11.17 : Cromatografia liquida ad alte prestazioni: introduzione

La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), precedentemente nota come cromatografia liquida ad alta pressione, è una tecnica potente che viene usata per separare, identificare e quantificare i componenti in miscele complesse. Il termine "alta pressione" si riferisce all'uso dell’alta pressione per spingere la fase mobile liquida attraverso le colonne strettamente impaccate.

Nell’HPLC, due fasi svolgono un ruolo critico nel processo di separazione:

• Fase mobile: si tratta di un solvente liquido che scorre attraverso il sistema, trasportando con sé il campione. Il solvente viene scelto in base alla sua polarità per ottimizzare l'interazione con gli analiti e la fase stazionaria. “L’indice di polarità" fa da guida per la selezione del solvente adatto per la separazione.
• Fase stazionaria: la fase stazionaria è un materiale solido, spesso a base di silice, impaccato all'interno della colonna. Nell’HPLC a fase inversa, la fase stazionaria, di solito, è silice derivatizzata, come il silice ottadecilica (C18). Le piccole dimensioni delle particelle del materiale confezionato creano un'elevata area superficiale, migliorando le interazioni con gli analiti. Per ridurre le interazioni indesiderate, come quelle con gruppi silanolici non reagenti, la fase stazionaria è spesso chiusa all'estremità con reagenti come il trimetilclorosilano

La separazione avviene quando gli analiti interagiscono in modo diverso con la fase mobile e con quella stazionaria, a seconda delle loro proprietà chimiche, questo porta a una migrazione differenziale attraverso la colonna.

A volte, le molecole di soluto si legano in modo irreversibile alla fase stazionaria, intasando la colonna analitica e riducendone le prestazioni. Per evitare ciò, una colonna di protezione viene posizionata prima della colonna analitica. Una precolonna, chiamata colonna scavenger, può anche essere posizionata tra il serbatoio della fase mobile e l'iniettore. Questo garantisce che il solvente entri nella colonna analitica, che è già satura di silice dalla colonna scavenger, prevenendo la comparsa di reazioni indesiderate e prolungando la durata della colonna analitica.

Dopo la separazione, gli analiti vengono rilevati dai vari rilevatori, a seconda delle caratteristiche dei composti. I risultati sono visualizzati come cromatogrammi, con dei picchi corrispondenti ai diversi componenti della miscela. Questo fornisce dei dati sia qualitativi che quantitativi sul campione.