Ottenimento di macrofagi da monociti umani per valutare il tasso di infezione da Leishmania braziliensis e la risposta immunitaria innata dell'ospite

Questo protocollo descrive il processo per ottenere macrofagi umani dai monociti per l'infezione da Leishmania braziliensis. Consente inoltre ai ricercatori di valutare il tasso di infezione e la vitalità del parassita, la produzione di ROS mediante microscopia a fluorescenza e la produzione di mediatori infiammatori nei surnatanti di coltura per studiare la risposta dei macrofagi all'infezione.

I macrofagi sono cellule multifunzionali essenziali per la funzione del sistema immunitario e la principale cellula ospite nell'infezione da Leishmania braziliensis (Lb). Queste cellule sono specializzate nel riconoscimento dei microrganismi e nella fagocitosi, ma attivano anche altre cellule immunitarie e presentano antigeni, oltre a promuovere l'infiammazione e la riparazione dei tessuti. Qui, descriviamo un protocollo per ottenere cellule mononucleate da sangue periferico (PBMC) di donatori sani per separare i monociti che poi si differenziano in macrofagi. Queste cellule possono quindi essere infettate in vitro a diverse concentrazioni di Lb per valutare la capacità di controllare l'infezione, nonché valutare la risposta immunitaria della cellula ospite, che può essere misurata con diversi metodi. Le PBMC sono state prima isolate mediante centrifugazione con gradiente Ficoll-Hypaque e poi piastrate per consentire ai monociti di aderire alle piastre di coltura; Le cellule non aderenti sono state rimosse mediante lavaggio. Successivamente, le cellule aderenti sono state coltivate con fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) per 7 giorni per indurre la differenziazione dei macrofagi. Si consiglia di placcare 2 x 10⁶ celle per pozzetto su piastre a 24 pozzetti per ottenere 2 x 10⁵ macrofagi. I macrofagi completamente differenziati possono quindi essere infettati con Lb per 4 o 24 ore. Questo protocollo si traduce in una percentuale significativa di cellule infette, che può essere valutata mediante microscopia ottica o a fluorescenza. Oltre all'indice di infezione, la carica di parassiti può essere misurata contando il numero di parassiti all'interno di ciascuna cellula. Ulteriori saggi molecolari e funzionali possono essere eseguiti anche in surnatanti di coltura o all'interno dei macrofagi stessi, il che consente di applicare questo protocollo in una varietà di contesti e di adattarlo anche ad altre specie di parassiti intracellulari.

Il parassita protozoo intracellulare del genere Leishmania è l'agente eziologico di un complesso di malattie trascurate noto come leishmaniosi¹. Queste malattie tropicali hanno una vasta gamma di manifestazioni cliniche che possono variare dalle lesioni cutanee alle complicanze derivanti dalla forma viscerale della malattia, che possono essere fatali se non trattate. La leishmaniosi cutanea (CL) è la forma più frequente di leishmaniosi ed è caratterizzata da una o più lesioni cutanee ulcerate con infiammazione cronica esacerbata². Lo sviluppo della malattia dipende dalla specie Leishmania, oltre a una combinazione di fattori associati alla risposta immunitaria dell'ospite, che definiscono entrambi gli esiti clinici ^3,4. Leishmania braziliensis è la principale specie che causa CL in Brasile, con casi segnalati in tutti gli stati del paese⁵. La risposta immunitaria contro L. braziliensis è considerata protettiva, poiché limita il parassita al sito di inoculazione, e coinvolge diversi tipi di cellule immunitarie, come macrofagi, neutrofili e linfociti ^4,6,7.

I macrofagi sono cellule multifunzionali essenziali per il sistema immunitario, poiché sono specializzate nella rilevazione e nella fagocitosi di microrganismi e possono presentare antigeni e attivare altri tipi di cellule. I macrofagi sono in grado di regolare i processi dall'infiammazione alla riparazione tissutale e al mantenimento dell'omeostasi ^8,9. Queste cellule svolgono un ruolo essenziale nella risposta immunitaria precoce contro i parassiti intracellulari, come la Leishmania, essendo importanti per la loro eliminazione 10,11,12.

Durante l'infezione da L. braziliensis, i macrofagi possono rispondere attraverso diversi meccanismi per eliminare il parassita, come la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e mediatori infiammatori^13,14. Le risposte immunitarie possono essere guidate dalla produzione di citochine proinfiammatorie o antinfiammatorie, che contribuiscono a uno stato infiammatorio esacerbato o ai processi di riparazione dei tessuti ^6,15,16. La plasticità dei macrofagi è fondamentale per l'immunopatogenesi della CL, così come per l'interazione parassita-ospite, e queste cellule sono considerate cruciali per la delucidazione dei meccanismi di malattia e per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.

Poiché la CL è una malattia complessa, le indagini richiedono ai ricercatori di esplorare i tipi di cellule che imitano quelle presenti negli esseri umani. Le risposte immunitarie osservate in diversi modelli sperimentali possono variare e produrre risultati che non riflettono la risposta immunitaria osservata negli esseri umani naturalmente infetti. Pertanto, il protocollo qui presentato è stato progettato per consentire lo studio dei macrofagi umani e delle loro risposte immunitarie durante la CL causata da L. braziliensis.

L'Institutional Review Board for Ethics in Human Research presso l'Istituto Gonçalo Moniz (Oswaldo Cruz Foundation-IGM-FIOCRUZ, Salvador, Bahia-Brasile), ha approvato questo studio (numero di protocollo: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. Isolamento delle PBMC umane

1. Assicurarsi che i campioni di sangue, il gradiente di densità di 1,077 g/mL (ad es. Ficoll-Histopaque) e la soluzione salina siano a temperatura ambiente.
2. Diluire i campioni di sangue con una soluzione salina in rapporto 1:1.
3. Trasferire 10-12 mL di gradiente di densità in provette da 50 mL.
4. Sovrapporre con cura fino a 40 ml di campione di sangue diluito sopra il gradiente di densità. Separare gli strati del sangue e del gradiente di densità.
5. Prima centrifugazione: provette da centrifuga contenenti sangue e strati di gradiente di densità a 400 x g per 30 minuti a 24 ºC.
   NOTA: Spegnere il freno prima di avviare la centrifuga.
6. Rimuovere il plasma sopra l'anello PBMC con una pipetta (lo strato di buffy coat si trova tra il plasma e gli strati del gradiente di densità; al di sotto di questo ci sono i globuli rossi/granulociti).
7. Trasferire lo strato di PBMC a forma di nuvola (buffy coat layer) con una pipetta in una provetta da 15 ml e riempire con soluzione fisiologica fredda (mantenuta in ghiaccio o a 4 °C).
8. Seconda centrifugazione: centrifugare le provette a 300 x g per 10 min a 4 °C con il freno inserito.
9. Scartare il surnatante e risospendere il pellet riempiendo il tubo con soluzione fisiologica fredda.
10. Terza centrifugazione: centrifugare le provette a 250 x g per 10 min a 4 °C con il freno inserito.
11. Scartare il surnatante e risospendere il pellet, riempiendo il tubo con soluzione fisiologica fredda.
12. Quarta centrifugazione: centrifugare la provetta a 200 x g per 10 min a 4 °C con il freno inserito.
13. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con 1 mL di terreno RPMI freddo.
14. Conta le celle per determinare il numero di celle ottenute.

2. Differenziazione in macrofagi umani

NOTA: Per una piastra a 24 pozzetti, calcolare la quantità totale di cellule necessarie per piattare 2 x 10⁶ cellule per pozzetto, che produrrà 2 x 10⁵ macrofagi. Questa resa si basa su una media del 10% di monociti nel sangue umano. In alternativa, i monociti possono anche essere rilasciati con metodi non enzimatici e quindi contati per la placcatura.

1. Su una piastra a 24 pozzetti, posizionare dei vetrini coprioggetti rotondi da 13 mm sul fondo di ciascun pozzetto. Piastra l'equivalente di 2×10⁶ cellule in 1 mL di RPMI incompleto per pozzetto.
   NOTA: Limitare il numero di cellule in ciascun pozzetto, poiché quantità sovrastimate possono ostacolare l'adesione cellulare e compromettere la coltura. Inoltre, tutti i vetrini coprioggetti devono essere puliti e sterili.
2. Incubare le piastre per 30 minuti a 37 ºC sotto il 5% di CO₂ per l'adesione cellulare.
3. Rimuovere i surnatanti e lavare una volta con soluzione fisiologica allo 0,9% a temperatura ambiente per rimuovere eventuali cellule non aderenti.
4. Dopo il lavaggio, rimuovere la soluzione salina e aggiungere 250 μL di terreno RPMI integrato a temperatura ambiente (10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di L-glutammina, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 50 ng/mL M-CSF) a ciascun pozzetto.
5. Incubare le cellule per 7 giorni a 37 ºC sotto il 5% di CO₂.
   1. Aggiungere 125 μl di terreno RPMI integrato a ciascun pozzetto ogni due giorni. Al termine del differenziamento cellulare, il volume finale sarà di 500 μL per pozzetto.
   2. Per analizzare la vitalità cellulare, eseguire un'altra coltura in parallelo su una piastra da 96 pozzetti (2 x 10⁵ per pozzetto).
   3. Dopo la differenziazione in macrofagi (7 giorni), aggiungere 20 μl di reagente AlamarBlue.
   4. Dopo 7 ore di incubazione, leggere le piastre su uno spettrofotometro a lunghezze d'onda di 570 nm e 600 nm.

3. Cultura e infezione della leishmania

NOTA: In questo test sono stati utilizzati promastigoti di L . braziliensis di due ceppi diversi (MHOM/BR/01/BA788 e MHOM/BR88/BA-3456).

1. Conta i parassiti Lb e calcola il volume per ottenere 5 x 10⁵/mL di parassiti.
2. Preparare il terreno integrato per insetti di Schneider (10% FBS, 2 mM di L-glutammina, 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina).
3. Incubare i parassiti in un volume totale di 5 mL in un'incubatrice a 24 ºC fino al raggiungimento della fase stazionaria (da 4 a 6 giorni).
   NOTA: Conta i parassiti ogni giorno per valutare la crescita.
4. Dopo aver raggiunto la fase stazionaria, centrifugare le colture di Leishmania a 100 x g per 10 minuti a 4 ºC per rimuovere eventuali parassiti morti (precipitati sul fondo della provetta).
5. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 1.800 x g per 10 minuti a 4 ºC per recuperare i parassiti vitali. Scartare il surnatante.
6. Risospendere il pellet con 1 mL di terreno RPMI integrato per contare i parassiti.
7. Calcola il volume dei parassiti per ottenere un rapporto parassiti:cellule di 10:1. Trasferire i parassiti su piastre di coltura contenenti macrofagi precedentemente coltivati in terreno RPMI integrato (~300 μL/pozzetto) a temperatura ambiente.
8. Rimuovere il surnatante da ogni pozzetto contenente macrofagi differenziati.
   NOTA: Il prima possibile, sostituire il terreno in ogni pozzetto per evitare che le celle trascorrano lunghi periodi senza terreno. Si consiglia di rimuovere e sostituire il fluido in tre pozzetti alla volta.
9. Trasferire la quantità calcolata di Lb in ciascun pozzetto contenente macrofagi differenziati.
10. Infettare le cellule per 4 o 24 ore a 37 ºC sotto il 5% di CO₂.
    1. Dopo 4 ore, lavare i macrofagi 3 volte con soluzione fisiologica a temperatura ambiente per rimuovere eventuali parassiti non internalizzati.
    2. Per il periodo di infezione di 24 ore, aggiungere 300 μl di terreno RPMI integrato a ciascun pozzetto dopo il lavaggio, quindi incubare nuovamente per altre 20 ore a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
11. Rimuovere il surnatante per misurare i mediatori dell'infiammazione utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) seguendo le istruzioni del produttore.
    1. Centrifugare il surnatante raccolto a 1.800 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Questa procedura viene eseguita per rimuovere eventuali parassiti non internalizzati. I surnatanti possono essere congelati e conservati a -80^oC fino al momento dell'analisi futura.
       NOTA: Le cellule possono essere utilizzate per valutare il tasso di infezione, la vitalità del parassita o la produzione di ROS.

4. Valutazione dell'infezione

1. Quantificazione del tasso di infezione
   1. Aggiungere 300 μl di metanolo a ciascun pozzetto dopo aver rimosso il surnatante. Attendere 15 minuti per fissare le cellule che aderiscono ai vetrini.
   2. Rimuovere i vetrini coprioggetti dai pozzetti e posizionarli su un supporto per immergerli nella soluzione di colorazione cellulare (ad es. Quick Panoptic 2) per 1 minuto.
   3. Immergere due volte i vetrini coprioggetti nella soluzione colorante delle cellule (ad es. Quick Panoptic 3) e attendere che si asciughino.
   4. Posizionare 15 μl di terreno di montaggio (ad es. Entellan) sui vetrini, quindi posizionare i vetrini coprioggetti sul fluido.
      NOTA: Tutti i macrofagi attaccati ai vetrini coprioggetti devono essere a contatto con il mezzo di montaggio.
   5. Conta 100 cellule in modo casuale al microscopio ottico utilizzando un obiettivo 100x per quantificare il tasso di infezione e il numero di amastigoti internalizzati.
2. Vitalità dei parassiti
   1. Dopo 4 ore dall'infezione, lavare le celle con soluzione fisiologica a temperatura ambiente 3 volte.
   2. Aggiungere 300 μl di terreno per insetti di Schneider integrato.
   3. Incubare in un'incubatrice a 24 ºC.
   4. Quantificare la crescita dei parassiti dopo 48, 72, 96 e 120 ore.

5. Valutazione della produzione di ROS mediante microscopia a fluorescenza

1. Dopo il periodo di infezione, rimuovere il surnatante e lavare le celle con 500 μL di soluzione fisiologica.
2. Aggiungere 300 μl del reagente della sonda fluorogenica (ad es. reagente verde CellROX a 5 μM) in ciascun pozzetto.
3. Incubare le cellule per 30 minuti a 37 ºC e 5% di CO₂.
4. Celle di lavaggio 3 volte con 500 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
5. Fissare le cellule con 300 μL di formaldeide al 3,7% e lasciare riposare per 15 minuti.
   NOTA: Misurare il segnale di florescenza entro 24 ore.
6. Aggiungere 5 μl di agente colorante DAPI (ad es. DAPI ProLong Gold antifade) per la colorazione cellulare. Posizionare il vetrino coprioggetti con la superficie contenente i macrofagi a diretto contatto con l'agente colorante DAPI.
7. Analizza il segnale di florescenza mediante microscopia a fluorescenza a una lunghezza d'onda di eccitazione di 485/520 nm.
8. Calcolare la fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF) da 30 cellule per ogni vetrino coprioggetti utilizzando ImageJ.
   CTCF = Densità integrata (Area di una cellula selezionata x Fluorescenza media delle letture di fondo)

6. Analisi statistica

1. Utilizzare il test di Mann-Whitney per confrontare due gruppi con campioni non appaiati. Esegui le analisi statistiche utilizzando GraphPad Prism 7.0. Considera le differenze statisticamente significative quando p < 0,05.

La comprensione dell'interazione tra parassiti e cellule ospiti è fondamentale per chiarire i meccanismi coinvolti nella patogenesi di diverse malattie. Sebbene le cellule umane in coltura siano meno utilizzate a causa delle limitazioni della coltura cellulare rispetto alle linee cellulari, il protocollo qui presentato mostra una differenziazione robusta e riproducibile dei macrofagi umani. Questo protocollo consente l'analisi di diversi aspetti della risposta immunitaria e della biolog...

Il protocollo qui presentato per la differenziazione dei monociti umani in macrofagi seguita dall'infezione con due ceppi di L. braziliensis consente la valutazione di diversi aspetti dell'interazione parassita-cellula. Questi strumenti possono essere cruciali per chiarire le domande senza risposta sulla CL. Con l'istituzione di questo protocollo, il nostro gruppo è stato in grado di scoprire alcuni aspetti della risposta immunitaria dei macrofagi ottenuti da individui con diab...

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) con il numero di sovvenzione PET0009/2016 e dalla Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasile (CAPES) con il codice finanziario 001.