ポリビニルアルコール被覆医療機器への治療薬の結合の検証

私たちの研究は、腸拡張スリーブと膣拡張スリーブを中心に行われており、どちらも腸管と膣管を大幅に延長することが示されています。私たちは、タンパク質ベースの治療薬を追加することでデバイスを最適化し、これらのデバイスの展開後の局所的な炎症と線維化を最小限に抑えたいと考えています。これらの治療薬をデバイスに直接結合させることで、関心のある領域を直接標的とした局所的な用量で全身投与する必要性を回避することができます。

このローカリゼーションにより、薬物投与量を減らすことができ、全身性の副作用のリスクを減らし、治療コストも削減できます。将来的には、PVAコーティングされたデバイスに結合したこれらのタンパク質ベースの治療薬の放出速度を決定したいと考えています。これは、さまざまな種類の治療薬の薬物投与量を決定するために必要になります。まず、5ミリリットルの脱イオン水に5グラムのPVAを加えて、5%ポリビニルアルコールまたはPVA溶液を準備します。

混合物をホットプレート上で攪拌して、溶解を助けます。次に、1ミリグラムのGLP-2を1ミリリットルの脱イオン水に加えることにより、グルカゴン様ペプチド2またはGLP-2溶液の1ミリリットルあたり1ミリグラムを調製します。ガラスピペットで腸拡張スリーブと膣拡張スリーブを事前に収縮させ、ガラスピペットとスリーブの周りにしっかりと取り付けられたカットプラスチックピペットで端を安定させます。

小さな絵筆を使用して、事前に契約したスリーブを5%PVA溶液で塗装します。各コートの間にスリーブを室温で10分間乾かします。5回目のコートが乾いたら、事前に契約したスリーブを化学安全フードの下の乾燥剤に入れます。

3ミリリットルの25%グルタルアルデヒドと3ミリリットルの94〜98%硫酸をデシケーター内の別々のオープンビーカーに追加して、蒸気反応を可能にし、PVAメンブレンをスリーブに架橋します。48時間架橋した後、スリーブをチャンバーから取り外し、グルタルアルデヒドを15分間蒸発させます。50マイクロリットルのGLP-2溶液を各架橋スリーブにピペットで貼り付け、後で使用します。

GLP-2の標準曲線をPVAに結合させるには、50マイクロリットルの5%PVAを24ウェルプレートの18ウェルの底にピペットで移します。腸拡張スリーブと膣拡張スリーブを保持するために、デバイスの種類ごとに3つのウェルを備えた6つのウェルを空白のままにします。PVA層を摂氏120度のオーブンで一晩乾燥させます。

翌日、24ウェルプレートを化学安全フードの下の乾燥剤に入れます。3ミリリットルの25%グルタルアルデヒドと3ミリリットルの94〜98%硫酸をデシケーター内の別々のオープンビーカーに追加して、蒸気反応を可能にし、PVAメンブレンを24ウェルプレートに架橋します。架橋を48時間行いた後、デシケーターから24ウェルプレートを取り外し、グルタルアルデヒドを15分間蒸発させます。

次に、250、150、25、および0マイクロリットルの1ミリグラム/ミリリットルのGLP-2溶液をそれぞれの標識ウェルに追加して、濃度勾配を作成します。次に、薬剤でコーティングされた腸と膣の拡張スリーブをそれぞれのウェルに入れます。それぞれのGLP-2濃度と薬剤でコーティングされた腸管拡張スリーブと膣拡張スリーブをウェルに追加した後、24ウェルプレートを摂氏4度で一晩冷蔵して薬物結合を可能にします。

翌日、粉乳1ミリリットルあたり1ミリグラムを脱イオン水ブロッキング溶液に2ミリリットルを各ウェルに1時間加えます。ブロッキング後、各ウェルをPBSで3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。50ミリリットルの脱イオン水に40マイクロリットルのウサギ抗GLP-2抗体を加えて、ウサギ抗GLP-2抗体溶液を調製します。

次に、2ミリリットルの抗体溶液をプレートの各ウェルに加えます。プレートを摂氏4度で一晩冷蔵します。翌日、各ウェルをPBSで3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。

40ミリリットルの脱イオン水に20ミリリットルの抗体を添加することにより、抗ウサギIgGアルカリホスファターゼ二次抗体溶液を調製します。2ミリリットルの二次抗体溶液を各ウェルに加え、室温で2時間インキュベートします。PBSでウェルを洗浄した後、各ウェルに2ミリリットルのアルカリホスファターゼブルーマイクロウェル基質を加え、20分間インキュベートします。

インキュベーション中は、溶液の色が黄色から青色に変わる反応を観察します。各ウェルから200マイクロリットルの溶液を標識された96ウェルプレートにピペットで移し、反応を停止します。吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、波長620ナノメートルの96ウェルプレートを読み取ります。

標準曲線を作成し、PVAコーティングされたスリーブ上のGLP-2の濃度を計算します。腸拡張スリーブおよび膣拡張スリーブ装置のGLP-2濃度は、平均22.69マイクログラム/平方センチメートルであり、24ウェルプレート上の50マイクログラムウェルの濃度が23.7マイクログラム/平方センチメートルと同程度である。