11.17 : כרומטוגרפיה נוזלית בביצוע גבוה (HPLC): מבוא

כרומטוגרפיה נוזלית בביצוע גבוה (HPLC), אשר בעבר נקראה כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה, היא טכניקה עוצמתית המשמשת להפרדה, זיהוי וכימות רכיבים בתערובות מורכבות. המונח "לחץ גבוה" מתייחס לשימוש בלחץ גבוה לדחיפת פאזה נוזלית ניידת דרך עמודות ארוזות בצפיפות.

ב-HPLC, שתי פאזות ממלאות תפקיד מרכזי בתהליך ההפרדה:

• פאזה ניידת: זהו ממס נוזלי הזורם דרך המערכת ונושא את הדגימה עמו. הממס נבחר בהתבסס על הקוטביות שלו, על מנת לייעל את האינטראקציה עם האנליטים והפאזה הקבועה. "אינדקס הקוטביות" משמש כמדריך לבחירת הממס המתאים להפרדה.
• פאזה קבועה: הפאזה הקבועה היא חומר מוצק, לעיתים קרובות מבוסס סיליקה, הנארז בתוך העמודה. ב-HPLC בשלב הפוך, הפאזה הקבועה היא בדרך כלל סיליקה מתוקנת, כמו סיליקה אוקטדסיל (C18). גודל החלקיקים הקטן של החומר הארוז יוצר שטח פנים גבוה, שמגביר את האינטראקציות עם האנליטים. על מנת להפחית אינטראקציות לא רצויות, כמו אלו עם קבוצות סילנול שלא עברו ריאקציה, הפאזה הקבועה עוברת לעיתים קרובות "כיפוי" (end-capping) עם תגובות כמו טרימתילכלורוסילן.

ההפרדה מתרחשת כאשר האנליטים מקיימים אינטראקציות שונות עם הפאזה הניידת והפאזה הקבועה, בהתאם לתכונות הכימיות שלהם, מה שמוביל לנדידה שונה דרך העמודה.

לעיתים, מולקולות המסיסות נקשרות באופן בלתי הפיך לפאזה הקבועה, מה שגורם לסתימת העמודה האנליטית ולהפחתת ביצועיה. כדי למנוע זאת, עמודת שמירה ממוקמת לפני העמודה האנליטית. עמודת מקדימה הנקראת "עמודת ניקוי" עשויה גם להיות ממוקמת בין מיכל הפאזה הניידת לבין המזרק. זה מבטיח שהממס הנכנס לעמודה האנליטית כבר רווי בסיליקה מהעמודה המקדימה, מונע תגובות לא רצויות ומאריך את חיי העמודה האנליטית.

לאחר ההפרדה, האנליטים מזוהים על ידי גלאים שונים, בהתאם לתכונות התרכובות. התוצאות מוצגות ככרומטוגרמות, שבהן פסגות מייצגות את רכיבי התערובת השונים. כך מתקבלים נתונים איכותיים וכמותיים על הדגימה.