השגת מקרופאגים ממונוציטים אנושיים כדי להעריך את שיעור הזיהום בלישמניה ברזילאית ואת התגובה החיסונית המולדת של המארח

פרוטוקול זה מתאר את התהליך להשגת מקרופאגים אנושיים ממונוציטים להדבקה בלישמניה ברזילאית. זה גם מאפשר לחוקרים להעריך את קצב ההדבקה ואת כדאיות הטפילים, ייצור ROS על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, וייצור מתווכים דלקתיים בסופרנטנטים של תרבית כדי לחקור את תגובת המקרופאגים לזיהום.

מקרופאגים הם תאים רב-תכליתיים החיוניים לתפקוד מערכת החיסון, והתא המארח העיקרי בזיהום Leishmania braziliensis (Lb). תאים אלה מתמחים בזיהוי מיקרואורגניזמים ופגוציטוזה, אך גם מפעילים תאים חיסוניים אחרים ומציגים אנטיגנים, כמו גם מקדמים דלקת ותיקון רקמות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להשגת תאים חד-גרעיניים מדם היקפי (PBMC) של תורמים בריאים כדי להפריד מונוציטים שמתמיינים לאחר מכן למקרופאגים. לאחר מכן ניתן להדביק תאים אלה במבחנה בריכוזים שונים של ליברות כדי להעריך את היכולת לשלוט בזיהום, כמו גם להעריך את התגובה החיסונית של התא המארח, אותה ניתן למדוד במספר שיטות. PBMCs בודדו תחילה על ידי צנטריפוגה עם שיפוע Ficoll-Hypaque ולאחר מכן צופו כדי לאפשר למונוציטים להיצמד ללוחות התרבית; תאים שאינם נדבקים הוסרו על ידי כביסה. לאחר מכן, תאים דבקים תורבבו עם גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) במשך 7 ימים כדי לגרום להתמיינות מקרופאגים. אנו מציעים לצפות 2 x 10⁶ תאים לבאר על צלחות של 24 בארות על מנת להשיג 2 x 10⁵ מקרופאגים. לאחר מכן ניתן להדביק מקרופאגים מובחנים לחלוטין ב-Lb למשך 4 או 24 שעות. פרוטוקול זה מביא לאחוז משמעותי של תאים נגועים, אותם ניתן להעריך על ידי מיקרוסקופיה אופטית או פלואורסצנטית. בנוסף למדד ההדבקה, ניתן למדוד את עומס הטפילים על ידי ספירת מספר הטפילים בתוך כל תא. בדיקות מולקולריות ותפקודיות נוספות יכולות להתבצע גם בסופרנטנטים בתרבית או בתוך המקרופאגים עצמם, מה שמאפשר ליישם פרוטוקול זה במגוון הקשרים וגם להתאים אותו למיני טפילים תוך-תאיים אחרים.

הטפיל התוך-תאי של הסוג לישמניה, הוא הגורם הסיבתי לקומפלקס מחלות מוזנח המכונה לישמניאזיס¹. למחלות טרופיות אלו יש מגוון רחב של ביטויים קליניים שיכולים לנוע מנגעים בעור ועד לסיבוכים הנובעים מהצורה הקרבית של המחלה, שעלולים להיות קטלניים אם לא מטפלים בהם. לישמניאזיס עורית (CL) היא הצורה השכיחה ביותר של לישמניאזיס ומאופיינת בנגעי עור כיביים בודדים או מעטים עם דלקת כרונית מחמירה². התפתחות המחלה תלויה במין הלישמניה, בנוסף לשילוב של גורמים הקשורים לתגובה החיסונית של המארח, ששניהם מגדירים תוצאות קליניות ^3,4. Leishmania braziliensis הוא המין העיקרי הגורם ל-CL בברזיל, עם מקרים מדווחים בכל מדינות המדינה⁵. התגובה החיסונית נגד L. braziliensis נחשבת למגנה, מכיוון שהיא מגבילה את הטפיל לאתר החיסון, ומערבת מספר סוגי תאים חיסוניים, כגון מקרופאגים, נויטרופילים e לימפוציטים ^4,6,7.

מקרופאגים הם תאים רב תכליתיים החיוניים למערכת החיסון, מכיוון שהם מתמחים באיתור ופגוציטוזה של מיקרואורגניזמים, ויכולים להציג אנטיגנים ולהפעיל סוגי תאים אחרים. מקרופאגים מסוגלים לווסת תהליכים מדלקת ועד תיקון רקמות ושמירה על הומאוסטזיס ^8,9. תאים אלה ממלאים תפקיד חיוני בתגובה החיסונית המוקדמת נגד טפילים תוך-תאיים, כגון לישמניה, והם חשובים לחיסולם 10,11,12.

במהלך זיהום L. braziliensis, מקרופאגים יכולים להגיב באמצעות מנגנונים שונים לחיסול הטפיל, כגון ייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS) ומתווכים דלקתיים^13,14. תגובות חיסוניות יכולות להיות מונחות על ידי ייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים או אנטי דלקתיים, התורמים להחמרה במצב דלקתי או לתהליכי תיקון רקמות ^6,15,16. הפלסטיות של מקרופאגים היא בסיסית לאימונופתוגנזה של CL, כמו גם לאינטראקציה בין טפילים למארח, ותאים אלה נחשבים חיוניים להבהרת מנגנוני המחלה ולפיתוח גישות טיפוליות חדשות.

מכיוון ש-CL היא מחלה מורכבת, חקירות דורשות מהחוקרים לחקור סוגי תאים המחקים את אלה שנמצאים בבני אדם. התגובות החיסוניות שנצפו במודלים ניסיוניים שונים יכולות להשתנות ולהפיק תוצאות שאינן משקפות את התגובה החיסונית שנצפתה בבני אדם שנדבקו באופן טבעי. לפיכך, הפרוטוקול המוצג כאן נועד לאפשר חקר מקרופאגים אנושיים ותגובותיהם החיסוניות במהלך CL הנגרמות על ידי L. braziliensis.

מועצת הביקורת המוסדית לאתיקה במחקר בבני אדם במכון גונסאלו מוניז (קרן אוסוולדו קרוז-IGM-FIOCRUZ, סלבדור, באהיה-ברזיל), אישרה מחקר זה (מספר פרוטוקול: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. בידוד PBMCs אנושיים

1. ודא שדגימות הדם, שיפוע צפיפות של 1.077 גרם/מ"ל (למשל, Ficoll-Histopaque) ותמיסת מי מלח נמצאים בטמפרטורת החדר.
2. יש לדלל דגימות דם בתמיסת מלח ביחס של 1:1.
3. העבירו 10-12 מ"ל של שיפוע צפיפות לצינורות של 50 מ"ל.
4. שכב בזהירות עד 40 מ"ל של דגימת הדם המדוללת על גבי שיפוע הצפיפות. הפרד את שכבות שיפוע הדם והצפיפות.
5. צנטריפוגה ראשונה: צינורות צנטריפוגה המכילים שכבות שיפוע דם וצפיפות ב-400 x גרם למשך 30 דקות ב-24 מעלות צלזיוס.
   הערה: כבה את הבלם לפני הפעלת הצנטריפוגה.
6. הסר את הפלזמה מעל טבעת ה-PBMC בעזרת פיפטה (שכבת הפרווה של באפי ממוקמת בין שכבות הפלזמה ושכבות שיפוע הצפיפות; מתחתיה כדוריות דם אדומות/גרנולוציטים).
7. העבירו את שכבת ה-PBMC דמוית הענן (שכבת מעיל באפי) עם פיפטה לצינור של 15 מ"ל ומלאו במי מלח קרים (נשמרים על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס).
8. צנטריפוגה שנייה: צינורות צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כשהבלם מופעל.
9. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה על ידי מילוי הצינור במי מלח קרים.
10. צנטריפוגה שלישית: צינורות צנטריפוגה ב-250 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כשהבלם מופעל.
11. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה, ומלאו את הצינור במי מלח קרים.
12. צנטריפוגה רביעית: צנטריפוגה של הצינור ב-200 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כשהבלם מופעל.
13. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הכדור עם 1 מ"ל של מדיום RPMI קר.
14. ספור תאים כדי לקבוע את מספר התאים שהתקבלו.

2. התמיינות למקרופאגים אנושיים

הערה: עבור צלחת של 24 בארות, חשב את כמות התאים הכוללת הדרושה לצלחת 2 x 10⁶ תאים לבאר, שתניב 2 x 10⁵ מקרופאגים. תשואה זו מבוססת על ממוצע של 10% מונוציטים בדם אנושי. לחלופין, מונוציטים יכולים להשתחרר גם בשיטות לא אנזימטיות ולאחר מכן לספור אותם לצורך ציפוי.

1. על צלחת של 24 בארות, הניחו כיסויי זכוכית עגולים בגודל 13 מ"מ בתחתית כל באר. צלחת שווה ערך ל -2×10⁶ תאים ב -1 מ"ל RPMI לא שלם לבאר.
   הערה: הגבל את מספר התאים בכל באר, מכיוון שכמויות מוערכות יתר עלולות לעכב את הידבקות התאים ולפגוע בתרבות. בנוסף, כל הכיסויים חייבים להיות נקיים וסטריליים.
2. דגירה של צלחות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO₂ להדבקת תאים.
3. יש להסיר את חומרי העל ולשטוף פעם אחת עם 0.9% מי מלח בטמפרטורת החדר כדי להסיר תאים שאינם נדבקים.
4. לאחר הכביסה, יש להסיר את מי המלח ולהוסיף 250 מיקרוליטר של מדיום RPMI מוסף בטמפרטורת החדר (10% סרום בקר עוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-50 ננוגרם/מ"ל m-csf) לכל באר.
5. דגרו על התאים למשך 7 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO₂.
   1. הוסף 125 מיקרוליטר של מדיום RPMI בתוספת לכל באר כל יומיים. בתום התמיינות התאים, הנפח הסופי יהיה 500 מיקרוליטר לבאר.
   2. כדי לנתח את כדאיות התאים, בצע תרבית נוספת במקביל על צלחת של 96 בארות (2 x 10⁵ לבאר).
   3. לאחר התמיינות למקרופאגים (7 ימים), הוסף 20 מיקרוליטר של מגיב AlamarBlue.
   4. לאחר 7 שעות דגירה, קרא לוחות על ספקטרופוטומטר באורכי גל של 570 ננומטר ו-600 ננומטר.

3. תרבות לישמניה, זיהום

הערה: L. braziliensis promastigotes משני זנים שונים (MHOM/BR/01/BA788 ו-MHOM/BR88/BA-3456) שימשו בבדיקה זו.

1. ספרו טפילי Lb וחישבו את הנפח כדי להשיג 5 x 10⁵/mL טפילים.
2. יש להכין תוסף תזונה למדיום החרקים של שניידר (10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/מ"ל פניצילין ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין).
3. דגירה של טפילים בנפח כולל של 5 מ"ל בחממה של 24 מעלות צלזיוס עד להגעה לשלב הנייח (4 עד 6 ימים).
   הערה: ספרו טפילים כל יום כדי להעריך את הגדילה.
4. לאחר שהגיעו לשלב הנייח, צנטריפוגה תרביות לישמניה, ב-100 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר טפילים מתים (שקועים בתחתית הצינור).
5. העבירו את הסופרנטנט לצינור וצנטריפוגה חדשים ב-1,800 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לשחזר טפילים ברי קיימא. השליכו את הסופרנטנט.
6. השעו מחדש את הגלולה עם 1 מ"ל של מדיום RPMI בתוספת כדי לספור טפילים.
7. חשב את נפח הטפילים כדי לקבל יחס טפיל:תא של 10:1. העבירו טפילים לצלחות תרבית המכילות מקרופאגים שגודלו בעבר במדיום RPMI נוסף (~300 מיקרוליטר לבאר) בטמפרטורת החדר.
8. הסר את הסופרנטנט מכל באר המכילה מקרופאגים מובחנים.
   הערה: בהקדם האפשרי, החלף את המדיום בכל באר כדי למנוע תאים לבלות תקופות ממושכות ללא מדיום. אנו ממליצים להסיר ולהחליף מדיום בשלוש בארות בכל פעם.
9. העבירו את הכמות המחושבת של Lb לכל באר המכילה מקרופאגים מובחנים.
10. להדביק תאים למשך 4 או 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO₂.
    1. לאחר 4 שעות, שטפו מקרופאגים 3 פעמים במי מלח בטמפרטורת החדר כדי להסיר טפילים שאינם מופנמים.
    2. לתקופת ההדבקה של 24 שעות, הוסף 300 מיקרוליטר של מדיום RPMI בתוספת לכל באר לאחר הכביסה, ולאחר מכן דגירה מחדש למשך 20 שעות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO₂.
11. הסירו את הסופרנטנט כדי למדוד מתווכים דלקתיים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA) בהתאם להוראות היצרן.
    1. צנטריפוגה הסופרנטנט שנאסף ב-1,800 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. הליך זה מבוצע כדי להסיר כל טפילים שאינם מופנמים. ניתן להקפיא סופרנטנטים ולשמור אותם בטמפרטורה של -80^{מעלות צלזיוס}עד למועד הניתוח העתידי.
       הערה: ניתן להשתמש בתאים כדי להעריך את קצב הזיהום, כדאיות הטפילים או ייצור ROS.

4. הערכת זיהום

1. כימות שיעור ההדבקה
   1. הוסף 300 מיקרוליטר מתנול לכל באר לאחר הסרת הסופרנטנט. אפשר 15 דקות לתקן תאים שנדבקו לכיסויים.
   2. הסר את החלקות הכיסוי מהבארות והנח על תומך כדי להשרות בתמיסת צביעת התאים (למשל, מהיר פנאופטי 2) למשך דקה אחת.
   3. טבלו את הכיסוי פעמיים בתמיסת צביעת תאים (למשל, Quick Panoptic 3) והמתינו עד לייבוש.
   4. הנח 15 מיקרוליטר של מדיום הרכבה (למשל, אנטלן) על שקופיות, ולאחר מכן הנח כיסויים מעל המדיום.
      הערה: כל המקרופאגים המחוברים לכיסויים צריכים להיות במגע עם אמצעי ההרכבה.
   5. ספור 100 תאים באופן אקראי תחת מיקרוסקופ אופטי באמצעות יעד פי 100 כדי לכמת את שיעור ההדבקה ומספר האמסטיגוטים המופנמים.
2. כדאיות הטפיל
   1. לאחר 4 שעות של זיהום יש לשטוף תאים במי מלח בטמפרטורת החדר 3 פעמים.
   2. הוסף 300 מיקרוליטר של מדיום חרקים של שניידר.
   3. דגירה בחממה של 24 מעלות צלזיוס.
   4. כמת את צמיחת הטפילים לאחר 48, 72, 96 ו -120 שעות.

5. הערכת ייצור ROS על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

1. לאחר תקופת ההדבקה, הסר את הסופרנטנט ושטוף תאים עם 500 מיקרוליטר מי מלח.
2. הוסף 300 מיקרוליטר של מגיב הבדיקה הפלואורוגני (למשל, מגיב ירוק CellROX ב-5 מיקרומטר) לכל באר.
3. דגירה של תאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂.
4. שטפו תאים פי 3 עם 500 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט (PBS).
5. תקן תאים עם 300 מיקרוליטר של פורמלדהיד 3.7% והניח לשבת במשך 15 דקות.
   הערה: מדוד את אות התפרחת תוך 24 שעות.
6. הוסף 5 מיקרוליטר של חומר צביעה DAPI (למשל, DAPI ProLong Gold antifade) לצביעת תאים. הנח את הכיסוי עם המשטח המכיל מקרופאגים במגע ישיר עם חומר הצביעה DAPI.
7. נתח את אות הפריחה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באורך גל עירור של 485/520 ננומטר.
8. חשב את הקרינה הכוללת המתוקנת של התאים (CTCF) מ-30 תאים עבור כל כיסוי באמצעות ImageJ.
   CTCF = צפיפות משולבת (שטח של תא נבחר x פלואורסצנטיות ממוצעת של קריאות רקע)

6. ניתוח סטטיסטי

1. השתמש במבחן מאן-וויטני כדי להשוות שתי קבוצות עם דגימות לא מזווגות. בצע את הניתוחים הסטטיסטיים באמצעות GraphPad Prism 7.0. קחו בחשבון הבדלים מובהקים סטטיסטית כאשר p < 0.05.

הבנת האינטראקציה בין טפילים ותאי מארח חיונית להבהרת המנגנונים המעורבים בפתוגנזה של מספר מחלות. למרות שתאים אנושיים מתורבתים נמצאים בשימוש פחות בגלל מגבלות של תרבית תאים בהשוואה לשושלות תאים, הפרוטוקול המוצג כאן מראה התמיינות חזקה וניתנת לשחזור של מקרופאגים אנושיים. פ?...

הפרוטוקול המוצג כאן עבור התמיינות מונוציטים אנושיים למקרופאגים ואחריו הדבקה בשני זנים של L. braziliensis מאפשר הערכה של מספר היבטים של אינטראקציה בין טפילים לתאים כלים אלה יכולים להיות חיוניים כדי להבהיר שאלות ללא מענה על CL. עם הקמת פרוטוקול זה, הקבוצה שלנו הצליחה לחשוף כ...

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

עבודה זו נתמכה על ידי Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) תחת מענק מספר PET0009/2016 ו-Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazil (CAPES) תחת קוד פיננסי 001.