JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем метод получения и характеристики органоидных культур слизистой оболочки полости рта, полученных из эпителия языка взрослых мышей.

Аннотация

Слизистая оболочка, покрывающая внутреннюю часть рта, слизистая оболочка полости рта, представляет собой сильно разделенную ткань и может быть подразделена на слизистую оболочку щек, десну, губы, нёбо и язык. Его самый верхний слой, эпителий полости рта, поддерживается взрослыми стволовыми клетками на протяжении всей жизни. Пролиферация и дифференцировка эпителиальных стволовых клеток взрослого человека интенсивно изучалась с использованием мышиных моделей in vivo , а также двумерных (2D) фидерных клеток на основе моделей in vitro . В дополнение к этим методам используется органоидная технология, при которой взрослые стволовые клетки встраиваются в гидрогель, богатый внеклеточным матриксом (ВКМ), и получают питательную среду, содержащую определенный коктейль факторов роста. В этих условиях взрослые стволовые клетки размножаются и спонтанно образуют трехмерные (3D) клеточные кластеры, так называемые органоиды. Органоидные культуры первоначально были созданы из эпителиальных стволовых клеток тонкого кишечника мышей. Тем не менее, с тех пор метод был адаптирован для других типов эпителиальных стволовых клеток. В данной статье мы описываем протокол получения и определения характеристик органоидных культур слизистой оболочки полости рта мышей. Первичные эпителиальные клетки выделяют из ткани языка мышей, встраивают в гидрогель ECM и культивируют в среде, содержащей: эпидермальный фактор роста (EGF), R-спондин и фактор роста фибробластов (FGF) 10. В течение 7-14 дней после первоначального посева полученные органоиды могут быть пропущены для дальнейшей экспансии и криоконсервации. Кроме того, мы представляем стратегии для определения характеристик установленных органоидных культур с помощью 3D-визуализации и анализа экспрессии генов. Этот протокол может служить инструментом для исследования поведения стволовых клеток орального эпителия ex vivo в редукционистской манере.

Введение

Слизистая оболочка полости рта — это слизистая оболочка, покрывающая внутреннюю часть рта. Он функционирует как вход в пищеварительный тракт и участвует в инициировании пищеварительного процесса 1,2. Кроме того, слизистая оболочка полости рта выступает в качестве барьера нашего организма для внешней среды, обеспечивая защиту от физических, химических и биологических повреждений1. Исходя из функции и гистологии, слизистую оболочку полости рта у млекопитающих можно разделить на три типа: жевательная слизистая оболочка (включая твердое небо и десну), слизистая оболочка (функционирующая как поверхность мягкого неба, вентральная поверхность языка и щечная поверхность) и специализированная слизистая оболочка (покрывающая тыльную поверхность языка)2. Все ткани слизистой оболочки полости рта состоят из двух слоев: поверхностного слоистого плоского эпителия и нижележащей собственно пластинки1. Оральный эпителиальный кератиноцит является основным типом клеток эпителия, который также является местом расположения интраэпителиальных иммунных клеток, таких как клетки Лангерганса1. Стромальный компартмент, собственная пластинка, состоит из различных типов клеток, таких как фибробласты, эндотелиальные клетки, нейрональные клетки и иммунные клетки1. Как и во всех стратифицированных эпителиях, стволовые и прогениторные клетки находятся в базальном слое эпителия полости рта1. Эти специализированные клетки обладают способностью замещать утраченные ткани путем деления клеток и, следовательно, обеспечивать клеточный оборот на протяжении всейвзрослой жизни. В отличие от других эпителий, таких как кишечный эпителий4 или эпидермис кожи5, оральный эпителий остается плохо изученным. Тем не менее, недавние исследования обнаружили различные гены, такие как Krt14, Lrig1, Sox2, Bmi1 и Gli1, которые маркируют стволовые и прогениторные клетки эпителия полости рта у мышей 1,6,7,8. Поскольку эпителий полости рта является источником карцином полости рта и играет важную роль в воспалении, нанесении ран и регенерации слизистыхоболочек1, лучшее понимание его базовой клеточной биологии имеет первостепенное значение для потенциальных новых терапевтических подходов и открытий лекарств.

Животные модели широко использовались для фундаментальных исследований эпителия слизистой оболочки полости рта1. Например, вышеупомянутые маркеры эпителиальных стволовых и прогениторных клеток полости рта в значительной степени были определены с использованием моделей мышей с отслеживанием генетической линии 1,6,7,8,9. Тем не менее, подходы ex vivo с использованием культивируемых клеток человеческого или мышиного происхождения также широко используются10. Традиционно такая работа с клеточными культурами проводилась с использованием клеточных линий, полученных из плоскоклеточной карциномы полости рта (OSCCs), или клеточных линий, полученных из (спонтанно или генетически) иммортализированных первичных клеток10. Эти методы двумерного культивирования клеток имеют ограничения с критическими последствиями для исследования взрослого гомеостаза: (1) иммортализация клеток сопровождается большой степенью генетической нестабильности, (2) ограниченной способностью к дифференцировке, (3) потребностью в питающих клетках и (4) в значительной степени неопределенной питательной средой, содержащей сыворотку11. В совокупности эти методы in vitro не позволяли проводить долгосрочные культуры эпителиальных стволовых клеток без ограничения их способности к пролиферации и дифференцировке, а также трансформации их генома дикого типа.

Органоидная технология появилась как инструмент для создания культур эпителиальной ткани, близкой к нативной in vitro11. В своем исследовании 2009 года Сато и др. описали первую систему культивирования эпителиальных органоидов12. Их метод был основан на встраивании отдельных стволовых клеток тонкой кишки, помеченных геном-мишенью Wnt/β-катенина Lgr513в гидрогель, богатый 3D внеклеточным матриксом (ВКМ)12. Обеспечивая определенный коктейль факторов роста, важных для стволовости, посеянные взрослые эпителиальные стволовые клетки смогли пролиферировать до своей емкости в культуре12. В конце концов, клеточные кластеры сформировались из активно циркулирующих стволовых клеток, содержащих все основные типы эпителиальных клеток кишечника12, эффектно напоминая ткань происхождения11. В отличие от обычных 2D-культур, органоидная технология позволила обеспечить долгосрочное поддержание эпителиальных стволовых клеток кишечника мышей в условиях, не содержащих питательных веществ, с полностью определенной средой, не содержащей сыворотки10,11. Кроме того, метод существенно не изменяет генетический состав или фенотип культивируемых стволовых клеток11. Кроме того, долгосрочная культура сохранила способность стволовых клеток к пролиферации и дифференцировке без необходимости иммортизации клеток11. В течение чуть более десяти лет эта ранняя эпителиальная система культивирования органоидов была изменена для выращивания взрослых стволовых клеток из многих других эпителиальных тканей, таких как толстая кишка12,14,15эндометрий16печень17,18легкие19,20, молочные железы21Яичников22поджелудочная железа23,24, эпидермис кожи25, и желудок26. В то время как в большинстве протоколов использовались эпителиальные стволовые клетки взрослого человека, полученные от млекопитающих, таких как человек11,27Мышей11Кошки28Собак29, и свиньи30, удалось даже получить эпителиальные органоиды из змеиных ядовитых желез31. Органоидная технология стала широко используемым методом культивирования стволовых клеток с высокой степенью универсальности11. Поскольку эпителиальные органоиды остаются в значительной степени генетически32,33и фенотипически стабильны, они являются отличными моделями для редактирования генов34,35для изучения функции гена36или онкогенез27,37,38,39,40. Кроме того, органоидные культуры можно пересаживать мышам37,41и используются для изучения взаимодействия хозяина и микроба42(в т.ч. патогенные инфекции43,44,45). Кроме того, кокультуры на основе органоидов с клетками микроокружения, такими как иммунные клетки46,47,48и фибробласты49,50 были описаны. В контексте болезней органоиды использовались для поколений живых тканевых биобанков21,22,51а также тестирование лекарственных препаратов27для эффективности52,53и токсичность54.

В этом протоколе мы описываем оптимизированную методологию создания и поддержания органоидных культур слизистой оболочки полости рта из эпителия языка мышей. Он основан на предыдущих отчетах, описывающих выделение эпителия языка с помощью ферментативного пищеварения55 и получение эпителиальных органоидов из слизистой оболочки полости рта мыши и человека52,53. Питательная среда для органоидов слизистой оболочки полости рта мышей содержит критические факторы, поддерживающие состояние стволовых клеток. R-спондин активирует сигнальный каскад Wnt/β-катенин5, в то время как эпидермальный фактор роста (EGF) и фактор роста фибробластов (FGF) 10 являются цитокинами и лигандами рецепторных тирозинкиназ, которые стимулируют несколько сигнальных путей, таких как путь MAPK/ERK и путь PI3K/AKT/mTOR25. Далее мы подробно описываем, как органоидные культуры могут быть охарактеризованы с помощью анализа экспрессии генов и белков и сравнены с тканью происхождения.

протокол

Все описанные здесь методы были выполнены в соответствии с законодательством Европейского Союза и Германии об экспериментах на животных.

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте рабочее место, включая стерильные хирургические инструменты (тонкие щипцы, ножницы и скальпели) и чашки Петри, наполненные холодным ПБСО. Разморозьте BME на ночь и держите при температуре 4 °C или на льду до использования. Предварительно нагрейте планшеты для клеточных культур в инкубаторе на ночь перед началом изоляции клеток. Все материалы приведены в Таблице материалов.

1 Создание органоидной культуры слизистой оболочки полости рта у мышей

  1. Рассечение мышиного языка
    1. Усыпьте мышь в соответствии с руководящими принципами учреждения и соответствующим национальным и межправительственным законодательством.
      Примечание: В рамках этого протокола мыши были усыплены под воздействиемCO2, так как вывих шейки матки может привести к нестабильности головы, что приводит к трудностям с извлечением органов.
    2. Положите мышь на спину и зафиксируйте ее, приколов лапы к подходящей подложке.
    3. Продезинфицируйте мышь, распылив на нее 70% EtOH до полного намокания.
    4. Разрежьте кожу ножницами сначала вертикально вдоль трахеи от грудины до губы, а затем горизонтально от трахеи в сторону ключиц с обеих сторон. Длина каждого разреза составляет около 2 см.
    5. Оттяните шерсть в сторону, чтобы обнажить челюсть.
    6. Разрежьте мышцы челюсти до задней части ротовой полости.
    7. Откройте ротовую полость как можно дальше, потянув нижнюю и верхнюю челюсть в противоположных направлениях с помощью двух щипцов, что приводит к вывиху нижней челюсти.
    8. Используйте тупые щипцы, чтобы захватить язык и удалить как можно большую часть языка, разрезая вертикально сзади.
    9. Поместите язык в холодный PBS без Mg2+ и Ca2+ (PBSO).
    10. Разрежьте язык горизонтально, чтобы отделить слизистую оболочку тыльного и вентрального языка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слизистая оболочка тыльного языка — это верхняя сторона языка, а вентральный язык — это нижняя сторона языка, которая соприкасается с полостью рта. Обе слизистые оболочки можно различить по их морфологии, так как слизистая оболочка тыльного языка заметно огрубела, в то время как слизистая оболочка вентрального языка имеет гладкую поверхность. Вентральный язык покрывает меньшую площадь, чем дорсальный язык (~ 5 x 2 мм вентральный язык; ~ 8 x 3 мм дорсальный язык).
    11. Дополнительно: Закрепите одну часть язычка либо в фиксирующей (например, 4% параформальдегид), либо в среде с оптимальной температурой резки (OCT) для криоконсервации.
    12. Опционально: Мгновенная заморозка фрагментов для выделения РНК или белка при -80 °C.
  2. Сбраживание для отделения эпителия и собственной пластинки
    1. Перед применением приготовьте свежий ферментативный коктейль, содержащий 1 мг/мл коллагеназы А и 2 мг/мл Dispase II в ПБСО и разогрев раствор до 37 °С.
    2. Введите не менее 500 мкл ферментативного коктейля в субэпителиальное пространство с заднего разреза конца языка с помощью иглы 26 G.
    3. Введите иглу глубоко в ткань, перфорирующую собственную пластинку и нижележащую мышцу, осторожно оставаясь параллельно эпителию.
    4. Введите коктейль, медленно втягивая иглу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осветление цвета и видимое расширение тканей языка подтверждает достаточное введение ферментов пищеварения. Кроме того, индукция прозрачной фазы под эпителием указывает на правильную инъекцию.
    5. Повторите инъекцию до пяти раз.
    6. Перенесите ткань в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую тот же ферментативный коктейль.
    7. Инкубируйте образец в течение 1 ч при 37 °C на шейкере (при 300 об/мин).
    8. Переложите ткань в чашку Петри, содержащую PBSO.
    9. Захватите мышцу и кончик языка пинцетом и осторожно оттяните мышцу от эпителия. Если вы столкнулись с сопротивлением, вероятно, на заднем режущем конце, приподнимите эпителий тупым пинцетом.
    10. Промойте отделенный эпителий с помощью PBSO и приступайте к нужному нанесению. Для создания органоидов переходят к шагу 1.3.1, а для получения цельнокостевых препаратов переходят к шагу 4.1.1.
  3. Получение органоидов слизистой оболочки полости рта у мышей из первичных тканей
    1. Разрежьте эпителий на небольшие кусочки размером примерно 2 х 2 мм.
    2. Расщепите ткань в 1 мл 0,125% трипсина, добавленного в PBSO, при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переваривание не должно превышать 30 минут.
    3. Регулярно проверяйте пищеварение, встряхивая каждые 10 минут.
    4. Когда смесь становится мутной (в зависимости от количества ткани) или когда наблюдается смесь клеточных скоплений, продлите нарушение, сделав вихрь в течение 5 с и пипетируя вверх и вниз 10-20 раз.
    5. Умойтесь один раз, долив 10 мл среды Advanced DMEM/F12+++.
    6. Непосредственно отфильтруйте клеточную суспензию с помощью клеточного фильтра 70 мкм.
    7. Центрифуга при 350 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    8. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл среды Advanced DMEM/F12+++ для подсчета.
    9. Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры Нейбауэра или аналогичного метода.
    10. Центрифугируйте при 350 x g в течение 5 мин при 4 °C и аспирируйте надосадочную жидкость.
    11. Повторно суспендируйте гранулу в BME (держите BME на льду, чтобы предотвратить застывание). Рассчитайте количество BME, в зависимости от количества ячеек (примерно 10 000 ячеек/40 μл BME). Если среда не может быть полностью аспирирована, осторожно удалите остатки с помощью пипетки объемом 100 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация БМЭ не должна быть менее 70%, так как это может привести к недостаточному затвердеванию.
    12. Поместите клетки на дно предварительно нагретых планшетов для клеточных культур (суспензий) в капли объемом 10 мкл с помощью пипетки P100.
    13. Поместите культуральную пластину вверх дном в инкубатор на 30 мин-1 ч, чтобы БМЭ застывал.
    14. Приготовьте необходимое количество органоидной среды слизистой оболочки полости рта мышей свежей с добавлением ингибитора ROCK и Примоцина (см. Таблицы материалов и Таблицу 1).
    15. После застывания добавьте предварительно подогретую среду к каплям клеток путем тщательного пипетирования к стенкам лунок во избежание отслоения капель.
    16. Инкубируйте планшеты в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2.
    17. Меняйте средство каждые 2-3 дня. Ингибитор ROCK и примоцин остаются в питательной среде в течение первых двух проходов.

2 Пассирование, криоконсервация и размораживание органоидов слизистой оболочки полости рта мышей

  1. Пассирование органоидных культур слизистой оболочки полости рта мышей
    1. Органоиды слизистой оболочки слизистой оболочки полости рта мышей могут быть впервые пропущены через 10-12 дней после первоначального осаждения.
    2. Для расщепления суспендируйте капли BME в среде с помощью пипетки P1000 и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл ледяного PBSO.
    3. Пополните объем 5 мл ледяного медиума Advanced DMEM/F12+++.
    4. Центрифугируйте органоиды при давлении 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    5. Аспирируйте надосадочную жидкость и расщепляйте органоиды, используя 0,125% трипсина в PBSO.
    6. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл 0,125% раствора трипсина и инкубируйте суспензию при 37 °C до тех пор, пока органоиды не разделятся на кусочки. Проверяйте пищеварение каждые 2 минуты.
    7. Тщательно суспендируйте клеточную суспензию путем пипетирования вверх и вниз 20-30 раз с помощью пипетки P1000 и повторите жесткую ресуспендию с помощью пипетки P200.
    8. Промойте ячейки 10 мл среды Advanced DMEM/F12+++.
    9. Дополнительно: Непосредственно отфильтруйте клеточную суспензию с помощью клеточного фильтра 70 мкм для получения однородной клеточной суспензии.
    10. Центрифугируйте клеточную суспензию при 350 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    11. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в BME и продолжайте работу с органоидами, как описано в шагах 1.3.8-1.3.17.
  2. Криоконсервация и размораживание органоидных культур слизистой оболочки полости рта мышей
    1. Для криоконсервации дайте органоидам слизистой оболочки полости рта мыши расти в течение 3-5 дней после пассажа.
    2. Отделите органоиды от культуральных планшетов, как описано в шагах 2.1.2-2.1.4.
    3. После центрифугирования ресуспендируйте органоиды в 1 мл замораживающей среды (среда Advanced DMEM/F12+++, содержащая 10% FCS и 10% DMSO) и перенесите клеточную суспензию в 2 мл криовиалов.
    4. Поместите клетки в нужные контейнеры для заморозки при температуре -80 °C на срок до 24 часов. Для длительного хранения держите клетки при температуре ниже -120 °C, например, в резервуаре с жидким азотом.
    5. Разморозьте криоконсервированные клетки при 37 °C и быстро перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку, содержащую 9 мл предварительно нагретой среды Advanced DMEM/F12+++.
    6. Центрифугируйте клеточную суспензию при 350 x g и 4 °C в течение 5 минут.
    7. Выбросьте надосадочную жидкость и продолжайте работу с органоидами, как описано в шагах 1.3.8-1.3.17.

3 Анализ экспрессии генов слизистой оболочки полости рта и органоидов мышей

  1. Экстракция РНК из органоидов слизистой оболочки полости рта мышей и нативных тканей
    1. Соберите органоиды слизистой оболочки полости рта мышей, как описано в шагах 2.1.2-2.1.4.
    2. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте органоиды в холодном PBSO.
    3. Центрифугируйте органоиды при 300 x g и 4 °C в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
    4. Чтобы выделить РНК из нативной ткани, используйте отделенный эпителий (см. шаг 1.2.10).
    5. Нарежьте ткань небольшими кусочками размером 2 мм х 2 мм.
    6. Для выделения РНК используйте установленный метод или набор: ресуспендируйте органоиды или кусочки ткани в, соответственно, 350 или 700 мкл лизисного буфера.
    7. Жестко вихревой лизируют органоиды в течение не менее 10 с и лизируют ткань в течение не менее 30 с.
    8. Поместите раствор при температуру -80 °C не менее чем на 2 часа.
    9. Разморозьте лизат клеток на льду и приступайте к выделению РНК в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Синтез кДНК реакцией обратной транскрипции
    1. Измерьте концентрацию РНК и рассчитайте объем для общего поступления РНК 0,1-1 мкг.
    2. Для синтеза кДНК используйте набор для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя. Для этого эксперимента использовали следующую рецептуру: 4 мкл 5-кратной реакционной смеси, 1 мкл обратной транскриптазы, х л 0,1-1 мкг общей РНК и х мкл безнуклеазной воды до 20 мкл конечного объема.
    3. Выполните обратную транскрипцию в трехступенчатой программе циклера со следующей программой: 25 °C в течение 5 мин, 42 °C в течение 30 мин и 85 °C в течение 5 мин.
    4. Храните кДНК при температуре -20 °C.
  3. Анализ экспрессии генов методом количественной ПЦР в реальном времени
    1. Для количественной ПЦР в реальном времени выполните все реакции в технических дубликатах.
    2. Приготовьте смесь из 5 мкл супермикса для количественной ПЦР, 1 мкл обратного праймера (400 нМ), 1 мкл прямого праймера (400 нМ), 1 мкл кДНК (10-20 нг/лунка) и 2 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
    3. Для амплификации используют следующие стандартные настройки: активация полимеразы и денатурация ДНК при 95 °C в течение 30 с, денатурация при 95 °C в течение 5-10 с, отжиг/растяжение и считывание с помощью пластины при 60 °C в течение 60 с в течение 40 циклов. Выполняйте анализ кривой расплава при температуре 65–95 °C с шагом 0,5 °C со скоростью 2–5 с/шаг (или используйте стандартные настройки прибора).
    4. Анализируйте данные с помощью желаемых методов, таких как методы ΔCt или ΔΔCt56, или с помощью аналитического программного обеспечения, предоставленного производителем амплификатора, в соответствии с приведенными инструкциями.

4 Анализ экспрессии белка в ткани слизистой оболочки полости рта мышей и органоидах

ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание эпителия языка методом полного крепления проводилось в 24-луночной пластине, перенося ткань щипцами из лунки в лунку на каждом этапе.

  1. Фиксация ткани слизистой оболочки полости рта мыши и органоидных культур
    1. Для окрашивания тканей целиком перейдите с шага 1.2.10 и продолжайте с шага 4.1.5.
    2. Для окрашивания органоидов соберите органоиды, как описано в шаге 2.1.2, и перейдите к шагу 4.1.3.
    3. Долейте суспензию клетки 10 мл PBSO.
    4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 350 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    5. Зафиксируйте эпителий или органоиды в 4% параформальдегиде на 30 минут при комнатной температуре (21 °C).
    6. Промойте образцы один раз в PBSO. Центрифугируйте органоиды при давлении 350 x g в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
  2. Окрашивание тканей слизистой оболочки полости рта мышей и органоидных культур
    1. Демаскируйте эпитопы путем инкубации образцов в 0,2% растворе Triton X-100 в течение 20 мин при комнатной температуре.
    2. Перенесите образцы в блокирующий раствор (5% сыворотка осляка в PBSO) и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
    3. Разведите антитела в блокирующем растворе и инкубируйте образцы в растворе антитела в течение ночи при 4 °С.
    4. Промойте клетки или ткань три раза (по 5 мин каждый) промывающим буфером, содержащим 0,1% Tween-20 и 1% PBSO в ddH2O.
    5. Разведите вторичные антитела в соотношении 1:400 в PBSO.
    6. Образцы инкубируют во вторичном растворе антител в течение 3 ч при комнатной температуре.
    7. Повторите промывку на шаге 4.2.4. Для образцов тканей перейдите к шагу 4.2.8. Для образцов органоидов перейдите к шагу 4.2.9.
    8. Поместите эпителий на предметное стекло базальной стороной (стороной, которая была прикреплена к собственной пластинке) вверх. Смонтируйте эпителий в водный монтаж с DAPI и покровным стеклом. Перейдите к шагу 4.2.11.
    9. Для образцов органоидов повторно суспендируйте окрашенные органоиды в любой подходящей гелевой матрице, которая затвердевает при комнатной температуре.
    10. Быстро пипетируйте капли в 96-луночный стеклянный нижний планшет (5 мкл/лунка). Поместите пластину на лед и дайте гелевой матрице застыть в течение 15 минут. Смонтируйте органоиды в водный монтажник с DAPI, добавив 100 мкл на лунку.
    11. Храните окрашенные образцы при температуре 4 °C в защищенном от света месте до анализа изображения.

Результаты

Этот протокол описывает отделение эпителия языка от нижележащей собственной пластинки и мышцы с помощью ферментативного коктейля (Рисунок 1). Отделенный эпителий в дальнейшем может быть использован для генерации органоидов, а также собран для различ?...

Обсуждение

Переваривание тканей
Расщепление коллагеназы помогает отделить эпителий от подлежащей собственной пластинки и мышечной ткани. Этот шаг позволяет лучше сравнить первичную ткань с впоследствии сгенерированными органоидами слизистой оболочки полости рта....

Раскрытие информации

К.К. назван изобретателем в патенте, который относится к технологии органоидов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Сабину Кранц за помощь. Мы хотели бы поблагодарить Основное подразделение по конфокальной микроскопии и сортировке клеток на основе проточной цитометрии IZKF Würzburg за поддержку этого исследования. Эта работа финансировалась за счет гранта от Немецкой организации по борьбе с раком (через IZKF/MSNZ Würzburg to K.K.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Media & Media Components
Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12Thermo Fisher Scientific 12634-028
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific17504-044
GlutaMAX-I (100x)Thermo Fisher Scientific35050-038
HEPESThermo Fisher Scientific15630-056
N-acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
NicotinamideSigma AldrichN0636
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific15140-122
PrimocinInvivogenant-pm1
RSPO3-Fc fusion protein conditioned mediumU-Protein Express BVR001
Recombinant human EGFPreprotechAF-100-15
Recombinant human FGF-10Preprotech100-26
ROCK (Rho kinase) inhibitor Y-27632 dihydrochlorideHölzel BiotechM1817
Antibodies 
Keratin-14 Polyclonal Antibody 100µlBiozolBLD-905301
E-Cadherin AntibodyBio-TechneAF748
Purified Mouse Anti-Ki-67 Clone B56  (0.1 mg)BD Bioscience556003
ALEXA FLUOR 594 Donkey Anti MouseThermo Fisher ScientificA21203
ALEXA FLUOR 647 Donkey Anti RabbitThermo Fisher ScientificA31573
ALEXA FLUOR 488 Donkey Anti GoatThermo Fisher ScientificA110555
Reagents / Chemicals
BME Type 2, RGF Cultrex PathclearBio-Techne3533-005-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma Aldrich34943-1L-M
Collagenase A Roche10103578001
Donkey SerumSigma AldrichS30-100ML
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific100-100-15
EDTASigma Aldrich221465-25G
Ethanol, denatured (96 %)Carl RothT171.3
Formalin Solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
TritonX-100Sigma AldrichX100-500ML
Tween-20 Sigma AldrichP1379-500ML
TrypLE Express Enzyme (1×), phenol redThermo Fisher Scientific12605-010
XyleneSigma Aldrich534056-500ML
Equipment and Others
Cell culture 12-Well Multiwell PlatesGreiner BioOne392-0047
Cell Strainer: 100 µmVWR732-2759
Cover SlipsVWR631-1569P
Glass Bottom Microplates VE=10 4580Corning13539050
Objective Slides: Superfrost PlusVWR631-0108P

Ссылки

  1. Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
  2. Gartner, L. P. Oral anatomy and tissue types. Seminars in Dermatology. 13 (2), 68-73 (1994).
  3. Post, Y., Clevers, H. Defining adult stem cell function at its simplest: The ability to replace lost cells through mitosis. Cell Stem Cell. 25 (2), 174-183 (2019).
  4. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatolology. 16 (1), 19-34 (2019).
  5. Kretzschmar, K., Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in adult mammalian epithelial stem cells. Developmental Biology. 428 (2), 273-282 (2017).
  6. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
  7. Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
  8. Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
  9. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
  10. Bierbaumer, L., Schwarze, U. Y., Gruber, R., Neuhaus, W. Cell culture models of oral mucosal barriers: A review with a focus on applications, culture conditions and barrier properties. Tissue Barriers. 6 (3), 1479568 (2018).
  11. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  12. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  13. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nature Medicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  17. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  19. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  20. Lamers, M. M., et al. An organoid-derived bronchioalveolar model for SARS-CoV-2 infection of human alveolar type II-like cells. EMBO Journal. 40 (5), 105912 (2020).
  21. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  22. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  23. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  24. Seino, T., et al. Human pancreatic tumor organoids reveal loss of stem cell niche factor dependence during disease progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
  25. Boonekamp, K. E., et al. Long-term expansion and differentiation of adult murine epidermal stem cells in 3D organoid cultures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (29), 14630-14638 (2019).
  26. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  27. Kretzschmar, K. Cancer research using organoid technology. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), 501-515 (2020).
  28. Kruitwagen, H. S., et al. Long-term adult feline liver organoid cultures for disease modeling of hepatic steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
  29. Wiener, D. J., et al. Establishment and characterization of a canine keratinocyte organoid culture system. Veterinary Dermatology. 29 (5), 375 (2018).
  30. vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
  31. Post, Y., et al. Snake venom gland organoids. Cell. 180 (2), 233-247 (2020).
  32. Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538 (7624), 260-264 (2016).
  33. Kuijk, E., et al. The mutational impact of culturing human pluripotent and adult stem cells. Nature Communications. 11 (1), 2493 (2020).
  34. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas tools and their application in genetic engineering of human stem cells and organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  35. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nature Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
  36. Gehart, H., et al. Identification of enteroendocrine regulators by real-time single-cell differentiation mapping. Cell. 176 (5), 1158-1173 (2019).
  37. Artegiani, B., et al. Probing the tumor suppressor function of BAP1 in CRISPR-engineered human liver organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 927-943 (2019).
  38. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  39. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  40. Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
  41. Fumagalli, A., et al. A surgical orthotopic organoid transplantation approach in mice to visualize and study colorectal cancer progression. Nature Protocols. 13 (2), 235-247 (2018).
  42. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  43. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  44. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
  45. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  46. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews Immunology. 20 (5), 279-293 (2020).
  47. Dijkstra, K. K., et al. Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  48. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO Journal. 38 (12), (2019).
  49. Nanki, K., et al. Divergent routes toward Wnt and R-spondin niche independency during human gastric carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
  50. Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
  51. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  52. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  53. Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
  54. Driehuis, E., et al. Patient-derived oral mucosa organoids as an in vitro model for methotrexate induced toxicity in pediatric acute lymphoblastic leukemia. PLOS One. 15 (5), 0231588 (2020).
  55. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  56. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены