原発性骨腫瘍および骨転移細胞株に対する5-アミノレブリン酸媒介光線力学療法

このプロトコルは、骨転移細胞株と原発性骨腫瘍を5-アミノレブリン酸媒介光線力学療法(PDT)にさらす段階的な方法論的アプローチを示しています。細胞遊走の可能性/浸潤性、生存率、アポトーシス、および老化の可能性への影響も、PDT曝露後に分析されます。

骨転移は、罹患した患者の予後不良と生活の質の低下と関連しています。光線力学療法(PDT)は、局所転移性骨病変を標的とすることができる非侵襲的療法として浮上しています。この論文では、接着細胞株におけるPDT効果を研究する ためのin vitro 法を紹介します。この目的のために、原発性 (巨細胞骨腫瘍) とヒト骨転移性癌細胞株 (原発性浸潤性乳管癌および腎癌に由来) の両方を 5-アミノレブリン酸 (5-ALA) 媒介 PDT に対象とする段階的なアプローチを示します。

5-ALA-PDT照射(青色光波長436nm)の24時間後、治療効果を細胞遊走能、生存率、アポトーシス機能、および細胞増殖停止(老化)の観点から評価しました。5-ALA-PDT照射後、筋骨格由来の細胞株は、同じ用量とPDTの曝露に対して異なる反応を示します。PDT曝露によって引き起こされた細胞損傷の程度に応じて、2つの異なる細胞運命-アポトーシスと老化が認められました。異なる骨がん細胞株間でPDT療法に対する感度が異なるため、臨床現場でより適切なPDT設定を選択するための有用な情報が得られます。このプロトコルは、筋骨格系腫瘍性細胞株の文脈におけるPDTの使用を例示するように設計されています。これは、さまざまながん細胞株やさまざまな光増感剤、光源に対するPDTの治療効果を調べるために調整することができます。

骨転移の治療選択肢は、腫瘍治療の継続的な開発にもかかわらず、依然として限られており、困難です。現在の標準的な方法は放射線療法であり、局所紅斑、内臓への毒性¹、不十分な骨折²などの合併症に関連しています。骨転移のある患者は、痛み、高カルシウム血症、神経学的症状に苦しむことが多く、運動障害や生活の質の低下をもたらすため、代替の抗腫瘍療法が必要です³。最近の知見は、PDTが骨病変を直接標的とするための有望な代替抗腫瘍薬治療オプションを提供し、単独でまたは放射線療法に支持的に使用できることを示しています⁴。

PDTのメカニズムは、基本的に、光励起された感光性化合物(光増感剤)から組織酸素へのエネルギー移動に基づいています。この光増感剤は、ナノスケールレベルでコンデンサと同様に機能します。適切な波長の光を照射すると基底状態でエネルギーを蓄えることができ、励起状態から元の基底状態に戻ると蓄積されたエネルギーを放出します⁵。放出されたエネルギーは、水素や電子を移動させることで酸素が活性酸素ラジカルに変化するという2つの光化学反応を引き起こします。第2は、光増感剤基質から局所的な三重項酸素粒子⁶への水平エネルギー移動による一重項酸素粒子の生成である。活性酸素ラジカルと一重項酸素分子は、局所腫瘍細胞に対して高い細胞毒性作用を持ち、腫瘍血管の内皮細胞のアポトーシスにより血管閉塞と局所炎症反応を誘導します⁷。

従来の光増感剤は、ヘマトポルフィリンやベンゾポルフィリンなどのポルフィリンファミリーの誘導体^{である8。}腫瘍組織に対してより親和性の高い光増感物質を適用すると、PDT⁹ yの選択性を高めることができます。特に、プロトポルフィリンIXの生合成前駆体である5-ALAは、光線性角化症、基底細胞がん、膀胱腫瘍、消化器がんなどの腫瘍細胞に蓄積する可能性があります⁵。5-ALAを使用したさまざまな送達アプローチも、腫瘍の局在化に関連してPDTの効率が異なる可能性があります。したがって、PDTの適用を伴う5-ALAの局所使用は、光線性角化症に対する第一選択の皮膚科治療となりました¹⁰。浸潤性乳管乳がん細胞株の骨転移に関する最近の結果は、5-ALA¹¹によるPDTへの曝露後に細胞遊走が阻害され、アポトーシスが誘導される可能性があることを示しています。 ただし、骨組織などの筋膜下組織にPDTを使用することは、有効性を改善する必要があるため、まだ前臨床から実験的な臨床段階にあります。光ベースの治療によるナノ粒子の応用は、すでに歯科で大きな影響を与えています¹²。したがって、ナノ粒子の使用とPDTを組み合わせることで、整形外科腫瘍学への適用範囲が広がる可能性があります。

次のプロトコルでは、原発性骨腫瘍と骨転移細胞株に由来する細胞の両方を調製し、それらを5-ALA媒介PDTにさらす方法を説明しています。5-ALA-PDT照射後の細胞移動の可能性、活力、および老化の実施方法と評価方法に関する詳細な説明も含まれています。ステップバイステップの手順では、信頼性と再現性のあるデータを取得するための簡単で簡潔なアプローチを提供します。骨腫瘍性病変に対するPDTアプローチの利点、制限、および将来の展望についても説明します。

腎細胞がんの骨転移に由来する細胞株「MAM」、浸潤性乳管がんの骨転移巣である「MAC」、骨の巨大細胞腫瘍である「17-1012」の3種類の細胞株を用いた。骨髄由来の間葉系幹細胞(MSC)を対照群として使用した。研究開始前に、機関および倫理的承認が取得されています (プロジェクト番号: 008/2014BO2-がん細胞株用、プロジェクト番号: 401/2013 BO2 間葉系 MSC)。

1. 細胞培養

注:培地は事前に調製することができます。MAMおよび17-1012の培地は、10%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)および2 mM L-グルタミンを添加したRPMIで構成されています。MACおよびMSCの培養培地は、グルタミン代替品( 材料表を参照)を含むダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)、10%(v / v)FBSを添加した4.5 g / L D-グルコースで構成されています。

1. 80%のコンフルエントが達成されるまで細胞を採取し、継代します。
2. 5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、ピペットを使用してフラスコからPBSを吸引します。
   注:このステップにより、プロテアーゼ阻害剤を含む残留完全な培地を確実に除去します。
3. 0.05%(v/v)トリプシン-EDTAを3 mL添加し、接着細胞を培養するフラスコの底から解離させます。
4. フラスコを37°Cで5分間、5%_CO2を含む加湿雰囲気でインキュベートします。
5. 位相差顕微鏡で細胞の剥離を観察します。
   注:インキュベーション時間は、細胞の種類ごとに調整する必要があります。細胞がトリプシン溶液に長時間(>10分)さらされるのを防ぎます。
6. トリプシン化を止めるには、3mLの培地を加えます。
   注:10%(v / v)FBSを含む各細胞タイプに適した培地を必ず追加してください。
7. 分離した細胞を遠心チューブに移し、7°Cで350 × g で7分間遠心分離します。
8. 上清を捨てます。
9. 細胞ペレットを1mLの培養培地に再懸濁し、前述のように血球計算盤を用いて細胞をカウントする¹³。

2. PDTの設定と露出

1. すべてのケーブルとアクセサリを差し込んで、PDTデバイスを準備します( 資料の表を参照)。
2. 不必要な光の放散を避けるために、部屋の照明を暗くします。
3. ダクトテープを使用して、ウェルプレートの真上に軽繊維を配置し、安定させます。
   注:すべての細胞が照射され、同じ量のエネルギーを受け取るようにするために、ウェル上部の軽繊維の均一な分布が望まれます(図1)。
4. 軽い繊維をひどく曲げたり損傷したりしないように注意してください。
5. ウェルプレートをアルミホイルで覆い、光の放散を最小限に抑えます。
6. ON / OFFスイッチボタンを押して、PDTデバイスの電源を入れます。
7. 従量制カードをPDTデバイスの前面にあるスロットに挿入します。
   注意: 300秒の露光時間に対応するデバイスには、1枚の従量制カードが付属しています。追加の 2,000 秒プログラムが PDT デバイスに自動的に統合されます。どちらの露光時間でも、光は指定された期間、連続出力モードで送達されます。
8. PDTライトボックスディスプレイのタイマーが、従量制カードに示されている所定の時間に変わることを確認します。
9. 組み込まれたフットペダルを押してPDT治療を開始します。.
   注意: 自動停止機能がデバイスに組み込まれており、システムは自動的に実行されます。サイクルが完了する前に、光プロセスを停止したり、軽繊維を取り外したりしないでください。ライトサイクルが完了すると、光源シャッターが閉じられ、それ以上の光は供給されません。

3. 移行アッセイ

1. 種子細胞は次のように:2 × 10⁴ 細胞 - MAC、1 × 10⁴ 細胞 - MAM、3 x 10⁴ - 17-1012、および2.5 × 10⁴ - MSCを各2チャンバー培養インサートに不透明なFボトム、6ウェルプレートに統合します。
2. 細胞を37°C、5%CO₂ で24時間インキュベートします。その後、インサートを取り外します。
   注:移行の開始基準点と初期の偏りのないギャップサイズを得るために、それ以上の5-ALA-PDT曝露を受けず(ステップ3.3-3.4)、代わりに直接染色および定量化された(ステップ3.5-3.12)別のプレートが使用されます。
3. 培地を、1 mM の 5-ALA を含む新しい FBS フリー培地と交換します。
4. 細胞を37°C、5%CO₂ で4時間インキュベートします。
   注:コントロールとして、追加のウェルは5-ALAを含まない培地で同時に覆う必要があります。
5. セクション 2 に示すように、300 秒または 2,000 秒の事前定義された時間枠で、青色光 (436 nm、36 J/cm²) で細胞を PDT にさらします。
   注意: PDT曝露を受けていないプレートをコントロールとして使用する必要があります。
6. 細胞を37°C、5%CO₂ で24時間インキュベートします。
   注:細胞を定期的にチェックして、各細胞タイプの移動の程度を評価します。これは、各細胞株に対して最適化する必要があります。
7. 細胞を1.5mLのPBSで洗浄し、その後PBSを完全に除去します。
8. 細胞を4%(v/v)パラホルムアルデヒド1.5 mLのPBS溶液に添加して10分間インキュベートし、細胞を固定します。
9. 70%(v/v)エタノール1.5mLを加え、10分間インキュベートします。
10. エタノールを捨て、プレートを室温で10分間風乾させます。
11. 細胞を1.5 mLの0.2%(v/v)クマシーブルー色素と90%(v / v)エタノールで20分間インキュベートします。
12. プレートを二重蒸留水で洗います。
    注意: プレートを徹底的に洗浄し、残りの破片を取り除くには、プレートをきれいな二重蒸留水に2〜3回完全に浸します。
13. プレートを室温で24時間風乾させます。
    注:この段階では、乾燥したプレートは少なくとも数週間室温で保存できます。
14. 細胞のギャップへの移動を、10倍の倍率で逆位相差顕微鏡で視覚化し、撮影します。
    注:5-ALA-PDT曝露後最大24時間、生細胞の移動を観察し、撮影してください。ただし、固定されたセルは保存して後で撮影することができます。
15. 画像を目的の形式でエクスポートし、前述の¹⁴のように科学画像を処理および分析するためのソフトウェアを使用してギャップを定量化します。

4. 生存率アッセイ

1. 50 μLの培地に1.5 × 10⁴ in 96ウェルプレートですべての細胞を播種します。
2. 細胞を37°C、5%CO₂ で標準的な細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートします。
3. 5-ALAを含むFBSフリー培地を最終濃度1 mMで50 μL追加します。
4. 細胞を37°C、5%CO₂ で標準的な細胞培養インキュベーターで4時間インキュベートします。
   注:細胞はすでに50μLの培地で覆われているため、2倍の濃度を使用してください。培地を含むコントロールを含める必要があります。
5. セクション2に示すように、細胞を青色光(436 nm、36 J / cm²)でPDT曝露し、事前定義された300秒または2,000秒の連続出力モードでさらします。
   注意: PDT曝露を受けないネガティブコントロールも含める必要があります。
6. 照射した細胞を37°C、5%CO₂ で標準的な細胞培養インキュベーターで24時間インキュベートします。
7. 15 μLのMTS試薬を細胞に添加し、細胞を37°C、5%CO₂で90分間インキュベートします。
8. 分光光度計リーダーで490nmの波長で吸光度を測定します。

5. 細胞増殖停止/老化アッセイ(β-ガラクトシダーゼ(β-Gal)活性)

注:ここで使用したすべての試薬とバッファーは、アッセイキットに付属しています( 材料表を参照)。

1. 100 μLの培地に96ウェルプレートで1.5 × 10⁴ の密度で細胞を播種します。標準的な細胞培養インキュベーターで細胞を24時間、37°C、5%_CO2 でインキュベートします。
2. 100 μLの新鮮なFBSフリー培地を5-ALAと共に最終濃度1 mMで加え、37°C、5%CO₂で4時間インキュベートします。
   注:コントロールとして、別々のウェルは、5-ALA光増感剤を含まない新しい培地で同時に覆う必要があります。
3. セクション2に示すように、細胞を青色光(436 nm、36 J / cm²)でPDT曝露し、事前定義された300秒または2,000秒の連続出力モードでさらします。
   注意: PDTにさらされていないネガティブコントロールプレートも含める必要があります。
4. 標準的な細胞培養インキュベーターで、細胞を37°C、5%CO₂ で24時間インキュベートします。
5. 培地を廃棄し、細胞をPBSで2回洗浄します。
6. 細胞を100 μLの1x Cell Lysis Bufferで覆い、4°Cで5分間インキュベートします。
7. ライセートを350 × g 1で4°Cで10分間遠心分離し、上清を回収します。
8. 上清50 μLを新しい96ウェルプレートにピペットで移し、さらに50 μLの2倍アッセイバッファーを加えます。
9. 新しい96ウェルプレートを37°Cのインキュベーターに1.5時間置きます。
   注意: 光退色を防ぐために、パテは光から保護する必要があります。
10. 混合物50 μLを不透明な壁の96ウェルプレートに移し、200 μLの停止溶液を加えます。
11. 蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、励起360 nm/発光465 nmで吸光度を測定します。

5-ALA PDT被ばく後、MSC対照群は5-ALA PDT照射後の移動に関して顕著な影響を示さなかった(図2A、I、V、IX)。対照的に、MAC細胞(図1B および 図2A、iii、vii、xi)および17-1012(図1B および 図2A、ii、vi、x)細胞は、300秒または2,000秒?...

現在の治療選択肢にもかかわらず、がんの治療反応はさまざまであり、初期の組織構造を維持しながら骨転移を治療するための新しいアプローチや併用療法が提唱されています。この文脈では、PDTは有望な代替手段です。単純化した観点から見ると、PDTは、(1)光増感剤(PS)と呼ばれる無毒の光感受性色素、および(2)PSの吸収スペクトルに一致し、それを活性化する適切...

著者には、開示すべき利益相反はありません。

元の出版物の共著者の助けとサポートに感謝します。