Generazione e caratterizzazione di colture di organoidi murini della mucosa orale

Presentiamo un metodo per la generazione e la caratterizzazione di colture di organoidi della mucosa orale derivate dall'epitelio della lingua di topi adulti.

Il rivestimento mucoso che ricopre l'interno della nostra bocca, la mucosa orale, è un tessuto altamente compartimentalizzato e può essere suddiviso in mucosa buccale, gengiva, labbra, palato e lingua. Il suo strato superiore, l'epitelio orale, è mantenuto dalle cellule staminali adulte per tutta la vita. La proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali epiteliali adulte sono state studiate intensamente utilizzando modelli murini in vivo e modelli in vitro bidimensionali (2D) basati su cellule feeder. Complementare a questi metodi è la tecnologia degli organoidi, in cui le cellule staminali adulte sono incorporate in un idrogel ricco di matrice extracellulare (ECM) e dotate di un terreno di coltura contenente un cocktail definito di fattori di crescita. In queste condizioni, le cellule staminali adulte proliferano e formano spontaneamente cluster cellulari tridimensionali (3D), i cosiddetti organoidi. Le colture di organoidi sono state inizialmente stabilite da cellule staminali epiteliali dell'intestino tenue murino. Tuttavia, da allora il metodo è stato adattato per altri tipi di cellule staminali epiteliali. Qui, descriviamo un protocollo per la generazione e la caratterizzazione di colture di organoidi murini della mucosa orale. Le cellule epiteliali primarie vengono isolate dal tessuto della lingua murina, incorporate in un idrogel ECM e coltivate in un terreno contenente: fattore di crescita epidermico (EGF), R-spondina e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) 10. Entro 7-14 giorni dalla semina iniziale, gli organoidi risultanti possono essere fatti passare per un'ulteriore espansione e crioconservazione. Presentiamo inoltre strategie per la caratterizzazione di colture di organoidi consolidate tramite imaging 3D a montaggio intero e analisi dell'espressione genica. Questo protocollo può servire come strumento per studiare il comportamento delle cellule staminali epiteliali orali ex vivo in modo riduzionista.

La mucosa orale è il rivestimento mucoso che ricopre l'interno della nostra bocca. Funziona come l'ingresso del tratto alimentare ed è coinvolto nell'avvio del processo digestivo ^1,2. Inoltre, la mucosa orale funge da barriera del nostro corpo verso l'ambiente esterno, fornendo protezione dagli insulti fisici, chimici e biologici¹. In base alla funzione e all'istologia, la mucosa orale nei mammiferi può essere suddivisa in tre tipi: mucosa masticatoria (compresi il palato duro e la gengiva), la mucosa di rivestimento (che funge da superficie del palato molle, superficie ventrale della lingua e superficie buccale) e mucosa specializzata (che copre la superficie dorsale della lingua)². Tutti i tessuti della mucosa orale sono costituiti da due strati: l'epitelio squamoso stratificato superficiale e la sottostante lamina propria¹. Il cheratinocita epiteliale orale è il principale tipo di cellula dell'epitelio, che è anche la posizione delle cellule immunitarie intraepiteliali come le cellule di Langerhans¹. Il compartimento stromale, la lamina propria, comprende i diversi tipi di cellule come i fibroblasti, le cellule endoteliali, le cellule neuronali e le cellule immunitarie¹. Come in tutti gli epiteli stratificati, le cellule staminali e progenitrici risiedono nello strato basale dell'epitelio orale¹. Queste cellule specializzate hanno la capacità di sostituire il tessuto perso attraverso le divisioni cellulari e, quindi, di alimentare il ricambio cellulare per tutta la vita adulta³. A differenza di altri epiteli come l'epitelio intestinale⁴ o l'epidermide cutanea⁵, gli epiteli orali rimangono poco conosciuti. Tuttavia, studi recenti hanno scoperto diversi geni come Krt14, Lrig1, Sox2, Bmi1 e Gli1 che marcano le cellule staminali epiteliali orali e le cellule progenitrici nei topi 1,6,7,8. Poiché l'epitelio orale è l'origine dei carcinomi orali e un attore critico nell'infiammazione, nella ferita e nella rigenerazione della mucosa¹, una migliore comprensione della sua biologia cellulare di base è fondamentale per potenziali nuovi approcci terapeutici e scoperte di farmaci.

I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati per gli studi di base sull'epitelio della mucosa orale¹. Ad esempio, i suddetti marcatori di cellule staminali epiteliali orali e cellule progenitrici sono stati in gran parte definiti utilizzando modelli murini di tracciamento del lignaggio genetico 1,6,7,8,9. Tuttavia, sono stati ampiamente utilizzati anche approcci ex vivo che utilizzano cellule in coltura di origine umana o murina¹⁰. Convenzionalmente, tale lavoro di coltura cellulare è stato eseguito utilizzando linee cellulari derivate da carcinoma orale a cellule squamose (OSCC) o linee cellulari generate da cellule primarie immortalizzate (spontaneamente o geneticamente)¹⁰. Questi metodi di coltura cellulare 2D hanno limitazioni con implicazioni critiche nello studio dell'omeostasi adulta: (1) l'immortalizzazione cellulare è accompagnata da un alto grado di instabilità genetica, (2) limitata capacità di differenziare, (3) necessità di cellule alimentatrici e (4) un mezzo di crescita in gran parte indefinito contenente siero¹¹. Collettivamente, questi metodi gold standard in vitro non hanno permesso colture a lungo termine di cellule staminali epiteliali senza limitare la loro capacità di proliferare e differenziarsi, nonché di trasformare il loro genoma wild-type.

La tecnologia degli organoidi è emersa come strumento per stabilire colture di tessuto epiteliale quasi nativo in vitro¹¹. Nel loro studio del 2009, Sato et al. hanno descritto il primo sistema di coltura di organoidi epiteliali¹². Il loro metodo si basava sull'incorporazione di singole cellule staminali intestinali tenue contrassegnate dal gene bersaglio Wnt/β-catenina Lgr5¹³in un idrogel 3D ricco di matrice extracellulare (ECM)¹². Fornendo un cocktail definito di fattori di crescita importanti per la staminalità, le cellule staminali epiteliali adulte seminate sono state in grado di proliferare fino alla loro capacità in coltura¹². Alla fine, si sono formati gruppi di cellule staminali a ciclo attivo contenenti tutti i principali tipi di cellule epiteliali intestinali¹², che assomiglia di fatto al tessuto di origine¹¹. A differenza delle colture 2D convenzionali, la tecnologia degli organoidi ha consentito il mantenimento a lungo termine delle cellule staminali epiteliali intestinali munine in condizioni prive di alimentazione con un terreno privo di siero e completamente definito^10,11. Inoltre, il metodo non altera in modo significativo la composizione genetica o il fenotipo delle cellule staminali coltivate¹¹. Inoltre, la coltura a lungo termine ha mantenuto la capacità della cellula staminale di proliferare e differenziarsi senza la necessità di immortalizzazione cellulare¹¹. Nel giro di poco più di un decennio, questo sistema di coltura di organoidi epiteliali è stato modificato per far crescere cellule staminali adulte da molti altri tessuti epiteliali come il colon (intestino crasso)^12,14,15endometrio¹⁶fegato^17,18Polmoni^19,20, ghiandole mammarie²¹ovaie²²pancreas^23,24, epidermide cutanea²⁵e stomaco²⁶. Mentre la maggior parte dei protocolli utilizzava cellule staminali epiteliali adulte derivate da mammiferi come gli esseri umani^11,27topi¹¹gatti²⁸cani²⁹e suini³⁰, è stato persino possibile generare organoidi epiteliali dalle ghiandole velenifere dei serpenti³¹. La tecnologia degli organoidi è diventata un metodo di coltura di cellule staminali ampiamente utilizzato con un alto grado di versatilit๹. Poiché gli organoidi epiteliali rimangono in gran parte geneticamente^32,33e fenotipicamente stabili, sono ottimi modelli per l'editing genetico^34,35per studiare la funzione genica³⁶o tumorigenesi^{27,37,38,39,40}. Inoltre, le colture di organoidi possono essere trapiantate nei topi^37,41e vengono utilizzati per studiare le interazioni ospite-microbo⁴²(comprese le infezioni patogene^43,44,45). Inoltre, co-colture basate su organoidi con cellule del microambiente come le cellule immunitarie^46,47,48e fibroblasti^49,50 sono stati descritti. Nel contesto delle malattie, gli organoidi sono stati utilizzati per generazioni di biobanche di tessuti viventi^21,22,51oltre a testare i farmaci²⁷per l'efficacia^52,53e tossicità⁵⁴.

In questo protocollo, descriviamo una metodologia ottimizzata per la creazione e il mantenimento di colture di organoidi della mucosa orale dall'epitelio della lingua murina. Si basa su precedenti studi che descrivono l'isolamento dell'epitelio della lingua mediante digestione enzimatica⁵⁵ e la derivazione di organoidi epiteliali dalla mucosa orale di topo e umana^52,53. Il terreno di crescita per gli organoidi murini della mucosa orale contiene fattori critici che mantengono lo stato delle cellule staminali. La R-spondina attiva la cascata di segnalazione Wnt/β-catenina⁵, mentre il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) 10 sono citochine e ligandi delle tirosin-chinasi recettoriali che stimolano diverse vie di segnalazione come la via MAPK/ERK e la via PI3K/AKT/mTOR²⁵. Descriviamo inoltre in dettaglio come le colture di organoidi possono essere caratterizzate mediante analisi dell'espressione genica e proteica e confrontate con il tessuto di origine.

Tutti i metodi qui descritti sono stati eseguiti in conformità con la legislazione dell'Unione Europea e tedesca sulla sperimentazione animale.

NOTA: Preparare il posto di lavoro, compresi gli strumenti chirurgici sterili (pinze, forbici sottili e bisturi) e le piastre di Petri riempite con PBSO freddo. Scongelare il BME durante la notte e mantenerlo a 4 °C o in ghiaccio fino al momento dell'uso. Preriscaldare le piastre di coltura cellulare in un incubatore per una notte prima di iniziare l'isolamento cellulare. Tutti i materiali sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1 Istituzione di colture di organoidi murini della mucosa orale

1. Dissezione della lingua murina
   1. Eutanasia del topo secondo le linee guida istituzionali e le rispettive legislazioni nazionali e intergovernative.
      NOTA: Per questo protocollo, i topi sono stati soppressi mediante esposizione a CO₂, poiché la lussazione cervicale può portare a instabilità della testa, con conseguente difficoltà con il prelievo di organi.
   2. Appoggia il mouse sulla schiena e fissalo fissando le zampe a un sottofondo adatto.
   3. Disinfettare il topo spruzzandolo con il 70% di EtOH fino a quando non è completamente bagnato.
   4. Tagliare la pelle con le forbici, prima verticalmente lungo la trachea dallo sterno al labbro, e poi orizzontalmente dalla trachea verso la clavicola su entrambi i lati. Ogni incisione è lunga circa 2 cm.
   5. Tirare da parte la pelliccia per scoprire la mascella.
   6. Tagliare i muscoli della mascella fino alla parte posteriore della cavità orale.
   7. Aprire il più possibile la cavità orale tirando la mascella inferiore e superiore in direzioni opposte utilizzando due pinze, il che provoca la lussazione della mascella inferiore.
   8. Usa una pinza smussata per afferrare la lingua e rimuovere la maggior parte possibile della lingua tagliando verticalmente nella parte posteriore.
   9. Mettere la lingua in PBS freddo privo di Mg²⁺ e Ca²⁺ (PBSO).
   10. Tagliare la lingua orizzontalmente per separare la mucosa della lingua dorsale e ventrale.
       NOTA: La mucosa della lingua dorsale è il lato superiore della lingua e la lingua ventrale è il lato inferiore della lingua che è a contatto con il pavimento orale. Entrambe le mucose possono essere discriminate dalla loro morfologia, poiché la mucosa della lingua dorsale è visibilmente irruvida, mentre la mucosa della lingua ventrale ha una superficie liscia. La lingua ventrale copre un'area più piccola rispetto alla lingua dorsale (~ 5 x 2 mm lingua ventrale; ~ 8 x 3 mm lingua dorsale).
   11. Opzionale: fissare una parte della lingua in un mezzo fissativo (ad es. 4% di paraformaldeide) o in un mezzo di temperatura di taglio ottimale (OCT) per la crioconservazione.
   12. Opzionale: congelamento a scatto di frammenti per l'isolamento di RNA o proteine a -80 °C.
2. Digestione per la separazione dell'epitelio e della lamina propria
   1. Preparare un cocktail enzimatico fresco contenente 1 mg/mL di collagenasi A e 2 mg/mL di Dispasi II in PBSO e una soluzione di riscaldamento a 37 °C prima dell'uso.
   2. Iniettare almeno 500 μL del cocktail enzimatico nello spazio subepiteliale dall'estremità posteriore tagliata della lingua utilizzando un ago da 26 G.
   3. Inserire l'ago in profondità nel tessuto perforando la lamina propria e il muscolo sottostante rimanendo accuratamente paralleli all'epitelio.
   4. Iniettare il cocktail ritraendo lentamente l'ago.
      NOTA: Uno schiarimento del colore e un'espansione visibile del tessuto della lingua confermano una sufficiente iniezione degli enzimi della digestione. Inoltre, l'induzione di una fase trasparente sotto l'epitelio indica una corretta iniezione.
   5. Ripetere l'iniezione fino a cinque volte.
   6. Trasferire il fazzoletto in una provetta da microcentrifuga da 2 ml contenente lo stesso cocktail enzimatico.
   7. Incubare il campione per 1 ora a 37 °C su un agitatore (a 300 giri/min).
   8. Trasferire il fazzoletto in una capsula di Petri contenente PBSO.
   9. Afferra il muscolo e la punta della lingua con una pinzetta ed estrai con cautela il muscolo dall'epitelio. Se si incontra resistenza, probabilmente all'estremità posteriore del taglio, sollevare l'epitelio con una pinzetta smussata.
   10. Lavare l'epitelio separato con PBSO e procedere all'applicazione desiderata. Per la determinazione degli organoidi procedere al passaggio 1.3.1 e per le preparazioni tissutali a montaggio intero procedere al punto 4.1.1.
3. Determinazione di organoidi murini della mucosa orale da tessuto primario
   1. Tagliare l'epitelio in piccoli pezzi di circa 2 x 2 mm.
   2. Digerire il tessuto in 1 mL di tripsina allo 0,125% aggiunta a PBSO a 37 °C.
      NOTA: La digestione non deve superare i 30 minuti.
   3. Controllare regolarmente la digestione agitando ogni 10 minuti.
   4. Quando la miscela diventa torbida (a seconda della quantità di tessuto) o quando si osserva una miscela di grumi cellulari, estendere la disgregazione agitando per 5 s e pipettando su e giù per 10-20 volte.
   5. Lavare una volta rabboccando con 10 ml di terreno Advanced DMEM/F12+++.
   6. Filtrare direttamente la sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare da 70 μm.
   7. Centrifugare a 350 x g per 5 min a 4 °C.
   8. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno Advanced DMEM/F12+++ per il conteggio.
   9. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Neubauer o un metodo equivalente.
   10. Centrifugare a 350 x g per 5 min a 4 °C e aspirare il surnatante.
   11. Risospendere il pellet in BME (mantenere BME sul ghiaccio per evitare la solidificazione). Calcolare la quantità di BME, a seconda del numero di cellule (circa 10.000 cellule/40 μL di BME). Se il fluido non può essere aspirato completamente, rimuoverne con cura il resto utilizzando una pipetta da 100 μl.
       NOTA: La concentrazione di BME non deve essere inferiore al 70%, in quanto ciò può portare a una solidificazione insufficiente.
   12. Piastra le cellule sul fondo delle piastre di coltura cellulare preriscaldate (sospensione) in goccioline da 10 μl utilizzando una pipetta P100.
   13. Posizionare la piastra di coltura capovolta nell'incubatore per 30 min-1 h per far solidificare il BME.
   14. Preparare la quantità necessaria di terreno organoide della mucosa orale murina aggiungendo di fresco l'inibitore ROCK e Primocin (vedere Tabelle dei materiali e Tabella 1).
   15. Dopo la solidificazione, aggiungere il terreno preriscaldato alle goccioline cellulari pipettando accuratamente contro la parete dei pozzetti per evitare il distacco delle goccioline.
   16. Incubare le piastre in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO₂.
   17. Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni. L'inibitore ROCK e la primocina rimangono nel terreno di coltura per i primi due passaggi.

2 Passaging, crioconservazione e scongelamento di organoidi murini della mucosa orale

1. Passaging di colture di organoidi murini della mucosa orale
   1. Gli organoidi murini della mucosa orale possono essere fatti passare per la prima volta tra i 10 e i 12 giorni dopo la prima piastra.
   2. Per la scissione, risospendere le goccioline di BME nel terreno con una pipetta P1000 e trasferirle in una provetta conica da 15 mL contenente 2 mL di PBSO ghiacciato.
   3. Rabboccare il volume con 5 ml di terreno Advanced DMEM/F12+++ ghiacciato.
   4. Centrifugare gli organoidi a 300 x g per 5 min a 4 °C.
   5. Aspirare il surnatante e digerire gli organoidi utilizzando lo 0,125% di tripsina in PBSO.
   6. Risospendere il pellet in 1 mL di soluzione di tripsina allo 0,125% e incubare la sospensione a 37 °C fino a quando gli organoidi non si rompono in pezzi. Controllare la digestione ogni 2 minuti.
   7. Risospendere accuratamente la sospensione cellulare pipettando su e giù 20-30 volte con una pipetta P1000 e ripetere la risospensione brusca con una pipetta P200.
   8. Lavare le celle con 10 mL di terreno Advanced DMEM/F12+++.
   9. Opzionale: filtrare direttamente la sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare da 70 μm per generare una sospensione cellulare omogenea.
   10. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C.
   11. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in BME e procedere con gli organoidi come descritto nei passaggi 1.3.8-1.3.17.
2. Crioconservazione e scongelamento di colture di organoidi murini della mucosa orale
   1. Per la crioconservazione, lasciare crescere gli organoidi murini della mucosa orale per 3-5 giorni dopo il passaggio.
   2. Staccare gli organoidi dalle piastre di coltura come descritto nei passaggi 2.1.2-2.1.4.
   3. Dopo la centrifugazione, risospendere gli organoidi in 1 mL di terreno di congelamento (Advanced DMEM/F12+++ contenente il 10% di FCS e il 10% di DMSO) e trasferire la sospensione cellulare in 2 mL di crioviali.
   4. Mettere le celle nei contenitori di congelamento desiderati a -80 °C per un massimo di 24 ore. Per lo stoccaggio a lungo termine, mantenere le celle al di sotto di -120 °C, ad esempio in un serbatoio di azoto liquido.
   5. Scongelare le cellule crioconservate a 37 °C e trasferire rapidamente la sospensione cellulare in una provetta conica contenente 9 mL di terreno Advanced DMEM/F12+++ preriscaldato.
   6. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g e 4 °C per 5 minuti.
   7. Scartare il surnatante e procedere con gli organoidi come descritto nei passaggi 1.3.8-1.3.17.

3 Analisi dell'espressione genica di mucole orali murine, tessuti e organoidi

1. Estrazione di RNA da organoidi murini della mucosa orale e tessuto nativo
   1. Raccogliere gli organoidi murini della mucosa orale come descritto nei passaggi 2.1.2-2.1.4.
   2. Scartare il surnatante e lavare gli organoidi in PBSO freddo.
   3. Centrifugare gli organoidi a 300 x g e 4 °C per 5 minuti e scartare il surnatante.
   4. Per isolare l'RNA dal tessuto nativo, utilizzare l'epitelio separato (vedere il passaggio 1.2.10).
   5. Tagliare il fazzoletto in piccoli pezzi di 2 mm x 2 mm.
   6. Per l'isolamento dell'RNA, utilizzare un metodo o un kit consolidato: risospendere organoidi o pezzi di tessuto, rispettivamente, in tampone di lisi da 350 o 700 μl.
   7. Lentissimo vortex lyed organoidi per almeno 10 s e lisa del tessuto per almeno 30 s.
   8. Porre la soluzione a -80 °C per almeno 2 ore.
   9. Scongelare il lisato cellulare su ghiaccio e procedere con l'isolamento dell'RNA secondo le istruzioni del produttore.
2. Sintesi del cDNA mediante reazione di trascrizione inversa
   1. Misurare la concentrazione di RNA e calcolare il volume per un input totale di RNA di 0,1-1 μg.
   2. Per la sintesi del cDNA, utilizzare un kit di sintesi del cDNA seguendo le istruzioni del produttore. Per questo esperimento è stata utilizzata la seguente formulazione: 4 μL di miscela di reazione 5x, 1 μL di trascrittasi inversa, x μL di 0,1-1 μg di RNA totale e x μL di acqua priva di nucleasi fino a 20 μL del volume finale.
   3. Eseguire la trascrizione inversa in un programma di ciclatore in tre fasi con il seguente programma: 25 °C per 5 min, 42 °C per 30 min e 85 °C per 5 min.
   4. Conservare il cDNA a -20 °C.
3. Analisi dell'espressione genica mediante PCR quantitativa in tempo reale
   1. Per la PCR quantitativa in tempo reale, eseguire tutte le reazioni in duplicati tecnici.
   2. Preparare una miscela di 5 μl di qPCR Supermix, 1 μl di reverse primer (400 nM), 1 μl di forward primer (400 nM), 1 μl di cDNA (10-20 ng/pozzetto) e 2 μl di acqua priva di nucleasi.
   3. Per l'amplificazione, utilizzare le impostazioni standard come segue: attivazione della polimerasi e denaturazione del DNA a 95 °C per 30 s, denaturazione a 95 °C per 5-10 s, ricottura/estensione e lettura della piastra a 60 °C per 60 s per 40 cicli. Eseguire l'analisi della curva di fusione a 65-95 °C con incrementi di 0,5 °C a 2-5 s/passo (oppure utilizzare le impostazioni predefinite dello strumento).
   4. Analizzare i dati utilizzando i metodi desiderati come i metodi ΔCt o ΔΔCt⁵⁶ o utilizzando un software di analisi fornito dal produttore del termociclatore seguendo le istruzioni fornite.

4 Analisi dell'espressione proteica del tessuto murico orale e degli organoidi

NOTA: La colorazione dell'intero montaggio dell'epitelio della lingua è stata eseguita in una piastra a 24 pozzetti, trasferendo il tessuto con una pinza da pozzetto a pozzetto in ogni fase.

1. Fissazione di tessuti muradici orali murini e colture di organoidi
   1. Per la colorazione su tessuto a montaggio intero, procedere dal passaggio 1.2.10 e continuare con il passaggio 4.1.5.
   2. Per la colorazione degli organoidi, raccogliere gli organoidi come descritto nel passaggio 2.1.2 e continuare con il passaggio 4.1.3.
   3. Rabboccare la sospensione cellulare con 10 mL di PBSO.
   4. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
   5. Fissare l'epitelio o gli organoidi in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente (21 °C).
   6. Lavare i campioni una volta in PBSO. Centrifugare gli organoidi a 350 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
2. Colorazione a montaggio intero di tessuti muradici orali murini e colture di organoidi
   1. Smascherare gli epitopi incubando i campioni in una soluzione di Triton X-100 allo 0,2% per 20 minuti a temperatura ambiente.
   2. Trasferire i campioni nella soluzione bloccante (siero d'asina al 5% in PBSO) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
   3. Diluire gli anticorpi in soluzione bloccante e incubare i campioni in soluzione anticorpale per una notte a 4 °C.
   4. Lavare le cellule o il tessuto tre volte (5 minuti ciascuna) con un tampone di lavaggio contenente lo 0,1% di Tween-20 e l'1% di PBSO in ddH2O.
   5. Diluire gli anticorpi secondari 1:400 in PBSO.
   6. Incubare i campioni in una soluzione di anticorpi secondari per 3 ore a temperatura ambiente.
   7. Ripetere il passaggio di lavaggio 4.2.4. Per i campioni di tessuto, procedere con il passaggio 4.2.8. Per i campioni di organoidi, procedere con il passaggio 4.2.9.
   8. Posizionare l'epitelio su un vetrino con il lato basale (lato che era attaccato alla lamina propria) rivolto verso l'alto. Montare l'epitelio in un montante acquoso con DAPI e un vetrino coprioggetti. Procedere con il passaggio 4.2.11.
   9. Per i campioni di organoidi, risospendere gli organoidi colorati in qualsiasi matrice di gel adatta che solidifichi a temperatura ambiente.
   10. Pipettare rapidamente le goccioline in una piastra di vetro con fondo a 96 pozzetti (5 μl/pozzetto). Posizionare la piastra sul ghiaccio e lasciare solidificare la matrice di gel per 15 minuti. Montare gli organoidi in un montante acquoso con DAPI aggiungendo 100 μL per pozzetto.
   11. Conservare i campioni colorati a 4 °C al riparo dalla luce fino all'analisi dell'immagine.

Questo protocollo descrive la separazione dell'epitelio della lingua dalla sottostante lamina propria e dal muscolo utilizzando un cocktail enzimatico (Figura 1). L'epitelio separato può essere ulteriormente utilizzato per la generazione di organoidi e raccolto per diversi tipi di analisi genetiche e proteiche. Allo stesso modo, lo strato digerito della lamina propria e del muscolo può essere utilizzato per le procedure di scelta.

Digestione dei tessuti
La digestione della collagenasi aiuta a separare l'epitelio dalla sottostante lamina propria e dal tessuto muscolare. Questo passaggio consente un migliore confronto del tessuto primario con gli organoidi della mucosa orale successivamente generati. Poiché la sovradigestione con enzimi influisce sulla capacità di formazione di organoidi delle cellule staminali epiteliali adulte, si consiglia di eseguire l'incubazione della collagenasi per non ...

K.K. è nominato inventore di un brevetto in attesa di brevetto relativo alla tecnologia degli organoidi.

Gli autori ringraziano Sabine Kranz per l'assistenza. Desideriamo ringraziare l'unità centrale per la microscopia confocale e il cell sorting basato sulla citometria a flusso dell'IZKF Würzburg per aver supportato questo studio. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del German Cancer Aid (tramite IZKF/MSNZ Würzburg a K.K.).