Génération et caractérisation de cultures d’organoïdes murins de la muqueuse buccale

Nous présentons une méthode pour la génération et la caractérisation de cultures d’organoïdes de la muqueuse buccale dérivée de l’épithélium de la langue de souris adultes.

La muqueuse qui recouvre l’intérieur de notre bouche, la muqueuse buccale, est un tissu très compartimenté et peut être subdivisé en muqueuse buccale, gencive, lèvres, palais et langue. Sa couche supérieure, l’épithélium buccal, est maintenue par les cellules souches adultes tout au long de la vie. La prolifération et la différenciation des cellules souches épithéliales adultes ont été étudiées de manière intensive à l’aide de modèles murins in vivo ainsi que de modèles in vitro basés sur des cellules nourricières bidimensionnelles (2D). En complément de ces méthodes, la technologie des organoïdes consiste à intégrer des cellules souches adultes dans un hydrogel riche en matrice extracellulaire (MEC) et à les doter d’un milieu de culture contenant un cocktail défini de facteurs de croissance. Dans ces conditions, les cellules souches adultes prolifèrent et forment spontanément des amas de cellules tridimensionnelles (3D), appelés organoïdes. Les cultures organoïdes ont d’abord été établies à partir de cellules souches épithéliales de l’intestin grêle murin. Cependant, la méthode a depuis été adaptée à d’autres types de cellules souches épithéliales. Ici, nous décrivons un protocole pour la génération et la caractérisation de cultures d’organoïdes murins de la muqueuse buccale. Les cellules épithéliales primaires sont isolées du tissu de la langue murine, intégrées dans un hydrogel ECM et cultivées dans un milieu contenant : facteur de croissance épidermique (EGF), R-spondine et facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 10. Dans les 7 à 14 jours suivant l’ensemencement initial, les organoïdes résultants peuvent être passés pour une expansion et une cryoconservation ultérieures. Nous présentons également des stratégies pour la caractérisation de cultures d’organoïdes établies via l’imagerie 3D à montage entier et l’analyse de l’expression génique. Ce protocole peut servir d’outil pour étudier le comportement des cellules souches épithéliales orales ex vivo de manière réductionniste.

La muqueuse buccale est la muqueuse qui recouvre l’intérieur de notre bouche. Il fonctionne comme l’entrée du tube digestif et est impliqué dans l’initiation du processus digestif ^1,2. De plus, la muqueuse buccale agit comme une barrière de notre corps contre l’environnement extérieur, offrant une protection contre les agressions physiques, chimiques et biologiques¹. Sur la base de la fonction et de l’histologie, la muqueuse buccale chez les mammifères peut être divisée en trois types : la muqueuse masticatoire (y compris le palais dur et la gencive), la muqueuse muqueuse (fonctionnant comme la surface du palais mou, la surface ventrale de la langue et la surface buccale) et la muqueuse spécialisée (couvrant la surface dorsale de la langue)². Tous les tissus de la muqueuse buccale sont constitués de deux couches : l’épithélium épithélium squameux stratifié en surface et la lamina propria¹ sous-jacente. Le kératinocyte épithélial buccal est le principal type de cellule de l’épithélium, qui est également l’emplacement des cellules immunitaires intra-épithéliales telles que les cellules de Langerhans¹. Le compartiment stromal, la lamina propria, comprend les différents types de cellules telles que les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules neuronales et les cellules immunitaires¹. Comme dans tous les épithéliums stratifiés, les cellules souches et progénitrices résident dans la couche basale de l’épithélium buccal¹. Ces cellules spécialisées ont la capacité de remplacer les tissus perdus par les divisions cellulaires et, par conséquent, d’alimenter le renouvellement cellulaire tout au long de la vie adulte³. Contrairement à d’autres épithéliums tels que l’épithélium intestinal⁴ ou l’épiderme cutané⁵, les épithéliums buccaux restent mal compris. Cependant, des études récentes ont révélé différents gènes tels que Krt14, Lrig1, Sox2, Bmi1 et Gli1 qui marquent les cellules souches et progénitrices de l’épithélium buccal chez les souris 1,6,7,8. Étant donné que l’épithélium buccal est à l’origine des carcinomes buccaux et qu’il joue un rôle essentiel dans l’inflammation, les blessures et la régénération des muqueuses¹, une meilleure compréhension de sa biologie cellulaire fondamentale est primordiale pour de nouvelles approches thérapeutiques potentielles et la découverte de médicaments.

Les modèles animaux ont été largement utilisés pour les études fondamentales sur l’épithélium¹ de la muqueuse buccale. Par exemple, les marqueurs susmentionnés des cellules souches et progénitrices de l’épithélium buccal ont été largement définis à l’aide de modèles murins de traçage de la lignée génétique 1,6,7,8,9. Cependant, les approches ex vivo utilisant des cellules cultivées d’origine humaine ou murine ont également été largement utilisées¹⁰. Traditionnellement, ces travaux de culture cellulaire ont été effectués à l’aide de lignées cellulaires dérivées d’un carcinome épidermoïde oral (OSCC) ou de lignées cellulaires générées à partir de cellules primaires (spontanément ou génétiquement) immortalisées¹⁰. Ces méthodes de culture cellulaire 2D ont des limites avec des implications critiques sur l’étude de l’homéostasie adulte : (1) l’immortalisation cellulaire s’accompagne d’un grand degré d’instabilité génétique, (2) une capacité de différenciation limitée, (3) la nécessité de cellules nourricières et (4) un milieu de croissance largement indéfini contenant le sérum¹¹. Collectivement, ces méthodes in vitro de référence ne permettaient pas de cultiver à long terme des cellules souches épithéliales sans limiter leur capacité à proliférer et à se différencier ainsi qu’à transformer leur génome de type sauvage.

La technologie des organoïdes est apparue comme un outil pour établir des cultures de tissu épithélial presque natif in vitro¹¹. Dans leur étude de 2009, Sato et al. ont décrit le premier système de culture d’organoïdes épithéliales¹². Leur méthode était basée sur l’intégration de cellules souches individuelles de l’intestin grêle marquées par le gène cible Wnt/β-caténine Lgr5¹³dans un hydrogel riche en matrice extracellulaire (ECM) 3D¹². En fournissant un cocktail défini de facteurs de croissance importants pour la souche, les cellules souches épithéliales adultes ensemencées ont pu proliférer jusqu’à leur capacité en culture¹². Finalement, des amas de cellules se sont formés à partir des cellules souches à cycle actif contenant tous les principaux types de cellules épithéliales intestinales¹², ressemblant effectivement au tissu d’origine¹¹. Contrairement aux cultures 2D conventionnelles, la technologie des organoïdes a permis de maintenir à long terme les cellules souches épithéliales intestinales murines dans des conditions sans mangeoire avec un milieu sans sérum et entièrement défini^10,11. De plus, le procédé ne modifie pas de manière significative la constitution génétique ou le phénotype des cellules souches cultivées¹¹. De plus, la culture à long terme a conservé la capacité de la cellule souche à proliférer et à se différencier sans qu’il soit nécessaire de l’immortaliser¹¹. En un peu plus d’une décennie, ce système de culture organoïde épithéliale précoce a été modifié pour cultiver des cellules souches adultes à partir de nombreux autres tissus épithéliaux tels que le côlon (gros intestin)^12,14,15endomètre¹⁶foie^17,18Poumons^19,20, glandes mammaires²¹Ovaires²²pancréas^23,24, épiderme de la peau²⁵et l’estomac²⁶. Alors que la plupart des protocoles utilisaient des cellules souches épithéliales adultes dérivées de mammifères tels que les humains^11,27souris¹¹Chats²⁸chiens²⁹et les porcs³⁰, il a même été possible de générer des organoïdes épithéliales à partir de glandes à venin de serpent³¹. La technologie des organoïdes est devenue une méthode de culture de cellules souches largement utilisée avec un haut degré de polyvalence¹¹. Comme les organoïdes épithéliaux restent en grande partie génétiquement^32,33et phénotypiquement stables, ce sont d’excellents modèles pour l’édition de gènes^34,35pour étudier la fonction des gènes³⁶ou tumorigenèse^{27,37,38,39,40}. De plus, les cultures d’organoïdes peuvent être transplantées chez la souris^37,41et sont utilisés pour étudier les interactions hôte-microbe⁴²(y compris les infections pathogènes^43,44,45). De plus, les co-cultures à base d’organoïdes avec des cellules du microenvironnement telles que les cellules immunitaires^46,47,48et les fibroblastes^49,50 ont été décrits. Dans le contexte de la maladie, les organoïdes ont été utilisés pour des générations de biobanques de tissus vivants^21,22,51ainsi que des tests de drogues²⁷pour l’efficacité^52,53et toxicité⁵⁴.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthodologie optimisée pour l’établissement et le maintien de cultures d’organoïdes de la muqueuse buccale à partir de l’épithélium de la langue murine. Il est basé sur des rapports antérieurs décrivant l’isolement de l’épithélium de la langue à l’aide de la digestion enzymatique⁵⁵ et la dérivation d’organoïdes épithéliales à partir de la muqueuse buccale de souris et d’homme ^52,53. Le milieu de croissance des organoïdes murins de la muqueuse buccale contient des facteurs critiques qui maintiennent l’état des cellules souches. La R-spondine active la cascade de signalisation Wnt/β-caténine⁵, tandis que le facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 10 sont des cytokines et des ligands des récepteurs tyrosine kinases qui stimulent plusieurs voies de signalisation telles que la voie MAPK/ERK et la voie PI3K/AKT/mTOR²⁵. Nous décrivons en détail comment les cultures d’organoïdes peuvent être caractérisées par l’analyse de l’expression des gènes et des protéines et comparées au tissu d’origine.

Toutes les méthodes décrites ici ont été réalisées dans le respect de la législation de l’Union européenne et de l’Allemagne sur l’expérimentation animale.

REMARQUE : Préparez le lieu de travail, y compris les instruments chirurgicaux stériles (pinces fines, ciseaux fins et scalpels) et les boîtes de Pétri remplies de PBSO froid. Décongelez le BME pendant la nuit et conservez-le à 4 °C ou sur de la glace jusqu’à utilisation. Préchauffez les plaques de culture cellulaire dans un incubateur pendant la nuit avant de commencer l’isolement cellulaire. Tous les matériaux sont fournis dans la table des matériaux.

1 Mise en place d’une culture d’organoïdes de la muqueuse buccale murine

1. Dissection de la langue murine
   1. Euthanasier la souris conformément aux directives institutionnelles et aux législations nationales et intergouvernementales respectives.
      REMARQUE : Pour ce protocole, les souris ont été euthanasiées par exposition au CO₂, car la luxation cervicale peut entraîner une instabilité de la tête, ce qui entraîne des difficultés lors du prélèvement d’organes.
   2. Posez la souris sur le dos et fixez-la en épinglant les pattes à une sous-couche appropriée.
   3. Désinfectez la souris en la vaporisant avec 70 % d’EtOH jusqu’à ce qu’elle soit complètement mouillée.
   4. Coupez la peau avec des ciseaux, d’abord verticalement le long de la trachée du sternum à la lèvre, puis horizontalement de la trachée vers la clavicule des deux côtés. Chaque incision mesure environ 2 cm de long.
   5. Écartez la fourrure pour découvrir la mâchoire.
   6. Coupez à travers les muscles de la mâchoire jusqu’à l’arrière de la cavité buccale.
   7. Ouvrez la cavité buccale aussi loin que possible en tirant la mâchoire inférieure et la mâchoire supérieure dans des directions opposées à l’aide de deux pinces, ce qui entraîne la luxation de la mâchoire inférieure.
   8. Utilisez une pince émoussée pour saisir la langue et retirez autant de langue que possible en coupant verticalement dans le dos.
   9. Placez la langue dans du PBS froid exempt de Mg²⁺ et de Ca²⁺ (PBSO).
   10. Coupez la langue horizontalement pour séparer la muqueuse de la langue dorsale et ventrale.
       REMARQUE : La muqueuse dorsale de la langue est la partie supérieure de la langue et la langue ventrale est la partie inférieure de la langue qui est en contact avec le plancher buccal. Les deux muqueuses peuvent être distinguées par leur morphologie, car la muqueuse de la langue dorsale est visiblement rugueuse, tandis que la muqueuse ventrale de la langue a une surface lisse. La langue ventrale couvre une zone plus petite que la langue dorsale (~ 5 x 2 mm de langue ventrale ; ~ 8 x 3 mm de langue dorsale).
   11. Facultatif : Fixez une partie de la langue dans un milieu fixateur (par exemple 4 % de paraformaldéhyde) ou dans un milieu à température de coupe optimale (OCT) pour la cryoconservation.
   12. En option : congélation instantanée des fragments pour l’isolement de l’ARN ou des protéines à -80 °C.
2. Digestion pour la séparation de l’épithélium et de la lamina propria
   1. Préparer un cocktail enzymatique frais contenant 1 mg/mL de collagénase A et 2 mg/mL de dispase II dans du PBSO et une solution de réchauffement à 37 °C avant utilisation.
   2. Injecter au moins 500 μL du cocktail enzymatique dans l’espace sous-épithélial à partir de l’extrémité coupée postérieure de la langue à l’aide d’une aiguille de 26 G.
   3. Insérez l’aiguille profondément dans le tissu, perforant la lamina propria et le muscle sous-jacent, en restant soigneusement parallèle à l’épithélium.
   4. Injectez le cocktail tout en rétractant lentement l’aiguille.
      REMARQUE : Un éclaircissement de la couleur et une expansion visible du tissu de la langue confirment une injection suffisante des enzymes de digestion. De plus, l’induction d’une phase transparente sous l’épithélium indique une injection correcte.
   5. Répétez l’injection jusqu’à cinq fois.
   6. Transférez le tissu dans un tube de microcentrifugation de 2 ml contenant le même cocktail enzymatique.
   7. Incuber l’échantillon pendant 1 h à 37 °C sur un agitateur (à 300 tr/min).
   8. Transférez le tissu dans une boîte de Pétri contenant du PBSO.
   9. Saisissez le muscle et le bout de la langue à l’aide d’une pince à épiler et retirez délicatement le muscle de l’épithélium. Si une résistance est rencontrée, probablement à l’extrémité postérieure de la coupe, soulevez l’épithélium avec une pince à épiler émoussée.
   10. Lavez l’épithélium séparé avec du PBSO et procédez à l’application souhaitée. Pour l’établissement des organoïdes, passer à l’étape 1.3.1 et pour les préparations de tissus entiers, passer à l’étape 4.1.1.
3. Etablissement d’organoïdes de la muqueuse buccale murine à partir de tissu primaire
   1. Coupez l’épithélium en petits morceaux d’environ 2 x 2 mm.
   2. Digérer le tissu dans 1 mL de trypsine à 0,125 % ajoutée à du PBSO à 37 °C.
      REMARQUE : La digestion ne doit pas dépasser 30 min.
   3. Vérifiez régulièrement la digestion en secouant toutes les 10 min.
   4. Lorsque le mélange devient trouble (en fonction de la quantité de tissu) ou lorsqu’un mélange d’amas de cellules est observé, prolonger la perturbation en tourbillonnant pendant 5 secondes et en pipetant de haut en bas 10 à 20 fois.
   5. Lavez une fois en complétant avec 10 ml de milieu Advanced DMEM/F12+++.
   6. Filtrez directement la suspension cellulaire à l’aide d’une crépine de 70 μm.
   7. Centrifugeuse à 350 x g pendant 5 min à 4 °C.
   8. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu Advanced DMEM/F12+++ pour le comptage.
   9. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Neubauer ou d’une méthode équivalente.
   10. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et aspirer le surnageant.
   11. Remettez le granulé en suspension dans le BME (gardez le BME sur de la glace pour éviter la solidification). Calculez la quantité de BME, en fonction du nombre de cellules (environ 10 000 cellules/40 μL de BME). Si le milieu ne peut pas être aspiré complètement, retirez soigneusement le reste à l’aide d’une pipette de 100 μL.
       REMARQUE : La concentration de BME ne doit pas être inférieure à 70 %, car cela peut entraîner une solidification insuffisante.
   12. Plaquez les cellules au fond de plaques de culture cellulaire préchauffées (suspension) en gouttelettes de 10 μL à l’aide d’une pipette P100.
   13. Placez la plaque de culture à l’envers dans l’incubateur pendant 30 min-1 h pour laisser le BME se solidifier.
   14. Préparez la quantité requise de milieu organoïde de la muqueuse buccale murine, en ajoutant fraîchement l’inhibiteur de ROCK et le Primocin (voir les tableaux des matériaux et le tableau 1).
   15. Après solidification, ajoutez le milieu préchauffé aux gouttelettes de la cellule en pipetant soigneusement contre la paroi des puits pour éviter le détachement des gouttelettes.
   16. Incuber les plaques dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂.
   17. Changez de milieu tous les 2-3 jours. L’inhibiteur de ROCK et Primocin restent dans le milieu de culture pour les deux premiers passages.

2 Passage, cryoconservation et décongélation d’organoïdes murins de la muqueuse buccale

1. Passage de cultures d’organoïdes murins de la muqueuse buccale
   1. Les organoïdes murins de la muqueuse buccale peuvent être passés pour la première fois entre 10 et 12 jours après le placage initial.
   2. Pour la fendillation, remettre en suspension les gouttelettes BME dans le milieu à l’aide d’une pipette P1000 et les transférer dans un tube conique de 15 mL contenant 2 mL de PBSO glacé.
   3. Complétez le volume avec 5 ml de DMEM avancé / F12+++ moyen glacé.
   4. Centrifuger les organoïdes à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
   5. Aspirer le surnageant et digérer les organoïdes en utilisant 0,125 % de trypsine dans le PBSO.
   6. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de solution de trypsine à 0,125 % et incuber la suspension à 37 °C jusqu’à ce que les organoïdes se brisent en morceaux. Vérifiez la digestion toutes les 2 min.
   7. Remettez complètement la suspension cellulaire en pipetant de haut en bas 20 à 30 fois à l’aide d’une pipette P1000 et répétez la remise en suspension brutale avec une pipette P200.
   8. Lavez les cellules avec 10 mL de milieu Advanced DMEM/F12+++.
   9. En option : Filtrer directement la suspension cellulaire à l’aide d’une crépine cellulaire de 70 μm pour générer une suspension cellulaire homogène.
   10. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 x g pendant 5 min à 4 °C.
   11. Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans l’EMB et procéder avec les organoïdes comme décrit aux étapes 1.3.8 à 1.3.17.
2. Cryoconservation et décongélation de cultures d’organoïdes murins de la muqueuse buccale
   1. Pour la cryoconservation, laissez les organoïdes murins de la muqueuse buccale se développer pendant 3 à 5 jours après le passage.
   2. Détacher les organoïdes des plaques de culture comme décrit aux étapes 2.1.2 à 2.1.4.
   3. Après la centrifugation, remettre les organoïdes en suspension dans 1 mL de milieu de congélation (milieu Advanced DMEM/F12+++ contenant 10 % de FCS et 10 % de DMSO) et transférer la suspension cellulaire dans des flacons cryogéniques de 2 mL.
   4. Placez les cellules dans les récipients de congélation souhaités à -80 °C pendant 24 h maximum. Pour un stockage à long terme, maintenez les cellules en dessous de -120 °C, par exemple dans un réservoir d’azote liquide.
   5. Décongelez les cellules cryoconservées à 37 °C et transférez rapidement la suspension cellulaire dans un tube conique contenant 9 ml de milieu Advanced DMEM/F12+++ préchauffé.
   6. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 x g et 4 °C pendant 5 min.
   7. Jeter le surnageant et procéder avec les organoïdes comme décrit aux étapes 1.3.8 à 1.3.17.

3 Analyse de l’expression génique du tissu de la muqueuse buccale murine et des organoïdes

1. Extraction d’ARN à partir d’organoïdes murins de la muqueuse buccale et de tissus natifs
   1. Prélever les organoïdes murins de la muqueuse buccale comme décrit aux étapes 2.1.2 à 2.1.4.
   2. Jetez le surnageant et lavez les organoïdes dans du PBSO froid.
   3. Centrifuger les organoïdes à 300 x g et 4 °C pendant 5 min et jeter le surnageant.
   4. Pour isoler l’ARN du tissu natif, utilisez l’épithélium séparé (voir étape 1.2.10).
   5. Coupez le tissu en petits morceaux de 2 mm x 2 mm.
   6. Pour l’isolement de l’ARN, utilisez une méthode ou un kit établi : remettre en suspension des organoïdes ou des morceaux de tissu dans, respectivement, un tampon de lyse de 350 ou 700 μL.
   7. Lyse brusquement les organoïdes par vortex pendant au moins 10 s et lyse le tissu pendant au moins 30 s.
   8. Placez la solution à -80 °C pendant au moins 2 h.
   9. Décongelez le lysat cellulaire sur de la glace et procédez à l’isolement de l’ARN selon les instructions du fabricant.
2. Synthèse de l’ADNc par réaction de transcription inverse
   1. Mesurez la concentration d’ARN et calculez le volume pour une entrée totale d’ARN de 0,1 à 1 μg.
   2. Pour la synthèse de l’ADNc, utilisez un kit de synthèse d’ADNc en suivant les instructions du fabricant. Pour cette expérience, la formulation suivante a été utilisée : 4 μL de mélange réactionnel 5x, 1 μL de transcriptase inverse, x μL de 0,1-1 μg d’ARN total et x μL d’eau sans nucléase jusqu’à 20 μL du volume final.
   3. Effectuez la transcription inverse dans un programme cyclique en trois étapes avec le programme suivant : 25 °C pendant 5 min, 42 °C pendant 30 min et 85 °C pendant 5 min.
   4. Stockez l’ADNc à -20 °C.
3. Analyse de l’expression génique par PCR quantitative en temps réel
   1. Pour la PCR quantitative en temps réel, réalisez toutes les réactions en duplicatas techniques.
   2. Préparez un mélange de 5 μL de qPCR Supermix, 1 μL d’amorce inverse (400 nM), 1 μL d’amorce directe (400 nM), 1 μL d’ADNc (10-20 ng/puits) et 2 μL d’eau exempte de nucléases.
   3. Pour l’amplification, utilisez les réglages standard comme suit : activation de la polymérase et dénaturation de l’ADN à 95 °C pendant 30 s, dénaturation à 95 °C pendant 5 à 10 s, recuit/extension et lecture de la plaque à 60 °C pendant 60 s pendant 40 cycles. Effectuez une analyse de la courbe de fusion à 65-95 °C avec des incréments de 0,5 °C à 2-5 s/pas (ou utilisez les paramètres par défaut de l’instrument).
   4. Analysez les données à l’aide des méthodes souhaitées telles que les méthodes ΔCt ou ΔΔCt⁵⁶ ou à l’aide d’un logiciel d’analyse fourni par le fabricant du thermocycleur en suivant les instructions données.

4 Analyse de l’expression protéique du tissu de la muqueuse buccale murine et des organoïdes

REMARQUE : La coloration complète de l’épithélium de la langue a été réalisée dans une plaque à 24 puits, en transférant le tissu avec une pince de puits à puits à chaque étape.

1. Fixation de tissus murins de la muqueuse buccale et de cultures d’organoïdes
   1. Pour la coloration tissulaire entière, passez à l’étape 1.2.10 et passez à l’étape 4.1.5.
   2. Pour la coloration des organoïdes, prélever les organoïdes comme décrit à l’étape 2.1.2 et passer à l’étape 4.1.3.
   3. Complétez la suspension cellulaire avec 10 mL de PBSO.
   4. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
   5. Fixer l’épithélium ou les organoïdes dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min à température ambiante (21 °C).
   6. Lavez les échantillons une fois dans PBSO. Centrifuger les organoïdes à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
2. Coloration intégrale de tissus murins de la muqueuse buccale et de cultures d’organoïdes
   1. Démasquez les épitopes en incubant les échantillons dans une solution de Triton X-100 à 0,2 % pendant 20 min à température ambiante.
   2. Transvaser les échantillons dans la solution bloquante (sérum d’ânesse à 5 % dans du PBSO) et incuber pendant 1 h à température ambiante.
   3. Diluez les anticorps dans une solution bloquante et incubez les échantillons dans une solution d’anticorps pendant une nuit à 4 °C.
   4. Lavez les cellules ou les tissus trois fois (5 min chacune) avec un tampon de lavage contenant 0,1 % de Tween-20 et 1 % de PBSO dans ddH2O.
   5. Diluer les anticorps secondaires 1:400 dans du PBSO.
   6. Incuber les échantillons dans une solution secondaire d’anticorps pendant 3 h à température ambiante.
   7. Répétez l’étape de lavage 4.2.4. Pour les échantillons de tissus, passez à l’étape 4.2.8. Pour les échantillons d’organoïdes, passez à l’étape 4.2.9.
   8. Placez l’épithélium sur une lame avec la face basale (côté qui était attaché à la lamina propria) vers le haut. Montez l’épithélium dans un monteur aqueux avec du DAPI et une lamelle. Passez à l’étape 4.2.11.
   9. Pour les échantillons d’organoïdes, remettre en suspension les organoïdes colorés dans une matrice de gel appropriée qui se solidifie à température ambiante.
   10. Pipetez rapidement les gouttelettes dans une plaque inférieure en verre de 96 puits (5 μL/puits). Placez la plaque sur de la glace et laissez la matrice de gel se solidifier pendant 15 min. Montez les organoïdes dans un monteur aqueux avec du DAPI en ajoutant 100 μL par puits.
   11. Conservez les échantillons colorés à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à l’analyse de l’image.

Ce protocole décrit la séparation de l’épithélium de la langue de la lamina propria et du muscle sous-jacents à l’aide d’un cocktail enzymatique (Figure 1). L’épithélium séparé peut en outre être utilisé pour la génération d’organoïdes ainsi que pour la récolte pour différents types d’analyses de gènes et de protéines. De même, la couche digérée de lamina propria et de muscle peut être utilisée pour les procédures de choix...

Digestion tissulaire
La digestion de la collagénase aide à séparer l’épithélium de la lamina propria et du tissu musculaire sous-jacents. Cette étape permet une meilleure comparaison du tissu primaire avec les organoïdes de la muqueuse buccale générés par la suite. Comme la surdigestion avec des enzymes a un impact sur la capacité de formation d’organoïdes des cellules souches épithéliales adultes, nous conseillons d’effectuer l’incubation de la ...

K.K. est nommé l’inventeur sur un brevet en instance qui est lié à la technologie des organoïdes.

Les auteurs tiennent à remercier Sabine Kranz pour son aide. Nous tenons à remercier l’unité centrale de microscopie confocale et de tri cellulaire basé sur la cytométrie en flux de l’IZKFWürzburgpour son soutien à cette étude. Ce travail a été financé par une subvention de l’Aide allemande contre le cancer (via IZKF/MSNZ Würzburg à K.K.).