansprechen bei Krebs unterschiedlich und spricht für neuartige Ansätze oder sogar Kombinationstherapien zur Behandlung von Knochenmetastasen unter Beibehaltung der ursprünglichen Gewebestruktur. In diesem Zusammenhang ist die PDT eine vielversprechende Alternative. Vereinfacht ausgedrückt besteht die PDT aus zwei Grundkomponenten: (1) einem ungiftigen lichtempfindlichen Farbstoff, der als Photosensibilisator (PS) ...

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Wir danken unseren Co-Autorinnen und Co-Autoren aus den Originalpublikationen für ihre Hilfe und Unterstützung.