Obtention de macrophages à partir de monocytes humains pour évaluer le taux d’infection à Leishmania braziliensis et la réponse immunitaire innée de l’hôte

Ce protocole décrit le processus d’obtention de macrophages humains à partir de monocytes pour l’infection à Leishmania braziliensis. Il permet également aux chercheurs d’évaluer le taux d’infection et la viabilité du parasite, la production de ROS par microscopie à fluorescence et la production de médiateurs inflammatoires dans les surnageants de culture pour étudier la réponse des macrophages à l’infection.

Les macrophages sont des cellules multifonctionnelles essentielles au fonctionnement du système immunitaire et la principale cellule hôte de l’infection à Leishmania braziliensis (Lb). Ces cellules sont spécialisées dans la reconnaissance des micro-organismes et la phagocytose, mais activent également d’autres cellules immunitaires et présentent des antigènes, ainsi que favorisent l’inflammation et la réparation des tissus. Ici, nous décrivons un protocole permettant d’obtenir des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de donneurs sains pour séparer les monocytes qui se différencient ensuite en macrophages. Ces cellules peuvent ensuite être infectées in vitro à différentes concentrations de Lb pour évaluer la capacité de contrôler l’infection, ainsi que d’évaluer la réponse immunitaire de la cellule hôte, qui peut être mesurée par plusieurs méthodes. Les PBMC ont d’abord été isolés par centrifugation avec gradient Ficoll-Hypaque, puis plaqués pour permettre aux monocytes d’adhérer aux plaques de culture ; Les cellules non adhérentes ont été éliminées par lavage. Ensuite, des cellules adhérentes ont été cultivées avec du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) pendant 7 jours pour induire la différenciation des macrophages. Nous suggérons de plaquer 2 x 10⁶ cellules par puits sur des plaques de 24 puits afin d’obtenir 2 x 10⁵ macrophages. Les macrophages entièrement différenciés peuvent ensuite être infectés par Lb pendant 4 ou 24 heures. Ce protocole permet d’obtenir un pourcentage important de cellules infectées, qui peuvent être évaluées par microscopie optique ou à fluorescence. En plus de l’indice d’infection, la charge parasitaire peut être mesurée en comptant le nombre de parasites à l’intérieur de chaque cellule. D’autres tests moléculaires et fonctionnels peuvent également être effectués dans des surnageants de culture ou dans les macrophages eux-mêmes, ce qui permet à ce protocole d’être appliqué dans une variété de contextes et également adapté à d’autres espèces de parasites intracellulaires.

Le parasite protozoaire intracellulaire du genre Leishmania est l’agent causal d’un complexe de maladies négligées connu sous le nom de leishmaniose¹. Ces maladies tropicales ont un large éventail de manifestations cliniques qui peuvent aller des lésions cutanées aux complications découlant de la forme viscérale de la maladie, qui peuvent être mortelles si elles ne sont pas traitées. La leishmaniose cutanée (CL) est la forme la plus fréquente de leishmaniose et se caractérise par une ou quelques lésions cutanées ulcérées avec une inflammation chronique exacerbée². Le développement de la maladie dépend de l’espèce Leishmania, en plus d’une combinaison de facteurs associés à la réponse immunitaire de l’hôte, qui définissent tous deux les résultats cliniques ^3,4. Leishmania braziliensis est la principale espèce à l’origine de la CL au Brésil, avec des cas signalés dans tous les États du pays⁵. La réponse immunitaire contre L. braziliensis est considérée comme protectrice, car elle limite le parasite au site d’inoculation et implique plusieurs types de cellules immunitaires, telles que les macrophages, les neutrophiles e lymphocytes ^4,6,7.

Les macrophages sont des cellules multifonctionnelles essentielles au système immunitaire, car elles sont spécialisées dans la détection et la phagocytose des micro-organismes, et peuvent présenter des antigènes et activer d’autres types de cellules. Les macrophages sont capables de réguler des processus allant de l’inflammation à la réparation des tissus et au maintien de l’homéostasie ^8,9. Ces cellules jouent un rôle essentiel dans la réponse immunitaire précoce contre les parasites intracellulaires, tels que Leishmania, étant importantes pour leur élimination 10,11,12.

Au cours de l’infection à L. braziliensis, les macrophages peuvent réagir par différents mécanismes pour éliminer le parasite, tels que la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de médiateurs inflammatoires^13,14. Les réponses immunitaires peuvent être guidées par la production de cytokines pro-inflammatoires ou anti-inflammatoires, qui contribuent à un état inflammatoire exacerbé ou à des processus de réparation tissulaire ^6,15,16. La plasticité des macrophages est fondamentale pour l’immunopathogenèse de la CL, ainsi que pour l’interaction parasite-hôte, et ces cellules sont considérées comme cruciales pour l’élucidation des mécanismes de la maladie et pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Comme la CL est une maladie complexe, les recherches exigent que les chercheurs explorent des types de cellules qui imitent celles trouvées chez l’homme. Les réponses immunitaires observées dans différents modèles expérimentaux peuvent varier et produire des résultats qui ne reflètent pas la réponse immunitaire observée chez les humains naturellement infectés. Ainsi, le protocole présenté ici a été conçu pour permettre l’étude des macrophages humains et de leurs réponses immunitaires au cours de la CL causée par L. braziliensis.

Le Comité d’examen institutionnel pour l’éthique de la recherche sur l’homme de l’Institut Gonçalo Moniz (Fondation Oswaldo Cruz-IGM-FIOCRUZ, Salvador, Bahia-Brésil), a approuvé cette étude (numéro de protocole : CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. Isolement des PBMC humains

1. Assurez-vous que les échantillons de sang, le gradient de densité de 1,077 g/mL (p. ex., Ficoll-Histopaque) et la solution saline sont à température ambiante.
2. Diluer les échantillons de sang avec une solution saline dans un rapport de 1:1.
3. Transférer 10 à 12 ml de gradient de densité dans des tubes de 50 ml.
4. Superposez soigneusement jusqu’à 40 ml de l’échantillon de sang dilué sur le gradient de densité. Séparez les couches de sang et de gradient de densité.
5. Première centrifugation : tubes à centrifuger contenant des couches de sang et de gradient de densité à 400 x g pendant 30 min à 24 ºC.
   REMARQUE : Coupez le frein avant de démarrer la centrifugeuse.
6. Retirez le plasma au-dessus de l’anneau PBMC à l’aide d’une pipette (la couche de couche leucocytaire est située entre les couches de plasma et de gradient de densité ; en dessous se trouvent les globules rouges / granulocytes cules).
7. Transférez la couche PBMC (couche leucocytaire) à l’aide d’une pipette dans un tube de 15 ml et remplissez-la de solution saline froide (conservée sur de la glace ou à 4 °C).
8. Deuxième centrifugation : tubes de centrifugation à 300 x g pendant 10 min à 4 °C avec le frein activé.
9. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension en remplissant le tube de solution saline froide.
10. Troisième centrifugation : tubes de centrifugation à 250 x g pendant 10 min à 4 °C avec le frein activé.
11. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension en remplissant le tube de solution saline froide.
12. Quatrième centrifugation : centrifuger le tube à 200 x g pendant 10 min à 4 °C avec le frein activé.
13. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension avec 1 mL de milieu RPMI froid.
14. Comptez les cellules pour déterminer le nombre de cellules obtenues.

2. Différenciation en macrophages humains

REMARQUE : Pour une plaque de 24 puits, calculez la quantité totale de cellules nécessaire pour plaquer 2 x 10⁶ cellules par puits, ce qui donnera 2 x 10⁵ macrophages. Ce rendement est basé sur une moyenne de 10 % de monocytes dans le sang humain. Alternativement, les monocytes peuvent également être libérés par des méthodes non enzymatiques, puis comptés pour le placage.

1. Sur une plaque à 24 puits, placez des lamelles de verre rondes de 13 mm au fond de chaque puits. Plaquez l’équivalent de 2×10⁶ cellules dans 1 mL de RPMI incomplet par puits.
   REMARQUE : Limitez le nombre de cellules dans chaque puits, car des quantités surestimées peuvent entraver l’adhésion des cellules et compromettre la culture. De plus, toutes les lamelles doivent être propres et stériles.
2. Incuber les plaques pendant 30 min à 37 ºC sous 5 % de CO₂ pour l’adhésion des cellules.
3. Retirez les surnageants et lavez-les une fois avec une solution saline à 0,9 % à température ambiante pour éliminer toutes les cellules non adhérentes.
4. Après le lavage, retirer la solution saline et ajouter 250 μL de milieu RPMI supplémenté à température ambiante (10 % de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 50 ng/mL DE M-CSF) dans chaque puits.
5. Incuber les cellules pendant 7 jours à 37 ºC sous 5 % de CO₂.
   1. Ajouter 125 μL de milieu RPMI supplémenté dans chaque puits tous les deux jours. À la fin de la différenciation cellulaire, le volume final sera de 500 μL par puits.
   2. Pour analyser la viabilité cellulaire, effectuez une autre culture en parallèle sur une plaque de 96 puits (2 x 10⁵ par puits).
   3. Après différenciation en macrophages (7 jours), ajouter 20 μL de réactif AlamarBlue.
   4. Après 7 heures d’incubation, lire les plaques sur un spectrophotomètre aux longueurs d’onde de 570 nm et 600 nm.

3. Culture et infection à Leishmania

REMARQUE : Des promastigotes de L. braziliensis de deux souches différentes (MHOM/BR/01/BA788 et MHOM/BR88/BA-3456) ont été utilisés dans cet essai.

1. Comptez les parasites Lb et calculez le volume pour obtenir 5 x 10 parasites⁵/mL.
2. Préparez un milieu Schneider’s Insect supplémenté (10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine).
3. Incuber les parasites dans un volume total de 5 mL dans un incubateur à 24 ºC jusqu’à ce que la phase stationnaire soit atteinte (4 à 6 jours).
   REMARQUE : Comptez les parasites tous les jours pour évaluer la croissance.
4. Après avoir atteint la phase stationnaire, centrifuger les cultures de Leishmania à 100 x g pendant 10 min à 4 ºC pour éliminer tous les parasites morts (précipités au fond du tube).
5. Transférez le surnageant dans un nouveau tube et centrifugez-le à 1 800 x g pendant 10 min à 4 °C pour récupérer les parasites viables. Jetez le surnageant.
6. Remettre la pastille en suspension avec 1 mL de milieu RPMI supplémenté pour compter les parasites.
7. Calculez le volume de parasites pour obtenir un rapport parasite :cellule de 10:1. Transférer les parasites dans des plaques de culture contenant des macrophages préalablement cultivés dans un milieu RPMI supplémenté (~300 μL/puits) à température ambiante.
8. Retirer le surnageant de chaque puits contenant des macrophages différenciés.
   REMARQUE : Dès que possible, remplacez le milieu dans chaque puits pour éviter que les cellules ne passent de longues périodes sans milieu. Nous vous suggérons de retirer et de remplacer le milieu dans trois puits à la fois.
9. Transférez la quantité calculée de Lb dans chaque puits contenant des macrophages différenciés.
10. Infecter les cellules pendant 4 ou 24 heures à 37 ºC sous 5 % de CO₂.
    1. Après 4 heures, lavez les macrophages 3 fois avec une solution saline à température ambiante pour éliminer tous les parasites non internalisés.
    2. Pendant la période d’infection de 24 heures, ajouter 300 μL de milieu RPMI supplémenté dans chaque puits après le lavage, puis réincuber pendant 20 heures supplémentaires à 37 °C sous 5 % de CO₂.
11. Retirer le surnageant pour mesurer les médiateurs inflammatoires à l’aide d’un test immuno-enzymatique (ELISA) en suivant les instructions du fabricant.
    1. Centrifuger le surnageant collecté à 1 800 x g pendant 10 min à température ambiante. Transférez le surnageant dans un nouveau tube. Cette procédure est effectuée pour éliminer tous les parasites non internalisés. Les surnageants peuvent être congelés et conservés à -80^°C jusqu’à ce qu’une analyse ultérieure soit effectuée.
       REMARQUE : Les cellules peuvent être utilisées pour évaluer le taux d’infection, la viabilité du parasite ou la production de ROS.

4. Évaluation de l’infection

1. Quantification du taux d’infection
   1. Ajouter 300 μL de méthanol dans chaque puits après avoir retiré le surnageant. Attendre 15 min pour fixer les cellules collées aux lamelles.
   2. Retirez les lamelles des puits et placez-les sur un support pour les tremper dans la solution de coloration cellulaire (p. ex., Quick Panoptic 2) pendant 1 min.
   3. Immergez deux fois les lamelles dans une solution de coloration cellulaire (p. ex., Quick Panoptic 3) et attendez qu’elles soient sèches.
   4. Placez 15 μL de support de montage (par exemple, Entellan) sur les diapositives, puis placez les lamelles sur le support.
      REMARQUE : Tous les macrophages fixés aux lamelles doivent être en contact avec le milieu de montage.
   5. Comptez 100 cellules au hasard sous un microscope optique à l’aide d’un objectif 100x pour quantifier le taux d’infection et le nombre d’amastigotes internalisés.
2. Viabilité du parasite
   1. Après 4 heures d’infection, laver les cellules avec une solution saline à température ambiante 3 fois.
   2. Ajouter 300 μL de milieu pour insectes de Schneider supplémenté.
   3. Incuber dans un incubateur à 24 ºC.
   4. Quantifier la croissance du parasite après 48, 72, 96 et 120 heures.

5. Évaluation de la production de ROS par microscopie à fluorescence

1. Après la période d’infection, retirez le surnageant et lavez les cellules avec 500 μL de solution saline.
2. Ajouter 300 μL de réactif de sonde fluorogénique (p. ex., réactif CellROX Green à 5 μM) dans chaque puits.
3. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ºC et 5 % de CO₂.
4. Laver les cellules 3x avec 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
5. Fixez les cellules avec 300 μL de formaldéhyde à 3,7 % et laissez reposer pendant 15 min.
   REMARQUE : Mesurez le signal de floraison dans les 24 heures.
6. Ajouter 5 μL d’agent de coloration DAPI (par exemple, DAPI ProLong Gold anti-décoloration) pour la coloration cellulaire. Placez la lamelle avec la surface contenant les macrophages en contact direct avec l’agent de coloration DAPI.
7. Analyser le signal de fluorescence par microscopie à fluorescence à une longueur d’onde d’excitation de 485/520 nm.
8. Calculez la fluorescence totale corrigée (CTCF) à partir de 30 cellules pour chaque lamelle à l’aide d’ImageJ.
   CTCF = Densité intégrée (aire d’une cellule sélectionnée x fluorescence moyenne des lectures de fond)

6. Analyse statistique

1. Utilisez le test de Mann-Whitney pour comparer deux groupes avec des échantillons non appariés. Effectuez les analyses statistiques à l’aide de GraphPad Prism 7.0. Considérez les différences comme statistiquement significatives lorsque p < 0,05.

La compréhension de l’interaction entre les parasites et les cellules hôtes est cruciale pour élucider les mécanismes impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies. Bien que les cellules humaines cultivées soient moins utilisées en raison des limites de la culture cellulaire par rapport aux lignées cellulaires, le protocole présenté ici montre une différenciation robuste et reproductible des macrophages humains. Ce protocole permet d’analyser plusieurs aspects de la...

Le protocole présenté ici pour la différenciation des monocytes humains en macrophages suivie de l’infection par deux souches de L. braziliensis permet d’évaluer plusieurs aspects de l’interaction parasite-cellule. Ces outils peuvent être cruciaux pour élucider les questions sans réponse sur la CL. Avec la mise en place de ce protocole, notre groupe a pu découvrir certains aspects de la réponse immunitaire des macrophages obtenus chez des personnes atteintes de di...

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce travail a été soutenu par la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) au titre de la subvention n° PET0009/2016 et par le Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brésil (CAPES) au titre du code financier 001.