マウス口腔粘膜オルガノイド培養物の作製と特性評価

我々は、成体マウスの舌上皮に由来する口腔粘膜オルガノイド培養物の作製と特性評価の方法を提示する。

私たちの口の中を覆う粘膜である口腔粘膜は、高度に区画化された組織であり、頬粘膜、歯肉、唇、口蓋、舌に細分化することができます。その最上層である口腔上皮は、生涯を通じて成体幹細胞によって維持されます。成体上皮幹細胞の増殖と分化は、 in vivo マウスモデルおよびin vitro ベースの二次元(2D)フィーダーセルモデルを用いて集中的に研究されています。これらの方法を補完するのがオルガノイド技術で、成体幹細胞を細胞外マトリックス(ECM)に富むハイドロゲルに埋め込み、成長因子の明確なカクテルを含む培地を提供します。これらの条件下では、成体幹細胞が増殖し、自発的に三次元(3D)細胞クラスター、いわゆるオルガノイドを形成します。オルガノイド培養は、最初にマウスの小腸上皮幹細胞から確立されました。しかし、その後、この方法は他の上皮幹細胞タイプにも適応されています。ここでは、マウス口腔粘膜オルガノイド培養物の作製と特性評価のためのプロトコールについて説明します。初代上皮細胞をマウス舌組織から単離し、ECMハイドロゲルに包埋し、上皮成長因子(EGF)、R-スポンディン、および線維芽細胞成長因子(FGF)10を含有する培地で培養する。最初の播種から7〜14日以内に、得られたオルガノイドを継代して、さらなる増殖と凍結保存を行うことができます。さらに、3Dホールマウントイメージングと遺伝子発現解析による確立されたオルガノイド培養の特性評価のための戦略も提示します。このプロトコルは、経口上皮幹細胞の挙動 をex vivo で還元主義的に調査するためのツールとして役立つ可能性があります。

口腔粘膜は、私たちの口の中を覆う粘膜です。それは消化管の入り口として機能し、消化過程の開始に関与しています^1,2。さらに、口腔粘膜は、物理的、化学的、生物学的な侮辱からの保護を提供する外部環境に対する私たちの体のバリアとして機能します¹。機能と組織学に基づいて、哺乳類の口腔粘膜は、咀嚼粘膜(硬口蓋と歯肉を含む)、内層粘膜(軟口蓋の表面、舌の腹面と頬面として機能する)、および特殊な粘膜(舌の背側表面を覆う)^の3つのタイプに分類できます2。すべての口腔粘膜組織は、表面の層状扁平上皮とその下にある固有層¹の2つの層で構成されています。口腔上皮ケラチノサイトは、上皮の主要な細胞型であり、ランゲルハンス細胞¹などの上皮内免疫細胞の位置でもあります。間質コンパートメントである固有層は、線維芽細胞、内皮細胞、神経細胞、免疫細胞などの異なる細胞タイプで構成されています¹。すべての層状上皮と同様に、幹細胞と前駆細胞は口腔上皮¹の基底層に存在します。これらの特殊な細胞は、細胞分裂を通じて失われた組織を置き換える能力を持っているため、成人期を通じて細胞のターンオーバーを促進します³。腸上皮⁴や皮膚表皮⁵などの他の上皮とは対照的に、口腔上皮はよく理解されていないままである。しかし、最近の研究では、マウスの口腔上皮幹細胞と前駆細胞をマークするKrt14、Lrig1、Sox2、Bmi1、Gli1などのさまざまな遺伝子が明らかになりました1,6,7,8。口腔上皮は口腔がんの原因であり、粘膜の炎症、創傷^、再生1において重要な役割を担っているため、その基本的な細胞生物学をより深く理解することは、新しい治療法や創薬の可能性にとって最も重要です。

動物モデルは、口腔粘膜上皮1の基礎研究に広く用いられ^{ています。}例えば、口腔上皮幹細胞および前駆細胞の前述のマーカーは、主にマウスモデル^1,6,7,8,9の遺伝的系統追跡を用いて定義されてきた。しかし、ヒトまたはマウス由来の培養細胞を用いたex vivoアプローチも広く用いられている¹⁰。従来、このような細胞培養作業は、口腔扁平上皮がん(OSCC)に由来する細胞株、または(自然発生的または遺伝的に)不死化された初代細胞から生成された細胞株¹⁰を用いて行われてきた。これらの2D細胞培養法には、(1)細胞の不死化には大きな遺伝的不安定性が伴う、(2)分化能力が限られている、(3)フィーダー細胞が必要、(4)血清¹¹を含む増殖培地がほとんど未定義であるなど、成体ホメオスタシスの研究に重大な意味を持つ制限があります。全体として、これらのゴールドスタンダードのin vitro法では、上皮幹細胞の増殖能力と分化能力、および野生型ゲノムの形質転換を制限することなく、上皮幹細胞の長期培養を行うことはできませんでした。

オルガノイド技術は、天然に近い上皮組織の培養を確立するツールとして登場しました in vitro¹¹.2009年の研究では、佐藤らは最初の上皮オルガノイド培養システムについて説明しました¹².彼らの方法は、Wnt/β-カテニン標的遺伝子によってマークされた個々の小腸幹細胞を埋め込むことに基づいていました Lgr5¹³3D細胞外マトリックス(ECM)に富むハイドロゲルに¹².幹細胞性に重要な成長因子の明確なカクテルを提供することにより、播種された成体上皮幹細胞は、培養中の能力まで増殖することができました¹².最終的に、細胞クラスターは、すべての主要な腸上皮細胞タイプを含む活発に循環する幹細胞から形成されました¹²、起源の組織に効果的に似ています¹¹.従来の2D培養とは対照的に、オルガノイド技術により、無血清で完全に定義された培地を用いて、フィーダーフリー条件下でマウスの腸上皮幹細胞を長期間維持することができました^10,11.さらに、この方法は、培養幹細胞の遺伝的構成または表現型を大きく変化させません¹¹.さらに、長期培養では、幹細胞の不死化を必要とせずに幹細胞の増殖能力と分化能力が保持されました¹¹.わずか10年余りで、この初期の上皮オルガノイド培養システムは、結腸(大腸)などの他の多くの上皮組織から成体幹細胞を増殖するように修正されました^12,14,15子宮 内 膜¹⁶肝臓^17,18肺^19,20乳腺²¹卵巣²²膵臓^23,24、皮膚表皮²⁵、そして胃²⁶.ほとんどのプロトコルは、ヒトなどの哺乳類に由来する成体上皮幹細胞を使用していましたが、^11,27マウス¹¹猫²⁸イヌ²⁹、およびブタ³⁰、ヘビ毒腺から上皮オルガノイドを生成することさえ可能でした³¹.オルガノイド技術は、高い汎用性を持つ幹細胞培養法として広く利用されています¹¹.上皮オルガノイドは主に遺伝的に残っているため^32,33そして表現型的に安定しており、遺伝子編集の優れたモデルです^34,35遺伝子機能の研究³⁶または腫瘍形成^{27,37,38,39,40}.さらに、オルガノイド培養物をマウスに移植することができます^37,41そして、宿主と微生物の相互作用を研究するために使用されます⁴²(病原性感染症を含む)^43,44,45).さらに、オルガノイドベースで免疫細胞などの微小環境の細胞と共培養します^46,47,48および線維芽細胞^49,50 が記載されています。疾患という文脈では、オルガノイドは何世代にもわたって生体組織バイオバンクに使用されてきました^21,22,51薬物の試験だけでなく²⁷効能のために^52,53と毒性⁵⁴.

このプロトコールでは、マウスの舌上皮からの口腔粘膜オルガノイド培養の確立と維持のための最適化された方法論について説明します。これは、酵素消化⁵⁵を用いた舌上皮の単離と、マウスおよびヒトの口腔粘膜^52,53からの上皮オルガノイドの誘導を記述した以前の報告に基づいている。マウス口腔粘膜オルガノイドの増殖培地には、幹細胞の状態を維持する重要な因子が含まれています。R-スポンディンはWnt/β-カテニンシグナル伝達カスケード⁵を活性化し、上皮成長因子(EGF)および線維芽細胞成長因子(FGF)10は、MAPK/ERK経路およびPI3K/AKT/mTOR経路²⁵などのいくつかのシグナル伝達経路を刺激する受容体チロシンキナーゼのサイトカインおよびリガンドである。さらに、オルガノイド培養物を遺伝子およびタンパク質発現解析によって特徴付け、起源組織と比較する方法について詳しく説明します。

ここに記載されているすべての方法は、動物実験に関する欧州連合およびドイツの法律に準拠して実施されました。

注意: 滅菌手術器具(細かい鉗子、細かいはさみ、メス)や冷たいPBSOで満たされたペトリ皿などの作業場所を準備します。BMEを一晩解凍し、使用するまで4°Cまたは氷の上に保ちます。細胞培養プレートをインキュベーターで一晩温めてから、細胞単離を開始します。すべての資料は資料表に記載されています。

1 マウス口腔粘膜オルガノイド培養の確立

1. マウス舌の解剖
   1. 機関のガイドラインおよびそれぞれの国内および政府間の法律に従ってマウスを安楽死させます。
      注:このプロトコルでは、マウスは、子宮頸部脱臼が頭部の不安定性につながる可能性があるため、_CO2曝露によって安楽死させられました。
   2. マウスを仰向けに置き、足を適切な下敷きに固定して固定します。
   3. マウスが完全に濡れるまで70%EtOHを噴霧してマウスを消毒します。
   4. はさみで皮膚を、最初に胸骨から唇まで気管に沿って垂直に、次に気管から両側の鎖骨に向かって水平に切ります。切開部の長さは2cm程度です。
   5. 毛皮を脇に引っ張って顎を露出させます。
   6. 口腔の奥まで顎の筋肉を切り込みます。
   7. 2つの鉗子を使用して下顎と上顎を反対方向に引っ張ることにより、口腔をできるだけ開きますが、これにより下顎が脱臼します。
   8. 鈍い鉗子を使用して舌をつかみ、背中を垂直に切って舌をできるだけ多く取り除きます。
   9. 舌をMg²⁺ およびCa²⁺ (PBSO)を含まない冷たいPBSに入れます。
   10. 舌を水平に切って、背側と腹側の舌粘膜を分離します。
       注:背側の舌粘膜は舌の上側であり、腹側の舌は口腔床と接触している舌の下側です。どちらの粘膜も、背側の舌粘膜が目に見えて粗くなっているのに対し、腹側の舌粘膜は滑らかな表面を持っているため、その形態によって識別できます。腹側舌は背側舌よりも狭い領域をカバーしています(~5 x 2 mm腹側舌、~8 x 3 mm背側舌)。
   11. オプション:舌の一部を固定剤(例:4%パラホルムアルデヒド)または凍結保存のための最適切断温度(OCT)培地に固定します。
   12. オプション:-80°CでRNAまたはタンパク質を単離するためのフラグメントをスナップ凍結します。
2. 上皮と固有層の分離のための消化
   1. 1 mg/mL コラゲナーゼ A と 2 mg/mL ディスパーゼ II を PBSO に含み、使用前に溶液を 37 °C に温めた新鮮な酵素カクテルを調製してください。
   2. 26Gの針を使用して、舌の後部切口から少なくとも500μLの酵素カクテルを上皮下腔に注入します。
   3. 針を組織の奥深くに挿入し、固有層を穿孔し、その下にある筋肉を上皮と平行に保ちながら慎重に行います。
   4. 針をゆっくりと引っ込めながらカクテルを注入します。
      注:舌組織の色が薄くなり、目に見える拡大が見られると、消化酵素が十分に注入されていることが確認されます。また、上皮の下に透明な相が誘導されることは、適切な注射を示しています。
   5. 注入を最大5回繰り返します。
   6. 組織を、同じ酵素カクテルが入った2mLの微量遠心チューブに移します。
   7. サンプルをシェーカー(300 rpm)で37°Cで1時間インキュベートします。
   8. 組織をPBSOを含むシャーレに移します。
   9. ピンセットで筋肉と舌先をつかみ、筋肉を上皮から慎重に引き離します。抵抗が発生した場合は、おそらく後部の切断端で、鈍いピンセットで上皮を持ち上げます。
   10. 分離した上皮をPBSOで洗浄し、目的のアプリケーションに進みます。オルガノイドの樹立についてはステップ1.3.1に進み、組織全体のマウント調製についてはステップ4.1.1に進んでください。
3. 初代組織からのマウス口腔粘膜オルガノイドの樹立
   1. 上皮を約2 x 2mmのサイズの小片に切ります。
   2. PBSOに添加した0.125%トリプシン1mLで組織を37°Cで消化します。
      注:消化は30分を超えてはなりません。
   3. 10分ごとに振って、定期的に消化をチェックしてください。
   4. 混合物が濁った場合(組織の量による)、または細胞塊の混合物が観察された場合は、5秒間ボルテックスし、10〜20回ピペッティングして混乱を延長します。
   5. 10mLのAdvanced DMEM/F12+++培地を補充して1回洗います。
   6. 70 μmの細胞ストレーナを使用して細胞懸濁液を直接ろ過します。
   7. 350 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
   8. 上清を捨て、細胞を1 mLのAdvanced DMEM/F12+++培地に再懸濁してカウントします。
   9. ノイバウアーカウンティングチャンバーまたは同等の方法を使用して細胞をカウントします。
   10. 350 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
   11. ペレットをBMEに再懸濁します(固化を防ぐためにBMEを氷上に保ちます)。細胞数に応じてBMEの量を計算します(約10,000細胞/BME40μL)。培地を完全に吸引できない場合は、100 μLピペットを使用して残りの媒体を慎重に取り出します。
       注:BMEの濃度は70%未満であってはなりません。これは、固化が不十分になる可能性があるためです。
   12. P100ピペットを使用して、予熱した細胞培養(懸濁液)プレートの底に細胞を10 μLの液滴でプレート化します。
   13. 培養プレートを逆さまにしてインキュベーターに30分〜1時間置き、BMEを固化させます。
   14. 必要量のマウス口腔粘膜オルガノイド培地を調製し、ROCK阻害剤とプリモシンを新たに加えます( 材料の表 と 表1を参照)。
   15. 固化後、液滴の剥離を避けるために、ウェルの壁に対して慎重にピペッティングして、予め温めた培地を細胞液滴に加えます。
   16. プレートを加湿インキュベーターで37°C、5%_CO2でインキュベートします。
   17. 2〜3日ごとに媒体を交換してください。ROCK阻害剤とプリモシンは、最初の2つの継代の間、培地に留まります。

2 マウス口腔粘膜オルガノイドの継代、凍結保存、融解

1. マウス口腔粘膜オルガノイド培養の継代
   1. マウス口腔粘膜オルガノイドは、最初のプレーティングから10〜12日後に初めて継代することができます。
   2. 分割するには、P1000ピペットでBME液滴を培地に再懸濁し、2 mLの氷冷PBSOが入った15 mLのコニカルチューブに移します。
   3. 氷冷したAdvanced DMEM/F12+++培地5mLで容量を補充します。
   4. オルガノイドを300 x g で5分間、4°Cで遠心分離します。
   5. 上清を吸引し、PBSO中の0.125%トリプシンを使用してオルガノイドを消化します。
   6. ペレットを0.125%トリプシン溶液1 mLに再懸濁し、オルガノイドがバラバラになるまで懸濁液を37°Cでインキュベートします。2分ごとに消化を確認してください。
   7. P1000ピペットを使用して20〜30回ピペッティングして細胞懸濁液を完全に再懸濁し、P200ピペットで過酷な再懸濁を繰り返します。
   8. 10 mLのAdvanced DMEM/F12+++培地で細胞を洗浄します。
   9. オプション:70 μmのセルストレーナーを使用して細胞懸濁液を直接ろ過し、均質な細胞懸濁液を生成します。
   10. 細胞懸濁液を350 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
   11. 上清を吸引し、ペレットをBMEに再懸濁し、ステップ1.3.8-1.3.17で説明されているようにオルガノイドを進めます。
2. マウス口腔粘膜オルガノイド培養物の凍結保存と融解
   1. 凍結保存のために、マウスの口腔粘膜オルガノイドを継代後3〜5日間成長させます。
   2. ステップ2.1.2-2.1.4で説明されているように、オルガノイドを培養プレートから分離します。
   3. 遠心分離後、オルガノイドを1 mLの凍結培地(10% FCSおよび10% DMSOを含むAdvanced DMEM/F12+++培地)に再懸濁し、細胞懸濁液を2 mLのクライオバイアルに移します。
   4. 細胞を-80°Cで最大24時間、目的の凍結容器に入れます。長期保存の場合は、液体窒素タンクなどでセルを-120°C未満に保ちます。
   5. 凍結保存した細胞を37°Cで解凍し、細胞懸濁液を9 mLの予熱済みAdvanced DMEM/F12+++培地が入った円錐管に素早く移します。
   6. 細胞懸濁液を350 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。
   7. 上清を捨て、手順1.3.8-1.3.17で説明されているようにオルガノイドを進めます。

3 マウス口腔粘膜組織およびオルガノイドの遺伝子発現解析

1. マウス口腔粘膜オルガノイドおよび天然組織からのRNA抽出
   1. ステップ2.1.2-2.1.4で説明されているように、マウスの口腔粘膜オルガノイドを採取します。
   2. 上清を捨て、オルガノイドを冷たいPBSOで洗います。
   3. オルガノイドを300 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
   4. 天然組織からRNAを単離するには、分離した上皮を使用します(ステップ1.2.10を参照)。
   5. ティッシュを2 mm x 2 mmの小片にカットします。
   6. RNA単離には、確立された方法またはキットを使用してください:オルガノイドまたは組織片をそれぞれ350または700 μLの溶解バッファーに再懸濁します。
   7. オルガノイドを少なくとも10秒間激しくボルテックス溶解し、組織を少なくとも30秒間溶解します。
   8. 溶液を-80°Cに少なくとも2時間置きます。
   9. 細胞ライセートを氷上で解凍し、製造元の指示に従ってRNAの単離を進めます。
2. 逆転写反応によるcDNA合成
   1. RNA濃度を測定し、0.1〜1μgの総RNAインプットの量を計算します。
   2. cDNA合成には、製造元の指示に従ってcDNA合成キットを使用してください。この実験では、4 μLの5x反応ミックス、1 μLの逆転写酵素、x μLの0.1-1 μgの全RNAおよびx μLのヌクレアーゼフリー水(最終容量の20 μLまで)を使用しました。
   3. 25 °C で 5 分間、42 °C で 30 分間、85 °C で 5 分間の 3 ステップのサイクラープログラムで逆転写を行います。
   4. cDNAを-20°Cで保存します。
3. 定量的リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析
   1. 定量的リアルタイムPCRでは、すべての反応を技術的な複製で実行します。
   2. 5 μL の qPCR Supermix、1 μL のリバースプライマー (400 nM)、1 μL のフォワードプライマー (400 nM)、1 μL の cDNA (10-20 ng/ウェル)、2 μL のヌクレアーゼフリー水の混合物を調製します。
   3. 増幅には、ポリメラーゼの活性化とDNA変性を95°Cで30秒間、95°Cで5〜10秒間の変性、アニーリング/伸長、プレートを60°Cで60秒間40サイクルで読み取ります。65-95 °Cでメルトカーブ解析を、2-5 s/ステップで0.5 °C刻みで実行します(または、装置のデフォルト設定を使用します)。
   4. ΔCt法またはΔΔCt法⁵⁶のような所望の方法を用いて、または与えられた指示に従ってサーモサイクラーの製造業者が提供する分析ソフトウェアを使用して、データを分析すること。

4 マウス口腔粘膜組織およびオルガノイドのタンパク質発現解析

注:舌上皮のホールマウント染色は、24ウェルプレートで行い、各ステップで鉗子で組織をウェルからウェルに移しました。

1. マウス口腔粘膜組織およびオルガノイド培養の固定
   1. 組織全体の染色の場合は、ステップ1.2.10から進み、ステップ4.1.5に進みます。
   2. オルガノイド染色の場合は、ステップ2.1.2で説明したようにオルガノイドを回収し、ステップ4.1.3に進みます。
   3. 細胞懸濁液に10 mLのPBSOを補充します。
   4. 細胞懸濁液を350 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
   5. 上皮またはオルガノイドを4%パラホルムアルデヒドに室温(21°C)で30分間固定します。
   6. サンプルをPBSOで一度洗浄します。オルガノイドを350 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。
2. マウス口腔粘膜組織およびオルガノイド培養の全量染色
   1. エピトープのマスクを解除するには、サンプルを0.2% Triton X-100溶液に室温で20分間インキュベートします。
   2. サンプルをブロッキング溶液(PBSO中の5%ロバ血清)に移し、室温で1時間インキュベートします。
   3. 抗体をブロッキング溶液で希釈し、サンプルを抗体溶液で4°Cで一晩インキュベートします。
   4. 細胞または組織を、ddH2Oに0.1%Tween-20および1%PBSOを含む洗浄バッファーで3回(各5分)洗浄します。
   5. 二次抗体をPBSOで1:400に希釈します。
   6. サンプルを二次抗体溶液中で室温で3時間インキュベートします。
   7. 洗濯手順4.2.4を繰り返します。組織サンプルの場合は、ステップ4.2.8に進みます。オルガノイドサンプルの場合は、ステップ4.2.9に進みます。
   8. 上皮を基底側(固有椎弓板に付着していた側)を上にしてスライドに置きます。上皮をDAPIとカバースリップを使用して水性マウンタントにマウントします。ステップ 4.2.11 に進みます。
   9. オルガノイドサンプルの場合は、染色したオルガノイドを室温で固化する適切なゲルマトリックスに再懸濁します。
   10. 液滴を96ウェルガラス製ボトムプレート(5 μL/ウェル)にすばやくピペットで移します。プレートを氷の上に置き、ゲルマトリックスを15分間固化させます。オルガノイドをDAPI入りの水性封入剤に封入し、ウェルあたり100μLを添加します。
   11. 染色したサンプルは、画像分析まで光から保護して4°Cで保存してください。

このプロトコルでは、酵素カクテルを使用して、舌上皮を下にある固有層および筋肉から分離する方法について説明します(図1)。分離された上皮は、オルガノイドの生成だけでなく、さまざまなタイプの遺伝子およびタンパク質分析のために回収することもできます。同様に、固有層と筋肉の消化された層は、選択した手順に使用できます。

組織消化
コラゲナーゼの消化は、上皮を下にある固有層および筋肉組織から分離するのに役立ちます。このステップにより、一次組織とその後に生成された口腔粘膜オルガノイドとの比較をより良く行うことができます。酵素による過剰消化は成体上皮幹細胞のオルガノイド形成能力に影響を与えるため、コラゲナーゼのインキュベーションは1時間?...

株式会社は、オルガノイド技術に関連する特許出願中の発明者に指名されました。

著者は、支援してくれたSabine Kranzに感謝します。この研究を支援してくださったIZKF WürzburgのCore Unit for Confocal Microscopy and Flow Cytometry-based Cell Sortingに感謝いたします。この研究は、German Cancer Aidからの助成金(IZKF/MSNZヴュルツブルクからK.K.まで)によって資金提供されました。