11.17 : Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi: Giriş

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), eskiden yüksek basınçlı sıvı kromatografisi olarak adlandırılan, karmaşık karışımlardaki bileşenleri ayırmak, tanımlamak ve miktarlarını belirlemek için kullanılan güçlü bir tekniktir. "Yüksek basınç" terimi, sıvı hareketli fazı sıkı bir şekilde doldurulmuş kolonlardan geçirmek için uygulanan yüksek basınca atıfta bulunur.

HPLC'de, iki faz ayırma sürecinde kritik bir rol oynar:

• Hareketli Faz: Bu, sistemi boyunca akan ve örneği beraberinde taşıyan sıvı çözücüdür. Çözücü, analitlerle ve sabit fazla etkileşimi optimize etmek amacıyla polaritesine göre seçilir. "Polarite endeksi", ayrılma için uygun çözücüyü seçmede bir rehber olarak kullanılır.
• Sabit Faz: Sabit faz, genellikle silika bazlı olan, kolona yerleştirilmiş katı bir materyaldir. Ters faz HPLC'de, sabit faz genellikle derivatize edilmiş silika olup, örneğin oktadesil (C18) silikadır. Paketlenmiş materyalin küçük parçacık boyutu, yüksek bir yüzey alanı oluşturarak analitlerle etkileşimleri artırır. Tepkimeye girmemiş silanol gruplarıyla gibi istenmeyen etkileşimleri azaltmak amacıyla, sabit faz genellikle trimetilklorosilan gibi reaktiflerle uç kaplamalıdır.

Ayrılma, analitler kimyasal özelliklerine bağlı olarak hem hareketli hem de sabit fazlarla farklı şekilde etkileşime girdiğinde meydana gelir ve bu da kolon boyunca farklı göçlere yol açar.

Bazen, çözünmüş madde molekülleri sabit faza geri dönüşümsüz olarak bağlanarak analitik kolonu tıkayabilir ve performansını düşürebilir. Bunu önlemek için, analitik kolonun önüne bir koruma kolonu yerleştirilir. Ayrıca, hareketli faz rezervuarı ile enjektör arasında bir önkolon olan "scavenger, süpürücü" kolonu da yerleştirilebilir. Bu, çözücünün analitik kolona, scavenger kolonundan zaten silika ile doymuş olan şekilde girmesini sağlar, istenmeyen reaksiyonları engeller ve analitik kolonun ömrünü uzatır.

Ayrımdan sonra, analitler bileşiklerin özelliklerine bağlı olarak çeşitli dedektörler tarafından tespit edilir. Sonuçlar, karışımın farklı bileşenlerine karşılık gelen pik noktalarıyla kromatogramlar olarak görselleştirilir. Bu, numune hakkında hem kantitatif hem de kalitatif veriler sağlar.