Наши исследования сосредоточены на наших рукавах для расширения кишечника и рукавах для расширения влагалища, которые обеспечивают отвлекающую силу, которая, как было доказано, значительно удлиняет кишечные и вагинальные каналы. Мы надеемся оптимизировать наши устройства с добавлением терапевтических средств на основе белков, чтобы свести к минимуму местное воспаление и фиброз после развертывания этих устройств. Связывая эти терапевтические агенты непосредственно с нашими устройствами, мы можем избежать необходимости системного введения, непосредственно нацеленного на наши области интересов с помощью локализованной дозы.
Такая локализация позволит снизить дозировку препарата, снизить риск системных побочных эффектов, а также снизить стоимость лечения. В будущем мы хотим определить скорость высвобождения этих белковых терапевтических средств, которые связаны с нашими устройствами с покрытием PVA, что будет необходимо для определения дозировок лекарств для различных типов лечения. Для начала приготовьте 5% раствор поливинилового спирта или ПВА, добавив пять граммов ПВА в 100 миллилитров деионизированной воды.
Перемешайте смесь на горячей плите, чтобы она растворилась. Далее приготовьте один миллиграмм на миллилитр раствора глюкагоноподобного пептида 2 или ГПП-2, добавив один миллиграмм ГПП-2 в один миллилитр деионизированной воды. Предварительно сожмите рукава для расширения кишечника и рукава для расширения влагалища над стеклянной пипеткой, стабилизируя концы с помощью обрезанных пластиковых пипеток, плотно прилегающих к стеклянной пипетке и рукавам.
Покрасьте предварительно свернувшиеся рукава 5%-ным раствором ПВА с помощью маленькой кисти. Дайте рукавам высохнуть при комнатной температуре в течение 10 минут между каждым слоем. Как только пятый слой высохнет, поместите предварительно стянутые рукава в влагопоглотитель под химический защитный капюшон.
Добавьте три миллилитра 25% глутаральдегида и три миллилитра 94-98% серной кислоты в отдельные открытые стаканы в эксикаторе, чтобы обеспечить реакцию пара и сшить мембраны ПВА на рукавах. После сшивания в течение 48 часов извлеките рукава из камеры и дайте глутаральдегиду испариться в течение 15 минут. Нанесите пипеткой 50 микролитров раствора GLP-2 на каждую сшитую гильзу для последующего использования.
Чтобы сделать стандартную кривую ГПП-2 связанной с ПВА, пипеткой 50 микролитров 5% ПВА на дно 18 лунок 24-луночного планшета. Оставьте шесть лунок пустыми для удержания рукавов расширения кишечника и рукавов расширения влагалища с тремя лунками для каждого типа устройств. Дайте слою ПВА высохнуть в течение ночи в духовке при температуре 120 градусов Цельсия.
На следующий день поместите планшет на 24 лунки в десикацию под химическим защитным колпаком. Добавьте три миллилитра 25% глутаральдегида и три миллилитра 94-98% серной кислоты в отдельные открытые стаканы внутри эксикатора, чтобы обеспечить реакцию пара и сшить мембраны ПВС на 24-луночной пластине. После 48 часов сшивания снимите 24-луночную пластину с эксикатора и дайте глутаральдегиду испариться в течение 15 минут.
Затем создайте градиент концентрации, добавив 250, 150, 25 и ноль микролитров одного миллиграмма на миллилитр раствора GLP-2 в соответствующие меченые лунки. Затем поместите покрытые лекарством рукава для расширения кишечника и влагалища в соответствующие лунки. После добавления в лунки соответствующих концентраций GLP-2 и покрытых лекарственным средством рукавов для расширения кишечника и вагинальных рукавов охладите 24-луночный планшет на ночь при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы обеспечить связывание препарата.
На следующий день добавьте в каждую лунку по два миллилитра одного миллиграмм на миллилитр сухого молока в растворе для блокировки деионизированной воды на один час. После блокировки промойте каждую лунку три раза PBS в течение пяти минут за промывку. Приготовьте раствор антитела кролика против ГПП-2, добавив 40 микролитров антитела кролика против ГПП-2 в 50 миллилитров деионизированной воды.
Затем добавьте по два миллилитра раствора антитела в каждую лунку пластины. Охладите тарелку на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день промойте каждую лунку три раза PBS по пять минут за промывку.
Приготовьте раствор вторичного антитела к щелочной фосфатазе IgG против кролика, добавив 20 миллилитров антитела в 40 миллилитров деионизированной воды. Добавьте по два миллилитра раствора вторичного антитела в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение двух часов. После промывки лунок PBS добавьте в каждую лунку по два миллилитра щелочной фосфатазы синей микролунки и выдержите 20 минут.
Во время инкубации следите за реакцией, так как цвет раствора меняется с желтого на синий. Остановите реакцию, пипетируя по 200 микролитров раствора из каждой лунки в маркированный планшет на 96 лунок. Считывание показаний 96-луночного планшета с помощью абсорбционного микропланшетного ридера на длине волны 620 нанометров.
Постройте стандартную кривую и рассчитайте концентрацию GLP-2 на гильзах с покрытием PVA. Концентрация GLP-2 в рукавах расширения кишечника и рукавах расширения влагалища в среднем составляет 22,69 микрограмма на квадратный сантиметр, аналогична концентрации в 50 микрограммовых лунках на 24-луночном планшете с 23,7 микрограммами на квадратный сантиметр.
