الحصول على البلاعم من الخلايا الوحيدة البشرية لتقييم معدل الإصابة بداء الليشمانيا البرازيلي والاستجابة المناعية الفطرية للمضيف

يصف هذا البروتوكول عملية الحصول على البلاعم البشرية من الخلايا الوحيدة للإصابة بمرض الليشمانيا البرازيلية. كما يسمح للباحثين بتقييم معدل العدوى وقابلية طفيليات البقاء ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية عن طريق الفحص المجهري الفلوري ، وإنتاج الوسطاء الالتهابيين في المواد الطافية المزروعة للتحقيق في استجابة البلاعم للعدوى.

الضامة هي خلايا متعددة الوظائف ضرورية لوظيفة الجهاز المناعي ، والخلية المضيفة الأولية في عدوى الليشمانيا البرازيلية (Lb). هذه الخلايا متخصصة في التعرف على الكائنات الحية الدقيقة والبلعمة ، ولكنها تنشط أيضا الخلايا المناعية الأخرى والمستضدات الحالية ، فضلا عن تعزيز الالتهاب وإصلاح الأنسجة. هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على خلايا أحادية النواة من الدم المحيطي (PBMC) للمتبرعين الأصحاء لفصل الخلايا الوحيدة التي تتمايز بعد ذلك إلى ضامة. يمكن بعد ذلك إصابة هذه الخلايا في المختبر بتركيزات مختلفة من الباطل لتقييم القدرة على السيطرة على العدوى ، وكذلك تقييم الاستجابة المناعية للخلية المضيفة ، والتي يمكن قياسها بعدة طرق. تم عزل PBMCs أولا عن طريق الطرد المركزي بتدرج Ficoll-Hypaque ثم تم طلاؤها للسماح للخلايا الوحيدة بالالتصاق بألواح الاستزراع. تمت إزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق الغسيل. بعد ذلك ، تم زراعة الخلايا الملتصقة بعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) لمدة 7 أيام للحث على تمايز البلاعم. نقترح طلاء 2 × 10⁶ خلايا لكل بئر على ألواح 24 بئرا من أجل الحصول على 2 × 10⁵ ضامة. يمكن بعد ذلك إصابة البلاعم المتمايزة تماما بالرطل لمدة 4 أو 24 ساعة. ينتج عن هذا البروتوكول نسبة كبيرة من الخلايا المصابة ، والتي يمكن تقييمها عن طريق الفحص المجهري البصري أو الفلوري. بالإضافة إلى مؤشر العدوى ، يمكن قياس حمل الطفيليات عن طريق حساب أعداد الطفيليات داخل كل خلية. يمكن أيضا إجراء المزيد من المقايسات الجزيئية والوظيفية في الثقافة الطفية أو داخل الضامة نفسها ، مما يسمح بتطبيق هذا البروتوكول في مجموعة متنوعة من السياقات وتكييفه أيضا مع أنواع الطفيليات الأخرى داخل الخلايا.

الطفيلي الأولي داخل الخلايا من جنس الليشمانيا هو العامل المسبب لمركب مرض مهمل يعرف باسم داء الليشمانيات¹. هذه الأمراض المدارية لها مجموعة واسعة من المظاهر السريرية التي يمكن أن تتراوح من الآفات الجلدية إلى المضاعفات الناشئة عن الشكل الحشوي للمرض ، والتي يمكن أن تكون قاتلة إذا لم يتم علاجها. داء الليشمانيات الجلدي (CL) هو الشكل الأكثر شيوعا لداء الليشمانيات ويتميز بآفات جلدية متقرحة واحدة أو قليلة مع تفاقم الالتهاب^{المزمن 2}. يعتمد تطور المرض على أنواع الليشمانيا ، بالإضافة إلى مجموعة من العوامل المرتبطة بالاستجابة المناعية للمضيف ، والتي تحدد النتائج السريرية^3،4. الليشمانيا البرازيلية هي الأنواع الرئيسية التي تسبب مرض الليشمانيا البرازيلي في البرازيل، حيث تم الإبلاغ عن حالات في جميع ولايات البلاد⁵. تعتبر الاستجابة المناعية ضد L. braziliensis وقائية ، لأنها تقيد الطفيلي في موقع التلقيح ، وتشمل عدة أنواع من الخلايا المناعية ، مثل البلاعم ، العدلات e الخلايا الليمفاوية^4،6،7.

البلاعم هي خلايا متعددة الوظائف ضرورية لجهاز المناعة ، لأنها متخصصة في الكشف عن الكائنات الحية الدقيقة وبلعمة لها ، ويمكنها تقديم المستضدات وتنشيط أنواع الخلايا الأخرى. البلاعم قادرة على تنظيم العمليات من الالتهاب إلى إصلاح الأنسجة والحفاظ على التوازن^8،9. تلعب هذه الخلايا دورا أساسيا في الاستجابة المناعية المبكرة ضد الطفيليات داخل الخلايا ، مثل الليشمانيا ، كونها مهمة للقضاء^{عليها 10،11،12}.

أثناء عدوى L. braziliensis ، يمكن أن تستجيب البلاعم من خلال آليات مختلفة للقضاء على الطفيلي ، مثل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والوسطاء الالتهابيين^13،14. يمكن أن تسترشد الاستجابات المناعية بإنتاج السيتوكينات المسببة للالتهابات أو المضادة للالتهابات ، والتي تساهم في تفاقم الحالة الالتهابية أو عمليات إصلاح الأنسجة^6،15،16. تعتبر مرونة الضامة أمرا أساسيا للتسبب المناعي ل CL ، وكذلك للتفاعل بين الطفيليات والمضيف ، وتعتبر هذه الخلايا حاسمة لتوضيح آليات المرض وتطوير مناهج علاجية جديدة.

نظرا لأن CL مرض معقد ، تتطلب التحقيقات من الباحثين استكشاف أنواع الخلايا التي تحاكي تلك الموجودة في البشر. يمكن أن تختلف الاستجابات المناعية التي لوحظت في النماذج التجريبية المختلفة وتنتج نتائج لا تعكس الاستجابة المناعية التي لوحظت في البشر المصابين بشكل طبيعي. وبالتالي ، تم تصميم البروتوكول المقدم هنا لتمكين دراسة البلاعم البشرية واستجاباتها المناعية أثناء CL الناجم عن L. braziliensis.

وافق مجلس المراجعة المؤسسية للأخلاقيات في البحوث البشرية في معهد غونسالو مونيز (مؤسسة أوزوالدو كروز-IGM-FIOCRUZ، سلفادور، باهيا-البرازيل) على هذه الدراسة (رقم البروتوكول: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. عزل PBMCs البشرية

1. تأكد من أن عينات الدم ، تدرج الكثافة 1.077 جم / مل (على سبيل المثال ، Ficoll-Histopaque) ، والمحلول الملحي في درجة حرارة الغرفة.
2. تمييع عينات الدم بمحلول ملحي بنسبة 1: 1.
3. نقل 10-12 مل من تدرج الكثافة إلى أنابيب 50 مل.
4. قم بتراكب ما يصل إلى 40 مل من عينة الدم المخففة بعناية فوق تدرج الكثافة. افصل طبقات تدرج الدم والكثافة.
5. الطرد المركزي الأول: أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على طبقات تدرج الدم والكثافة عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة عند 24 درجة مئوية.
   ملاحظة: قم بإيقاف تشغيل الفرامل قبل بدء تشغيل جهاز الطرد المركزي.
6. قم بإزالة البلازما فوق حلقة PBMC باستخدام ماصة (تقع طبقة الطبقة المصفرية بين طبقات البلازما وتدرج الكثافة ؛ يوجد أدناه خلايا الدم الحمراء / حبيبات الخلايا المحببة).
7. انقل طبقة PBMC الشبيهة بالسحابة (طبقة طبقة معطف مصفر) بماصة إلى أنبوب سعة 15 مل واملأها بمحلول ملحي بارد (يحفظ على الجليد أو عند 4 درجات مئوية).
8. الطرد المركزي الثاني: أنابيب الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تشغيل الفرامل.
9. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات عن طريق ملء الأنبوب بالمحلول الملحي البارد.
10. الطرد المركزي الثالث: أنابيب الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تشغيل الفرامل.
11. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات ، واملأ الأنبوب بالمحلول الملحي البارد.
12. الطرد المركزي الرابع: الطرد المركزي للأنبوب عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع تشغيل الفرامل.
13. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات ب 1 مل من وسط RPMI البارد.
14. عد الخلايا لتحديد عدد الخلايا التي تم الحصول عليها.

2. التمايز إلى البلاعم البشرية

ملاحظة: بالنسبة للوحة 24 بئرا ، احسب كمية الخلايا الإجمالية اللازمة للوحة 2 × 10⁶ خلايا لكل بئر ، مما ينتج عنه 2 × 10⁵ ضامة. يعتمد هذا العائد على متوسط 10٪ من الخلايا الوحيدة في دم الإنسان. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا إطلاق الخلايا الوحيدة بطرق غير إنزيمية ثم عدها للطلاء.

1. على طبق 24 بئرا ، ضع أغطية زجاجية مستديرة مقاس 13 مم في قاع كل بئر. لوحة ما يعادل 2×10⁶ خلايا في 1 مل من RPMI غير مكتملة لكل بئر.
   ملاحظة: قلل من عدد الخلايا في كل بئر ، لأن الكميات المبالغ فيها يمكن أن تعيق التصاق الخلايا وتضر بالثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون جميع الأغطية نظيفة ومعقمة.
2. احتضان الألواح لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للتصاق الخلية.
3. قم بإزالة المواد الطافية واغسلها مرة واحدة بمحلول ملحي 0.9٪ في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي خلايا غير ملتصقة.
4. بعد الغسيل، قم بإزالة المحلول الملحي وإضافة 250 ميكرولتر من وسط RPMI المكممل في درجة حرارة الغرفة (10٪ مصل بقري جنين (FBS)، 2 ملي لجلوتامين، 100 ميكروغرام/مل بنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين و50 نانوغرام/مل م-سي إسف) لكل بئر.
5. احتضان الخلايا لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   1. أضف 125 ميكرولتر من وسط RPMI المكممل إلى كل بئر كل يومين. في نهاية تمايز الخلايا ، سيكون الحجم النهائي 500 ميكرولتر لكل بئر.
   2. لتحليل صلاحية الخلية ، قم بإجراء ثقافة أخرى بالتوازي على صفيحة 96 بئرا (2 × 10⁵ لكل بئر).
   3. بعد التمايز إلى البلاعم (7 أيام) ، أضف 20 ميكرولتر من كاشف AlamarBlue.
   4. بعد 7 ساعات من الحضانة ، اقرأ اللوحات على مقياس الطيف الضوئي بأطوال موجية تبلغ 570 نانومتر و 600 نانومتر.

3. ثقافة الليشمانيا والعدوى

ملاحظة: L. braziliensis promastigotes من سلالتين مختلفتين (MHOM / BR / 01 / BA788 و MHOM / BR88 / BA-3456) تم استخدامها في هذا الفحص.

1. عد طفيليات رطل واحسب الحجم للحصول على طفيليات 5 × 10⁵ / مل.
2. تحضير وسط حشرات شنايدر المكمل (10٪ FBS ، 2 ملي مولار L-glutamine ، 100 U / مل بنسلين ، و 100 مجم / مل ستربتومايسين).
3. احتضان الطفيليات بحجم إجمالي قدره 5 مل في حاضنة 24 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى المرحلة الثابتة (4 إلى 6 أيام).
   ملاحظة: عد الطفيليات كل يوم لتقييم النمو.
4. بعد الوصول إلى المرحلة الثابتة ، تقوم مزارع الليشمانيا بالطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة أي طفيليات ميتة (تترسب في قاع الأنبوب).
5. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي عند 1,800 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لاستعادة الطفيليات القابلة للحياة. تخلص من المادة الطافية.
6. أعد تعليق الحبيبات ب 1 مل من وسط RPMI المكممل لحساب الطفيليات.
7. احسب حجم الطفيليات للحصول على نسبة طفيلي 10: 1. نقل الطفيليات إلى صفائح الاستزراع التي تحتوي على البلاعم التي سبق زراعتها في وسط RPMI مكمل (~ 300 ميكرولتر / بئر) في درجة حرارة الغرفة.
8. قم بإزالة المادة الطافية من كل بئر تحتوي على ضامة متباينة.
   ملاحظة: في أقرب وقت ممكن ، استبدل الوسط في كل بئر لتجنب قضاء الخلايا لفترات طويلة بدون وسيط. نقترح إزالة واستبدال الوسط في ثلاثة آبار في المرة الواحدة.
9. انقل الكمية المحسوبة من الباطل إلى كل بئر يحتوي على ضامة متمايزة.
10. تصيب الخلايا لمدة 4 أو 24 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
    1. بعد 4 ساعات ، اغسل البلاعم 3 مرات بالمحلول الملحي في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي طفيليات غير داخلية.
    2. بالنسبة لفترة العدوى التي تبلغ 24 ساعة ، أضف 300 ميكرولتر من وسط RPMI المكمل إلى كل بئر بعد الغسيل ، ثم أعد احتضانة لمدة 20 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
11. قم بإزالة المادة الطافية لقياس الوسطاء الالتهابيين باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    1. جهاز طرد مركزي المادة الطافية التي تم جمعها عند 1,800 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. يتم تنفيذ هذا الإجراء لإزالة أي طفيليات غير داخلية. يمكن تجميد المواد الطافية والاحتفاظ بها في درجة حرارة -80^درجةمئوية حتى وقت التحليل المستقبلي.
       ملاحظة: يمكن استخدام الخلايا لتقييم معدل العدوى أو قابلية الطفيليات أو إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية.

4. تقييم العدوى

1. القياس الكمي لمعدل الإصابة
   1. أضف 300 ميكرولتر من الميثانول إلى كل بئر بعد إزالة المادة الطافية. اترك 15 دقيقة لإصلاح الخلايا الملتصقة بقلائف الغطاء.
   2. قم بإزالة الغطاء من الآبار وضعه على دعامة لامتصاصها في محلول تلطيخ الخلية (على سبيل المثال ، Quick Panoptic 2) لمدة 1 دقيقة.
   3. اغمر أغطية الغمر مرتين في محلول تلطيخ الخلية (على سبيل المثال ، Quick Panoptic 3) وانتظر حتى تجف.
   4. ضع 15 ميكرولتر من وسط التثبيت (على سبيل المثال ، Entellan) على الشرائح ، ثم ضع أغطية فوق الوسط.
      ملاحظة: يجب أن تكون جميع البلاعم المرفقة بطبقات الغطاء على اتصال بوسط التركيب.
   5. عد 100 خلية عشوائيا تحت المجهر البصري باستخدام هدف 100x لتحديد معدل الإصابة وعدد الداخلية
2. الجدوى الطفيلية
   1. بعد 4 ساعات من الإصابة ، اغسل الخلايا بالمحلول الملحي في درجة حرارة الغرفة 3 مرات.
   2. أضف 300 ميكرولتر من وسط حشرات شنايدر المكملة.
   3. احتضن في حاضنة 24 درجة مئوية.
   4. تحديد نمو الطفيليات بعد 48 و 72 و 96 و 120 ساعة.

5. تقييم إنتاج ROS عن طريق المجهر الفلوري

1. بعد فترة الإصابة ، قم بإزالة المادة الطافية وغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من المحلول الملحي.
2. أضف 300 ميكرولتر من كاشف المسبار الفلوري (على سبيل المثال ، كاشف CellROX الأخضر عند 5 ميكرومتر) إلى كل بئر.
3. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
4. اغسل الخلايا 3x ب 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
5. قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 300 ميكرولتر من 3.7٪ فورمالديهايد واتركها لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: قم بقياس إشارة الإزهار في غضون 24 ساعة.
6. أضف 5 ميكرولتر من عامل تلطيخ DAPI (على سبيل المثال ، DAPI ProLong Gold المضاد للتلاشي) لتلوين الخلايا. ضع الغطاء مع السطح الذي يحتوي على البلاعم على اتصال مباشر بعامل تلطيخ DAPI.
7. تحليل إشارة الإزهار عن طريق المجهر الفلوري بطول موجة إثارة يبلغ 485/520 نانومتر.
8. احسب التألق الكلي للخلية المصححة (CTCF) من 30 خلية لكل غطاء باستخدام ImageJ.
   CTCF = الكثافة المتكاملة (مساحة خلية مختارة × متوسط تألق قراءات الخلفية)

6. التحليل الإحصائي

1. استخدم اختبار مان ويتني لمقارنة مجموعتين مع عينات غير متزاوجة. قم بإجراء التحليلات الإحصائية باستخدام GraphPad Prism 7.0. ضع في اعتبارك الاختلافات ذات دلالة إحصائية عندما < p 0.05.

يعد فهم الطفيليات وتفاعل الخلايا المضيفة أمرا بالغ الأهمية لتوضيح الآليات المشاركة في التسبب في العديد من الأمراض. على الرغم من أن الخلايا البشرية المستزرعة أقل استخداما بسبب قيود زراعة الخلايا مقارنة بسلالات الخلايا ، إلا أن البروتوكول المقدم هنا يظهر تمايزا قويا وقا...

البروتوكول المقدم هنا لتمايز الخلايا الوحيدة البشرية إلى البلاعم متبوعا بالعدوى بسلالتين من L. braziliensis يسمح بتقييم العديد من جوانب تفاعل الخلايا الطفيلية. يمكن أن تكون هذه الأدوات حاسمة لتوضيح الأسئلة التي لم تتم الإجابة عليها حول CL. مع إنشاء هذا البروتوكول ، تمكنت ?...

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

تم دعم هذا العمل من قبل Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) بموجب المنحة رقم PET0009/2016 و Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazil (CAPES) بموجب قانون المالية 001.