Murin Oral Mukozal Organoid Kültürlerinin Oluşturulması ve Karakterizasyonu

Yetişkin farelerin dil epitelinden türetilen oral mukozal organoid kültürlerin oluşturulması ve karakterizasyonu için bir yöntem sunuyoruz.

Ağzımızın içini kaplayan mukoza astarı, ağız mukozası, oldukça bölümlere ayrılmış bir dokudur ve bukkal mukoza, diş eti, dudaklar, damak ve dil olarak alt bölümlere ayrılabilir. En üst tabakası olan oral epitel, yaşam boyunca yetişkin kök hücreler tarafından korunur. Yetişkin epitelyal kök hücrelerin proliferasyonu ve farklılaşması, in vivo fare modellerinin yanı sıra iki boyutlu (2D) besleyici hücre tabanlı in vitro modeller kullanılarak yoğun bir şekilde incelenmiştir. Bu yöntemlerin tamamlayıcısı, yetişkin kök hücrelerin hücre dışı matris (ECM) açısından zengin bir hidrojel içine gömüldüğü ve tanımlanmış bir büyüme faktörleri kokteyli içeren bir kültür ortamı ile sağlandığı organoid teknolojisidir. Bu koşullar altında, yetişkin kök hücreler çoğalır ve kendiliğinden organoidler olarak adlandırılan üç boyutlu (3D) hücre kümeleri oluşturur. Organoid kültürler ilk olarak murin ince bağırsak epitel kök hücrelerinden kurulmuştur. Bununla birlikte, yöntem o zamandan beri diğer epitelyal kök hücre tipleri için uyarlanmıştır. Burada, murin oral mukozal organoid kültürlerinin oluşturulması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Birincil epitel hücreleri, murin dil dokusundan izole edilir, bir ECM hidrojeline gömülür ve aşağıdakileri içeren bir ortamda kültürlenir: epidermal büyüme faktörü (EGF), R-spondin ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) 10. İlk tohumlamadan sonraki 7 ila 14 gün içinde, elde edilen organoidler daha fazla genişleme ve kriyoprezervasyon için geçirilebilir. Ek olarak, 3D tam montajlı görüntüleme ve gen ekspresyon analizi yoluyla yerleşik organoid kültürlerin karakterizasyonu için stratejiler sunuyoruz. Bu protokol, oral epitelyal kök hücre davranışını ex vivo indirgemeci bir şekilde araştırmak için bir araç olarak hizmet edebilir.

Ağız mukozası, ağzımızın içini kaplayan mukoza astarıdır. Sindirim sisteminin girişi olarak işlev görür ve sindirim sürecinin başlatılmasında rol oynar ^1,2. Ek olarak, ağız mukozası vücudumuzun dış çevreye karşı bariyeri olarak işlev görür ve fiziksel, kimyasal ve biyolojik hakaretlerden koruma sağlar¹. İşlev ve histolojiye bağlı olarak, memelilerde oral mukoza üç tipe ayrılabilir: çiğneme mukozası (sert damak ve diş eti dahil), astar mukozası (yumuşak damağın yüzeyi, dilin ventral yüzeyi ve bukkal yüzey olarak işlev görür) ve özel mukoza (dilin dorsal yüzeyini kaplayan)². Tüm oral mukozal dokular iki tabakadan oluşur: yüzey tabakalı skuamöz epitel ve alttaki lamina propria¹. Oral epitelyal keratinosit, epitelin ana hücre tipidir ve aynı zamanda Langerhans hücreleri gibi epitel içi bağışıklık hücrelerinin de yeridir¹. Stromal bölme, lamina propria, fibroblastlar, endotel hücreleri, nöronal hücreler ve bağışıklık hücreleri gibi farklı hücre tiplerinden oluşur¹. Tüm tabakalı epitellerde olduğu gibi, kök ve progenitör hücreler oral epitel^1'in bazal tabakasında bulunur. Bu özel hücreler, hücre bölünmeleri yoluyla kaybedilen dokuyu yerine koyma yeteneğine sahiptir ve bu nedenle yetişkin yaşamı boyunca hücresel döngüyü besler³. Bağırsak epiteli⁴ veya cilt epidermisi⁵ gibi diğer epitellerin aksine, oral epitel tam olarak anlaşılamamıştır. Bununla birlikte, son çalışmalar, farelerde oral epitel kök ve progenitör hücreleri işaretleyen Krt14, Lrig1, Sox2, Bmi1 ve Gli1 gibi farklı genleri ortaya çıkardı ^1,6,7,8. Oral epitel, oral karsinomların kökeni olduğundan ve mukozal inflamasyon, yaralanma ve rejenerasyonda kritik bir oyuncu^{olduğundan 1}, temel hücre biyolojisinin daha iyi anlaşılması, potansiyel yeni terapötik yaklaşımlar ve ilaç keşifleri için çok önemlidir.

Hayvan modelleri, oral mukozal epitel¹ ile ilgili temel çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, oral epitelyal kök ve progenitör hücrelerin yukarıda belirtilen belirteçleri, büyük ölçüde genetik soy izleme fare modelleri ^1,6,7,8,9 kullanılarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, insan veya murin kökenli kültürlenmiş hücreleri kullanan ex vivo yaklaşımlar da yaygın olarak kullanılmaktadır¹⁰. Geleneksel olarak, bu tür hücre kültürü çalışmaları, oral skuamöz hücreli karsinomdan (OSCC'ler) türetilen hücre hatları veya (kendiliğinden veya genetik olarak) ölümsüzleştirilmiş birincil hücrelerden üretilen hücre hatları kullanılarak gerçekleştirilmiştir¹⁰. Bu 2D hücre kültürü yöntemlerinin, yetişkin homoeostazı araştırmak üzerinde kritik etkileri olan sınırlamaları vardır: (1) hücre ölümsüzleşmesine büyük derecede genetik kararsızlık, (2) farklılaşma için sınırlı kapasite, (3) besleyici hücreler için gereksinim ve (4) serum¹¹ içeren büyük ölçüde tanımlanmamış bir büyüme ortamı eşlik eder. Toplu olarak, bu altın standart in vitro yöntemler, vahşi tip genomlarını dönüştürmenin yanı sıra çoğalma ve farklılaşma kapasitelerini sınırlamadan epitelyal kök hücrelerin uzun süreli kültürlerine izin vermedi.

Organoid teknolojisi, yakın doğal epitel dokusu kültürlerini oluşturmak için bir araç olarak ortaya çıkmıştır in vitro¹¹. Sato ve ark. 2009 yılında yaptıkları çalışmada ilk epitelyal organoid kültür sistemini tanımlamışlardır¹². Yöntemleri, Wnt / β-katenin hedef geni tarafından işaretlenmiş bireysel ince bağırsak kök hücrelerinin gömülmesine dayanıyordu Lgr5¹³3D hücre dışı matris (ECM) açısından zengin bir hidrojel içine¹². Saplılık için önemli olan tanımlanmış bir büyüme faktörleri kokteyli sağlayarak, tohumlanmış yetişkin epitelyal kök hücreler kültürdeki kapasitelerine kadar çoğalabildiler¹². Sonunda, tüm ana bağırsak epitel hücre tiplerini içeren aktif olarak döngüsel kök hücrelerden hücre kümeleri oluştu¹², köken dokusuna etkili bir şekilde benzeyen¹¹. Konvansiyonel 2D kültürlerin aksine, organoid teknolojisi, murin bağırsak epitel kök hücrelerinin serumsuz ve tam olarak tanımlanmış bir ortamla besleyici olmayan koşullar altında uzun süreli bakımına izin verdi^10,11. Ek olarak, yöntem, kültürlenmiş kök hücrelerin genetik yapısını veya fenotipini önemli ölçüde değiştirmez¹¹. Ayrıca, uzun süreli kültür, hücre ölümsüzleştirmesine gerek kalmadan kök hücrenin çoğalma ve farklılaşma kapasitesini korudu¹¹. On yıldan biraz fazla bir süre içinde, bu erken epitelyal organoid kültür sistemi, kolon (kalın bağırsak) gibi diğer birçok epitel dokusundan yetişkin kök hücreleri büyütmek için değiştirildi^12,14,15, endometriyum¹⁶karaciğer^17,18Akciğer^19,20, meme bezleri²¹Yumurtalık²²pankreas^23,24, cilt epidermisi²⁵ve mide²⁶. Çoğu protokol, insanlar gibi memelilerden türetilen yetişkin epitelyal kök hücreleri kullanırken,^11,27Fare¹¹Kedi²⁸Köpek²⁹ve domuzlar³⁰, yılan zehiri bezlerinden epitelyal organoidler üretmek bile mümkün olmuştur³¹. Organoid teknolojisi, yüksek derecede çok yönlülük ile yaygın olarak kullanılan bir kök hücre kültürü yöntemi haline gelmiştir¹¹. Epitelyal organoidler büyük ölçüde genetik olarak kaldığından^32,33ve fenotipik olarak kararlıdırlar, gen düzenleme için mükemmel modellerdir^34,35Gen fonksiyonunu incelemek³⁶veya tümör oluşumu^{27,37,38,39,40}. Ek olarak, organoid kültürler farelere nakledilebilir^37,41ve konakçı-mikrop etkileşimlerini incelemek için kullanılır⁴²(patojenik enfeksiyonlar dahil^43,44,45). Ayrıca, bağışıklık hücreleri gibi mikro çevrenin hücreleri ile organoid bazlı ko-kültürler^46,47,48ve fibroblastlar^49,50 açıklanmıştır. Hastalık bağlamında, organoidler nesiller boyu canlı doku biyobankaları için kullanılmıştır^21,22,51ilaçların test edilmesinin yanı sıra²⁷etkinlik için^52,53ve toksisite⁵⁴.

Bu protokolde, murin dil epitelinden oral mukozal organoid kültürlerin oluşturulması ve sürdürülmesi için optimize edilmiş bir metodoloji tanımlanmıştır. Enzimatik sindirim⁵⁵ kullanılarak dil epitelinin izolasyonunu ve fare ve insan oral mukozasından epitel organoidlerinin türetilmesini^52,53 açıklayan önceki raporlara dayanmaktadır. Murin oral mukozal organoidleri için büyüme ortamı, kök hücre durumunu koruyan kritik faktörleri içerir. R-spondin^, Wnt / β-katenin sinyal kaskadını 5'i aktive ederken, epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) 10, MAPK / ERK yolu ve PI3K / AKT / mTOR yolu²⁵ gibi çeşitli sinyal yollarını uyaran reseptör tirozin kinazların sitokinleri ve ligandlarıdır. Organoid kültürlerin gen ve protein ekspresyon analizi ile nasıl karakterize edilebileceğini ve orijin doku ile nasıl karşılaştırılabileceğini daha ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Burada açıklanan tüm yöntemler, hayvan deneyleri ile ilgili Avrupa Birliği ve Alman mevzuatına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: Steril cerrahi aletler (ince forseps, ince makas ve neşterler) ve soğuk PBSO ile doldurulmuş Petri kapları dahil olmak üzere çalışma yerini hazırlayın. BME'yi gece boyunca çözdürün ve kullanıma kadar 4 °C'de veya buz üzerinde tutun. Hücre izolasyonuna başlamadan önce hücre kültürü plakalarını gece boyunca bir inkübatörde önceden ısıtın. Tüm malzemeler Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1 Murin oral mukozal organoid kültürünün kurulması

1. Murin dilinin diseksiyonu
   1. Fareyi kurumsal yönergelere ve ilgili ulusal ve hükümetler arası mevzuata göre ötenazi yapın.
      NOT: Bu protokol için, rahim ağzı çıkığı başın instabilitesine yol açabileceğinden, fareler CO₂ maruziyeti ile ötenazi edildi ve bu da organ toplamada zorluklara neden olabilir.
   2. Fareyi sırt üstü yatırın ve pençeleri uygun bir altlığa sabitleyerek sabitleyin.
   3. Fareyi tamamen ıslanana kadar% 70 EtOH püskürterek dezenfekte edin.
   4. Cildi makasla, önce trakea boyunca sternumdan dudağa dikey olarak ve daha sonra trakeadan her iki taraftaki klavikulaya doğru yatay olarak kesin. Her kesi yaklaşık 2 cm uzunluğundadır.
   5. Çeneyi ortaya çıkarmak için kürkü kenara çekin.
   6. Ağız boşluğunun arkasına kadar çene kaslarını kesin.
   7. Alt ve üst çeneyi iki forseps kullanarak zıt yönlerde çekerek ağız boşluğunu mümkün olduğunca açın, bu da alt çenenin yerinden çıkmasına neden olur.
   8. Dili tutmak için künt forseps kullanın ve arkadan dikey olarak keserek dilin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
   9. Dili Mg^{2 +} ve Ca^{2 +} (PBSO) içermeyen soğuk PBS'ye yerleştirin.
   10. Dorsal ve ventral dil mukozasını ayırmak için dili yatay olarak kesin.
       NOT: Dorsal dil mukozası, dilin üst tarafıdır ve ventral dil, dilin ağız tabanı ile temas halinde olan alt tarafıdır. Her iki mukoza da morfolojilerine göre ayırt edilebilir, çünkü dorsal dil mukozası gözle görülür şekilde pürüzlüdür, ventral dil mukozası ise pürüzsüz bir yüzeye sahiptir. Ventral dil, dorsal dilden daha küçük bir alanı kaplar (~ 5 x 2 mm ventral dil; ~ 8 x 3 mm dorsal dil).
   11. İsteğe bağlı: Kriyoprezervasyon için dilin bir kısmını fiksatif (örn. %4 paraformaldehit) veya optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamına sabitleyin.
   12. İsteğe bağlı: -80 °C'de RNA veya protein izolasyonu için parçaları dondurun.
2. Epitel ve lamina propria'nın ayrılması için sindirim
   1. Kullanmadan önce PBSO'da 1 mg / mL kollajenaz A ve 2 mg / mL Dispase II içeren taze bir enzimatik kokteyl hazırlayın ve 37 ° C'ye ısıtın solüsyon.
   2. 26 G'lik bir iğne kullanarak dilin arka kesik ucundan subepitel boşluğuna en az 500 μL enzimatik kokteyl enjekte edin.
   3. İğneyi, lamina propria'yı ve alttaki kası delen dokunun derinliklerine yerleştirin ve epitele dikkatlice paralel kalın.
   4. İğneyi yavaşça geri çekerken kokteyli enjekte edin.
      NOT: Renkte bir açılma ve dil dokusunun gözle görülür şekilde genişlemesi, sindirim enzimlerinin yeterli bir şekilde enjekte edildiğini doğrular. Ayrıca, epitelin altında şeffaf bir fazın indüksiyonu, uygun bir enjeksiyonu gösterir.
   5. Enjeksiyonu beş defaya kadar tekrarlayın.
   6. Dokuyu aynı enzimatik kokteyli içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   7. Numuneyi bir çalkalayıcı üzerinde (300 rpm'de) 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   8. Dokuyu PBSO içeren bir Petri kabına aktarın.
   9. Cımbızla kası ve dilin ucunu tutun ve kası dikkatlice epitelden uzaklaştırın. Dirençle karşılaşılırsa, muhtemelen arka kesme ucunda, epiteli künt cımbızla kaldırın.
   10. Ayrılan epiteli PBSO ile yıkayın ve istenen uygulamaya geçin. Organoidlerin oluşturulması için adım 1.3.1'e ilerleyin ve doku tam montaj hazırlıkları için adım 4.1.1'e geçin.
3. Primer dokudan murin oral mukozal organoidlerinin oluşturulması
   1. Epiteli yaklaşık 2 x 2 mm boyutunda küçük parçalar halinde kesin.
   2. Dokuyu 37 ° C'de PBSO'ya eklenen 1 mL% 0.125 tripsin içinde sindirin.
      NOT: Sindirim 30 dk'yı geçmemelidir.
   3. Her 10 dakikada bir çalkalayarak sindirimi düzenli olarak kontrol edin.
   4. Karışım bulanıklaştığında (doku miktarına bağlı olarak) veya hücre kümelerinin bir karışımı gözlendiğinde, 5 saniye boyunca girdap yaparak ve 10-20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek bozulmayı uzatın.
   5. 10 mL Gelişmiş DMEM/F12+++ ortamı ile tamamlayarak bir kez yıkayın.
   6. 70 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak hücre süspansiyonunu doğrudan filtreleyin.
   7. 350 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   8. Süpernatanı atın ve hücreleri saymak için 1 mL Gelişmiş DMEM / F12 +++ ortamında yeniden süspanse edin.
   9. Hücreleri bir Neubauer sayma odası veya eşdeğer bir yöntem kullanarak sayın.
   10. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.
   11. Peleti BME'de yeniden süspanse edin (katılaşmayı önlemek için BME'yi buz üzerinde tutun). Hücre sayısına bağlı olarak BME miktarını hesaplayın (yaklaşık 10.000 hücre / 40 μL BME). Ortam tamamen aspire edilemiyorsa, geri kalanını 100 μL'lik bir pipet kullanarak dikkatlice çıkarın.
       NOT: BME konsantrasyonu %70'ten az olmamalıdır, çünkü bu yetersiz katılaşmaya yol açabilir.
   12. Hücreleri, bir P100 pipeti kullanarak 10 μL'lik damlacıklar halinde önceden ısıtılmış hücre kültürü (süspansiyon) plakalarının altına yerleştirin.
   13. BME'nin katılaşması için kültür plakasını 30 dakika-1 saat boyunca inkübatöre baş aşağı yerleştirin.
   14. Gerekli miktarda murin, oral mukozal organoid besiyerini taze olarak ROCK inhibitörü ve Primocin ekleyerek hazırlayın (bakınız Malzeme Tabloları ve Tablo 1).
   15. Katılaşmadan sonra, damlacıkların ayrılmasını önlemek için kuyucukların duvarına dikkatlice pipetleyerek önceden ısıtılmış ortamı hücre damlacıklarına ekleyin.
   16. Plakaları nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C ve% 5 CO_2'de inkübe edin.
   17. Ortamı 2-3 günde bir değiştirin. ROCK inhibitörü ve Primosin, ilk iki pasaj boyunca kültür ortamında kalır.

2 Murin oral mukozal organoidlerinin pasajı, dondurularak saklanması ve çözülmesi

1. Murin oral mukozal organoid kültürlerinin pasajı
   1. Murin oral mukozal organoidleri, ilk kaplamadan 10 ila 12 gün sonra ilk kez pasaja geçebilir.
   2. Bölme için, ortamdaki BME damlacıklarını bir P1000 pipeti ile yeniden süspanse edin ve bunları 2 mL buz gibi soğuk PBSO içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
   3. Hacmi 5 mL buz gibi Gelişmiş DMEM/F12+++ ortamı ile doldurun.
   4. Organoidleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı aspire edin ve PBSO'da% 0.125 tripsin kullanarak organoidleri sindirin.
   6. Peletleri 1 mL %0.125 tripsin çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve organoidler parçalar halinde kırılana kadar süspansiyonu 37 °C'de inkübe edin. Sindirimi her 2 dakikada bir kontrol edin.
   7. Bir P1000 pipeti kullanarak 20-30 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre süspansiyonunu iyice yeniden süspanse edin ve bir P200 pipeti ile sert yeniden süspansiyonu tekrarlayın.
   8. Hücreleri 10 mL Gelişmiş DMEM / F12 + ++ ortamı ile yıkayın.
   9. İsteğe bağlı: Homojen bir hücre süspansiyonu oluşturmak için 70 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak hücre süspansiyonunu doğrudan filtreleyin.
   10. Hücre süspansiyonunu 350 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
   11. Süpernatanı aspire edin ve peleti BME'de yeniden süspanse edin ve 1.3.8-1.3.17 adımlarında açıklandığı gibi organoidlerle devam edin.
2. Murin oral mukozal organoid kültürlerinin dondurularak saklanması ve çözülmesi
   1. Kriyoprezervasyon için, murin oral mukozal organoidlerinin geçtikten sonra 3-5 gün büyümesine izin verin.
   2. Organoidleri 2.1.2-2.1.4 adımlarında açıklandığı gibi kültür plakalarından ayırın.
   3. Santrifüjlemeden sonra, organoidleri 1 mL dondurma ortamında (% 10 FCS ve% 10 DMSO içeren Gelişmiş DMEM / F12 +++ ortamı) yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 2 mL kriyoviyallere aktarın.
   4. Hücreleri -80 °C'de 24 saate kadar istenen dondurma kaplarına yerleştirin. Uzun süreli depolama için, hücreleri -120 °C'nin altında, örneğin bir sıvı nitrojen tankında tutun.
   5. Dondurularak saklanmış hücreleri 37 °C'de çözün ve hücre süspansiyonunu hızlı bir şekilde 9 mL önceden ısıtılmış Gelişmiş DMEM/F12+++ ortamı içeren konik bir tüpe aktarın.
   6. Hücre süspansiyonunu 350 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   7. Süpernatanı atın ve 1.3.8-1.3.17 adımlarında açıklandığı gibi organoidlerle devam edin.

3 Murin, oral mukozal doku ve organoidlerin gen ekspresyon analizi

1. Murin, oral mukozal organoidler ve doğal dokudan RNA ekstraksiyonu
   1. Murin oral mukozal organoidlerini adım 2.1.2-2.1.4'te açıklandığı gibi hasat edin.
   2. Süpernatanı atın ve organoidleri soğuk PBSO'da yıkayın.
   3. Organoidleri 300 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
   4. RNA'yı doğal dokudan izole etmek için, ayrılmış epiteli kullanın (bkz. adım 1.2.10).
   5. Dokuyu 2 mm x 2 mm'lik küçük parçalar halinde kesin.
   6. RNA izolasyonu için yerleşik bir yöntem veya kit kullanın: Organoidleri veya doku parçalarını sırasıyla 350 veya 700 μL lizis tamponunda yeniden süspanse edin.
   7. Sert bir şekilde girdaplı organoidleri en az 10 saniye boyunca girdaplayın ve dokuyu en az 30 saniye boyunca parçalayın.
   8. Çözeltiyi en az 2 saat -80 °C'de yerleştirin.
   9. Hücre lizatını buz üzerinde çözün ve üreticinin talimatlarına göre RNA izolasyonuna devam edin.
2. Ters transkripsiyon reaksiyonu ile cDNA sentezi
   1. RNA konsantrasyonunu ölçün ve 0.1-1 μg'lık toplam RNA girişi için hacmi hesaplayın.
   2. cDNA sentezi için, üreticinin talimatlarını izleyerek bir cDNA Sentez Kiti kullanın. Bu deney için aşağıdaki formülasyon kullanıldı: 4 μL 5x reaksiyon karışımı, 1 μL Ters Transkriptaz, x μL 0.1-1 μg toplam RNA ve x μL nihai hacmin 20 μL'sine kadar nükleaz içermeyen su.
   3. Aşağıdaki programla üç aşamalı bir döngüleyici programında ters transkripsiyon gerçekleştirin: 25 ° C'de 5 dakika, 42 ° C'de 30 dakika ve 85 'de 5 dakika.
   4. cDNA'yı -20 °C'de saklayın.
3. Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile gen ekspresyonu analizi
   1. Kantitatif gerçek zamanlı PCR için, tüm reaksiyonları teknik kopyalar halinde gerçekleştirin.
   2. 5 μL qPCR Supermix, 1 μL ters astar (400 nM), 1 μL ileri primer (400 nM), 1 μL cDNA (10-20 ng/kuyu) ve 2 μL nükleaz içermeyen su karışımı hazırlayın.
   3. Amplifikasyon için aşağıdaki gibi standart ayarları kullanın: polimeraz aktivasyonu ve DNA denatürasyonu 95 °C'de 30 s, 95 °C'de 5-10 sn denatürasyon, tavlama/uzatma ve 60 °C'de 60 sn boyunca 40 döngü boyunca plaka okuma. 65-95 °C'de 0,5 °C'lik artışlarla 2-5 s/adımda erime eğrisi analizi yapın (veya cihazın varsayılan ayarlarını kullanın).
   4. ΔCt veya ΔΔCt yöntemleri⁵⁶ gibi istenen yöntemleri kullanarak veya verilen talimatları izleyerek termodöngüleyici üreticisi tarafından sağlanan bir analiz yazılımını kullanarak verileri analiz edin.

4 Murin, oral mukozal doku ve organoidlerin protein ekspresyon analizi

NOT: Dil epitelinin tam montajlı boyanması 24 oyuklu bir plakada gerçekleştirildi ve doku forseps ile her adımda kuyudan kuyuya aktarıldı.

1. Murin oral mukozal doku ve organoid kültürlerinin fiksasyonu
   1. Doku bütünü boyama için adım 1.2.10'dan devam edin ve adım 4.1.5 ile devam edin.
   2. Organoid boyama için, adım 2.1.2'de açıklandığı gibi organoidleri hasat edin ve adım 4.1.3 ile devam edin.
   3. Hücre süspansiyonunu 10 mL PBSO ile doldurun.
   4. Hücre süspansiyonunu 350 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
   5. Epitel veya organoidleri oda sıcaklığında (21 °C) 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
   6. Numuneleri PBSO'da bir kez yıkayın. Organoidleri 350 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
2. Murin, oral mukozal doku ve organoid kültürlerin tam mount boyanması
   1. Numuneleri oda sıcaklığında% 0.2 Triton X-100 çözeltisi içinde 20 dakika inkübe ederek epitopların maskesini çıkarın.
   2. Numuneleri bloke edici çözeltiye aktarın (PBSO'da% 5 eşek serumu) ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
   3. Antikorları bloke edici çözelti içinde seyreltin ve numuneleri gece boyunca 4 ° C'de antikor çözeltisi içinde inkübe edin.
   4. Hücreleri veya dokuyu ddH2O'da %0.1 Tween-20 ve %1 PBSO içeren yıkama tamponu ile üç kez (her biri 5 dakika) yıkayın.
   5. İkincil antikorları PBSO'da 1:400 oranında seyreltin.
   6. Numuneleri oda sıcaklığında 3 saat boyunca ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin.
   7. Yıkama adımı 4.2.4'ü tekrarlayın. Doku örnekleri için adım 4.2.8 ile devam edin. Organoid numuneler için adım 4.2.9 ile devam edin.
   8. Epiteli, bazal tarafı (lamina propria'ya bağlı olan taraf) yukarı bakacak şekilde bir slayt üzerine yerleştirin. Epiteli DAPI ve bir kapak kızağı ile sulu bir montajcıya monte edin. Adım 4.2.11 ile devam edin.
   9. Organoid numuneler için, lekeli organoidleri oda sıcaklığında katılaşan herhangi bir uygun jel matrisinde yeniden süspanse edin.
   10. Damlacıkları 96 oyuklu bir cam alt plakaya (5 μL/kuyucuk) hızlı bir şekilde pipetleyin. Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve jel matrisinin 15 dakika katılaşmasına izin verin. Organoidleri, kuyucuk başına 100 μL ekleyerek DAPI ile sulu bir mountant'a monte edin.
   11. Lekeli numuneleri 4 °C'de ışıktan koruyarak görüntü analizine kadar saklayın.

Bu protokol, dil epitelinin enzimatik bir kokteyl kullanılarak alttaki lamina propria ve kastan ayrılmasını tanımlar (Şekil 1). Ayrılan epitel ayrıca organoid üretimi için kullanılabilir ve farklı gen ve protein analizleri için hasat edilebilir. Benzer şekilde, sindirilmiş lamina propria ve kas tabakası tercih edilen prosedürler için kullanılabilir.

Organoid kültürler için, dil epiteli, tripsin çözeltisi ku...

Doku sindirimi
Kollajenaz sindirimi, epitelin alttaki lamina propria ve kas dokusundan ayrılmasına yardımcı olur. Bu adım, birincil dokunun daha sonra oluşturulan oral mukozal organoidlerle daha iyi karşılaştırılmasını sağlar. Enzimlerle aşırı sindirim, yetişkin epitelyal kök hücrelerin organoid oluşturma kapasitesini etkilediğinden, kollajenaz inkübasyonunun 1 saatten fazla ve tripsin sindiriminin 30 dakikadan fazla yapılmamasını tavsiye ede...

K.K., organoid teknolojisi ile ilgili bekleyen bir patentin mucidi olarak adlandırıldı.

Yazarlar yardımları için Sabine Kranz'a teşekkür eder. Bu çalışmayı desteklediği için IZKF Würzburg'un Konfokal Mikroskopi ve Akış Sitometrisi Tabanlı Hücre Sınıflandırması Çekirdek Birimine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Alman Kanser Yardımı'ndan (IZKF/MSNZ Würzburg aracılığıyla K.K.'ye) bir hibe ile finanse edilmiştir.