Leishmania braziliensis Enfeksiyon Oranını ve Doğuştan Gelen Konak İmmün Yanıtını Değerlendirmek için İnsan Monositlerinden Makrofaj Elde Edilmesi

Bu protokol, Leishmania braziliensis enfeksiyonu için monositlerden insan makrofajlarının elde edilmesi sürecini açıklar. Ayrıca araştırmacıların enfeksiyon oranını ve parazit canlılığını, floresan mikroskobu ile ROS üretimini ve enfeksiyona makrofaj yanıtını araştırmak için kültür süpernatantlarında inflamatuar mediatörlerin üretimini değerlendirmelerine olanak tanır.

Makrofajlar, bağışıklık sistemi fonksiyonu için gerekli olan çok işlevli hücrelerdir ve Leishmania braziliensis (Lb) enfeksiyonunda birincil konak hücredir. Bu hücreler mikroorganizma tanıma ve fagositoz konusunda uzmanlaşmıştır, ancak aynı zamanda diğer bağışıklık hücrelerini aktive eder ve antijenleri sunar, ayrıca iltihaplanmayı ve doku onarımını teşvik eder. Burada, sağlıklı donörlerin periferik kanından (PBMC) mononükleer hücreler elde etmek ve daha sonra makrofajlara farklılaşan monositleri ayırmak için bir protokol açıklıyoruz. Bu hücreler daha sonra enfeksiyonu kontrol etme yeteneğini değerlendirmek ve ayrıca çeşitli yöntemlerle ölçülebilen konak hücre bağışıklık tepkisini değerlendirmek için farklı Lb konsantrasyonlarında in vitro olarak enfekte edilebilir. PBMC'ler önce Ficoll-Hypaque gradyanı ile santrifüjlenerek izole edildi ve daha sonra monositlerin kültür plakalarına yapışmasına izin verecek şekilde kaplandı; Yapışık olmayan hücreler yıkanarak uzaklaştırıldı. Daha sonra, makrofaj farklılaşmasını indüklemek için yapışık hücreler 7 gün boyunca makrofaj-koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile kültürlendi. 2 x 10⁵ makrofaj elde etmek için 24 oyuklu plakalar üzerine oyuk başına 2 x 10⁶ hücre kaplamanızı öneririz. Tamamen farklılaşmış makrofajlar daha sonra 4 veya 24 saat boyunca Lb ile enfekte edilebilir. Bu protokol, optik veya floresan mikroskobu ile değerlendirilebilen enfekte hücrelerin önemli bir yüzdesi ile sonuçlanır. Enfeksiyon indeksine ek olarak, parazit yükü her hücrenin içindeki parazit sayıları sayılarak ölçülebilir. Daha ileri moleküler ve fonksiyonel tahliller, kültür süpernatantlarında veya makrofajların kendi içinde de gerçekleştirilebilir, bu da bu protokolün çeşitli bağlamlarda uygulanmasına ve ayrıca diğer hücre içi parazit türlerine uyarlanmasına izin verir.

Leishmania cinsinin hücre içi protozoan paraziti, leishmaniasis¹ olarak bilinen ihmal edilmiş bir hastalık kompleksinin etken maddesidir. Bu tropikal hastalıklar, cilt lezyonlarından, hastalığın viseral formundan kaynaklanan komplikasyonlara kadar değişebilen ve tedavi edilmezse ölümcül olabilen çok çeşitli klinik belirtilere sahiptir. Kutanöz leishmaniasis (KL), leishmaniasis'in en sık görülen formudur ve akut kronik inflamasyon ile birlikte tek veya birkaç ülsere deri lezyonu ile karakterizedir². Hastalığın gelişimi, her ikisi de klinik sonuçları tanımlayan konak immün yanıtı ile ilişkili faktörlerin bir kombinasyonuna ek olarak Leishmania türüne bağlıdır ^3,4. Leishmania braziliensis, Brezilya'da CL'ye neden olan ana türdür ve ülkenin tüm eyaletlerinde bildirilen vakalar⁵. L. braziliensis'e karşı bağışıklık tepkisi, paraziti aşılama bölgesiyle sınırladığı ve makrofajlar, nötrofiller e lenfositler ^4,6,7 gibi çeşitli bağışıklık hücresi tiplerini içerdiği için koruyucu olarak kabul edilir.

Makrofajlar, mikroorganizmaların tespiti ve fagositozunda uzmanlaştıkları ve antijenleri sunabildikleri ve diğer hücre tiplerini aktive edebildikleri için bağışıklık sistemi için gerekli olan çok işlevli hücrelerdir. Makrofajlar, iltihaplanmadan doku onarımına ve homeostazın korunmasına kadar olan süreçleri düzenleyebilir ^8,9. Bu hücreler, Leishmania gibi hücre içi parazitlere karşı erken bağışıklık tepkisinde önemli bir rol oynar ve eliminasyonları için önemlidir 10,11,12.

L. braziliensis enfeksiyonu sırasında, makrofajlar, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve inflamatuar mediatörlerin üretimi gibi paraziti ortadan kaldırmak için farklı mekanizmalar yoluyla yanıt verebilir^13,14. İmmün tepkiler, alevlenen bir inflamatuar duruma veya doku onarım süreçlerine katkıda bulunan proinflamatuar veya antienflamatuar sitokinlerin üretimi ile yönlendirilebilir ^6,15,16. Makrofajların plastisitesi, KL'nin immünopatogenezi ve parazit-konak etkileşimi için temeldir ve bu hücrelerin hastalık mekanizmalarının aydınlatılması ve yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi için çok önemli olduğu düşünülmektedir.

CL karmaşık bir hastalık olduğundan, araştırmalar araştırmacıların insanlarda bulunanları taklit eden hücre tiplerini keşfetmelerini gerektirir. Farklı deneysel modellerde gözlemlenen bağışıklık tepkileri değişebilir ve doğal olarak enfekte olmuş insanlarda gözlenen bağışıklık tepkisini yansıtmayan sonuçlar üretebilir. Bu nedenle, burada sunulan protokol, L. braziliensis'in neden olduğu KL sırasında insan makrofajlarının ve bunların immün yanıtlarının incelenmesini sağlamak için tasarlanmıştır.

Gonçalo Moniz Enstitüsü (Oswaldo Cruz Vakfı-IGM-FIOCRUZ, Salvador, Bahia-Brezilya) İnsan Araştırmalarında Etik için Kurumsal İnceleme Kurulu bu çalışmayı onayladı (protokol numarası: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. İnsan PBMC'lerinin izolasyonu

1. Kan örneklerinin, 1.077 g / mL yoğunluk gradyanının (ör., Ficoll-Histopak) ve salin çözeltisinin oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
2. Kan örneklerini 1: 1 oranında salin solüsyonu ile seyreltin.
3. 10-12 mL yoğunluk gradyanını 50 mL'lik tüplere aktarın.
4. Seyreltilmiş kan örneğinin 40 mL'ye kadar olan kısmını yoğunluk gradyanının üzerine dikkatlice yerleştirin. Kan ve yoğunluk gradyan katmanlarını ayırın.
5. İlk santrifüjleme: 24 ºC'de 30 dakika boyunca 400 x g'da kan ve yoğunluk gradyan katmanları içeren santrifüj tüpleri.
   NOT: Santrifüjü çalıştırmadan önce freni kapatın.
6. PBMC halkasının üzerindeki plazmayı bir pipetle çıkarın (buffy coat katmanı, plazma ve yoğunluk gradyan katmanları arasında bulunur; bunun altında kırmızı kan hücreleri/granülosit peleti bulunur).
7. Bulut benzeri PBMC katmanını (buffy coat katmanı) bir pipetle 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve soğuk tuzlu su ile doldurun (buz üzerinde veya 4 °C'de tutulun).
8. İkinci santrifüjleme: Fren açıkken tüpleri 300 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
9. Süpernatanı atın ve tüpü soğuk tuzlu su ile doldurarak peleti yeniden süspanse edin.
10. Üçüncü santrifüjleme: Fren açıkken 4 ° C'de 10 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj tüpleri.
11. Süpernatanı atın ve tüpü soğuk tuzlu su ile doldurarak peleti yeniden süspanse edin.
12. Dördüncü santrifüjleme: Tüpü 200 x g'da , fren açıkken 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
13. Süpernatanı atın ve peleti 1 mL soğuk RPMI ortamı ile yeniden süspanse edin.
14. Elde edilen hücre sayısını belirlemek için hücreleri sayın.

2. İnsan makrofajlarına farklılaşma

NOT: 24 oyuklu bir plaka için, oyuk başına 2 x 10⁶ hücre plakalamak için gereken toplam hücre miktarını hesaplayın, bu da 2 x 10⁵ makrofaj verecektir. Bu verim, insan kanındaki ortalama %10'luk monositlere dayanmaktadır. Alternatif olarak, monositler enzimatik olmayan yöntemlerle de salınabilir ve daha sonra kaplama için sayılabilir.

1. 24 oyuklu bir plaka üzerine, her kuyucuğun dibine 13 mm'lik yuvarlak cam lameller yerleştirin. Kuyucuk başına eksik olan 1 mL RPMI'de 2×^{10 6} hücreye eşdeğer plaka.
   NOT: Her bir oyuktaki hücre sayısını sınırlayın, çünkü aşırı tahmin edilen miktarlar hücre yapışmasını engelleyebilir ve kültürlemeyi tehlikeye atabilir. Ayrıca, tüm lameller temiz ve steril olmalıdır.
2. Hücre yapışması için plakaları 37 ºC'de %5 CO₂ altında 30 dakika inkübe edin.
3. Süpernatanları çıkarın ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için oda sıcaklığında% 0.9 tuzlu su ile bir kez yıkayın.
4. Yıkadıktan sonra, salini çıkarın ve oda sıcaklığında 250 μL takviye edilmiş RPMI ortamı ekleyin (% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve 50 ng / mL M-CSF) her oyuğa.
5. Hücreleri 7 gün boyunca 37 ºC'de% 5 CO₂ altında inkübe edin.
   1. Her iki günde bir her kuyucuğa 125 μL takviye RPMI ortamı ekleyin. Hücre farklılaşmasının sonunda, nihai hacim kuyucuk başına 500 μL olacaktır.
   2. Hücre canlılığını analiz etmek için, 96 oyuklu bir plaka (oyuk başına 2 x 10⁵) üzerinde paralel olarak başka bir kültür gerçekleştirin.
   3. Makrofajlara farklılaştıktan sonra (7 gün), 20 μL AlamarBlue reaktifi ekleyin.
   4. 7 saatlik inkübasyondan sonra, 570 nm ve 600 nm dalga boylarında bir spektrofotometrede plakaları okuyun.

3. Leishmania kültürü ve enfeksiyonu

NOT: Bu testte iki farklı suştan (MHOM / BR / 01 / BA788 ve MHOM / BR88 / BA-3456) L . braziliensis promastigotları kullanılmıştır.

1. Lb parazitlerini sayın ve 5 x 10⁵ / mL parazit elde etmek için hacmi hesaplayın.
2. Takviyeli Schneider Böcek ortamı hazırlayın (% 10 FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin ve 100 mg / mL streptomisin).
3. Parazitleri 24 ºC'lik bir inkübatörde toplam 5 mL hacminde, sabit faza ulaşılana kadar (4 ila 6 gün) inkübe edin.
   NOT: Büyümeyi değerlendirmek için parazitleri her gün sayın.
4. Sabit faza ulaştıktan sonra, ölü parazitleri (tüpün dibinde çökeltilir) uzaklaştırmak için Leishmania kültürlerini 100 x g'da 4 ºC'de 10 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve canlı parazitleri geri kazanmak için 4 ºC'de 10 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
6. Parazitleri saymak için peleti 1 mL takviye RPMI ortamı ile yeniden süspanse edin.
7. 10:1 parazit:hücre oranı elde etmek için parazitlerin hacmini hesaplayın. Parazitleri, daha önce oda sıcaklığında takviye edilmiş RPMI ortamında (~ 300 μL / kuyu) kültürlenmiş makrofajları içeren kültür plakalarına aktarın.
8. Süpernatanı, farklılaşmış makrofajlar içeren her kuyucuktan çıkarın.
   NOT: Hücrelerin ortam olmadan uzun süre geçirmesini önlemek için mümkün olan en kısa sürede her bir oyuktaki ortamı değiştirin. Ortamın bir seferde üç kuyucukta çıkarılmasını ve değiştirilmesini öneririz.
9. Hesaplanan Lb miktarını, farklılaşmış makrofajlar içeren her bir oyuğa aktarın.
10. Hücreleri 4 veya 24 saat boyunca 37 ºC'de% 5 CO₂ altında enfekte edin.
    1. 4 saat sonra, içselleştirilmemiş parazitleri uzaklaştırmak için makrofajları oda sıcaklığında 3 kez tuzlu su ile yıkayın.
    2. 24 saatlik enfeksiyon periyodu için, yıkandıktan sonra her bir kuyucuğa 300 μL takviye RPMI ortamı ekleyin ve daha sonra% 5 CO₂ altında 37 ° C'de 20 saat daha reinkübe edin.
11. Üreticinin talimatlarını izleyerek enzime bağlı bir immünosorbent testi (ELISA) kullanarak inflamatuar mediatörleri ölçmek için süpernatanı çıkarın.
    1. Toplanan süpernatanı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Bu prosedür, içselleştirilmemiş parazitleri uzaklaştırmak için gerçekleştirilir. Süpernatantlar dondurulabilir ve gelecekteki analiz zamanına kadar -80^°C'de tutulabilir.
       NOT: Hücreler enfeksiyon oranını, parazit canlılığını veya ROS üretimini değerlendirmek için kullanılabilir.

4. Enfeksiyonun değerlendirilmesi

1. Enfeksiyon oranının ölçülmesi
   1. Süpernatanı çıkardıktan sonra her bir kuyucuğa 300 μL metanol ekleyin. Lamellere yapışan hücreleri sabitlemek için 15 dakika bekleyin.
   2. Lamelleri kuyucuklardan çıkarın ve hücre boyama solüsyonunda (örneğin, Hızlı Panoptik 2) 1 dakika bekletmek için bir destek üzerine yerleştirin.
   3. Lamelleri hücre boyama solüsyonuna iki kez batırın (örneğin, Hızlı Panoptik 3) ve kuruyana kadar bekleyin.
   4. Kızakların üzerine 15 μL montaj ortamı (örneğin Entellan) yerleştirin ve ardından lamelleri ortamın üzerine yerleştirin.
      NOT: Lamellere takılan tüm makrofajlar montaj ortamı ile temas halinde olmalıdır.
   5. Enfeksiyon oranını ve içselleştirilmiş amastigotların sayısını ölçmek için 100x objektif kullanarak optik mikroskop altında rastgele 100 hücre sayın.
2. Parazit canlılığı
   1. 4 saatlik enfeksiyondan sonra, hücreleri oda sıcaklığında 3 kez tuzlu su ile yıkayın.
   2. 300 μL takviye edilmiş Schneider's Insect ortamı ekleyin.
   3. 24 ºC'lik bir inkübatörde inkübe edin.
   4. Parazit büyümesini 48, 72, 96 ve 120 saat sonra ölçün.

5. Floresan mikroskobu ile ROS üretiminin değerlendirilmesi

1. Enfeksiyon döneminden sonra, süpernatanı çıkarın ve hücreleri 500 μL tuzlu su ile yıkayın.
2. Her oyuka 300 μL florojenik prob reaktifi (örneğin, 5 μM'de CellROX Yeşil Reaktifi) ekleyin.
3. Hücreleri 37 ºC ve% 5 CO_2'de 30 dakika inkübe edin.
4. Hücreleri 3x 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
5. Hücreleri 300 μL% 3.7 formaldehit ile sabitleyin ve 15 dakika bekletin.
   NOT: Çiçeklenme sinyalini 24 saat içinde ölçün.
6. Hücre boyama için 5 μL DAPI boyama maddesi (örneğin, DAPI ProLong Gold antifade) ekleyin. Lameli makrofaj içeren yüzeye DAPI boyama maddesi ile doğrudan temas edecek şekilde yerleştirin.
7. Floresan sinyalini 485/520 nm'lik bir uyarma dalga boyunda floresan mikroskobu ile analiz edin.
8. ImageJ kullanarak her lamel için 30 hücreden Düzeltilmiş Toplam Hücre Floresansını (CTCF) hesaplayın.
   CTCF = Entegre Yoğunluk (Seçilen bir hücrenin alanı x Arka plan okumalarının ortalama floresansı)

6. İstatistiksel analiz

1. İki grubu eşleşmemiş örneklerle karşılaştırmak için Mann-Whitney testini kullanın. GraphPad Prism 7.0 kullanarak istatistiksel analizler yapın. p < 0.05 olduğunda istatistiksel olarak anlamlı farkları düşünün.

Parazitlerin ve konak hücrelerin etkileşiminin anlaşılması, çeşitli hastalıkların patogenezinde rol oynayan mekanizmaların aydınlatılması için çok önemlidir. Kültürlenmiş insan hücreleri, hücre soylarına kıyasla hücre kültürünün sınırlamaları nedeniyle daha az kullanılmasına rağmen, burada sunulan protokol, insan makrofajlarının sağlam ve tekrarlanabilir bir farklılaşmasını göstermektedir. Bu protokol, enflamatuar mediatörlerin üretiminden insa...

Burada insan monositlerinin makrofajlara farklılaşması ve ardından iki L. braziliensis suşu ile enfeksiyon için sunulan protokol, parazit-hücre etkileşiminin çeşitli yönlerinin değerlendirilmesine izin verir. Bu araçlar, CL ile ilgili cevaplanmamış soruları aydınlatmak için çok önemli olabilir. Bu protokolün kurulması ile grubumuz, diyabetli ve CL^14'lü bireylerden elde edilen makrofajların immün yanıtının bazı yönlerini ortay...

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu çalışma, PET0009/2016 Hibe numarası altında Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) ve 001 Finans Kodu altında Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brezilya (CAPES) tarafından desteklenmiştir.