11.17 : Wysokosprawna chromatografia cieczowa: Wprowadzenie

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), dawniej nazywana wysokociśnieniową chromatografią cieczową, to potężna technika stosowana do rozdzielania, identyfikowania i ilościowego określania składników w złożonych mieszaninach. Termin „wysokie ciśnienie” odnosi się do stosowania wysokiego ciśnienia w celu przepchnięcia ciekłej fazy ruchomej przez ściśle upakowane kolumny. I

W HPLC dwie fazy odgrywają kluczową rolę w procesie rozdzielania:

• Faza ruchoma: Jest to ciekły rozpuszczalnik, który przepływa przez układ, niosąc ze sobą próbkę. Rozpuszczalnik jest wybierany na podstawie jego polarności w celu zoptymalizowania interakcji z analitami i fazą stacjonarną. „Wskaźnik polarności” służy jako wskazówka przy wyborze odpowiedniego rozpuszczalnika do rozdzielania.
• Faza stacjonarna: Faza stacjonarna to stały materiał, często na bazie krzemionki, upakowany w kolumnie. W HPLC z odwróconą fazą fazą stacjonarną jest zazwyczaj derywatyzowana krzemionka, taka jak krzemionka oktadecylowa (C18). Mały rozmiar cząstek materiału pakowanego tworzy dużą powierzchnię, wzmacniając interakcje z analitami. Aby zmniejszyć niepożądane interakcje, takie jak te z niereagującymi grupami silanolowymi, faza stacjonarna jest często zamykana odczynnikami, takimi jak trimetylochlorosilan

Separacja następuje, gdy anality oddziałują w różny sposób zarówno z fazą ruchomą, jak i stacjonarną, w zależności od ich właściwości chemicznych, co prowadzi do różnicowej migracji przez kolumnę.

Czasami cząsteczki substancji rozpuszczonej wiążą się nieodwracalnie z fazą stacjonarną, zatykając kolumnę analityczną i zmniejszając jej wydajność. Aby temu zapobiec, przed kolumną analityczną umieszczana jest kolumna ochronna. Kolumna wstępna zwana kolumną zbierającą może być również umieszczona między zbiornikiem fazy ruchomej a wtryskiwaczem. Zapewnia to, że rozpuszczalnik dostaje się do kolumny analitycznej, która jest już nasycona krzemionką z kolumny zbierającej, zapobiegając niepożądanym reakcjom i wydłużając żywotność kolumny analitycznej.

Po separacji anality są wykrywane przez różne detektory, w zależności od charakterystyki związków. Wyniki są wizualizowane jako chromatogramy, przy czym szczyty odpowiadają różnym składnikom mieszaniny. Zapewnia to zarówno jakościowe, jak i ilościowe dane o próbce.